交流伏安法快速檢測生活飲用水中卡那霉素殘留量

韓賢達(dá) 俞志剛* 吳 垚 江 歡,羅 芳 向陽可佳 周偲燦 羅亞蘭

(1.無機(jī)特種功能材料重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院重慶涪陵 408100；2.哈爾濱理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院黑龍江哈爾濱 150040)

作為一種氨基糖苷類抗生素，卡那霉素(Kanamycin,Kan)常被用作獸藥在畜牧業(yè)中使用[1]，因合成廢液的不合理排放等因素，可導(dǎo)致河流、地下水，甚至生活飲用水中存在一定藥物殘留[2]。經(jīng)常飲用Kan超標(biāo)的水會對人體產(chǎn)生毒害作用，如腎損傷、過敏反應(yīng)和耐藥性等[3-5]。近年來，生活飲用水中抗生素超標(biāo)事件時有發(fā)生，嚴(yán)重威脅到人們安全，因此，開發(fā)新型檢測技術(shù)具有迫切性和必要性。

隨著適配體篩選技術(shù)的快速發(fā)展，電化學(xué)適配體傳感技術(shù)正成為新型檢測技術(shù)的前沿研究熱點(diǎn)之一[6-8]。相比于其他傳統(tǒng)檢測技術(shù)，電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建和操作簡單、檢測成本低、易于微型化以及可實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展的重要方向之一[9-11]。目前，盡管Kan適配體傳感器已得到一些研究，但大部分需要借助酶催化或納米材料的擴(kuò)增以提高其靈敏度，方法存在檢測條件苛刻、不穩(wěn)定和傳感時間慢的共性缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用化[12-15]。本文采用亞甲基藍(lán)(MB)的DNA標(biāo)記技術(shù)，以Kan適配體為分子識別探針，使用電化學(xué)交流伏安法(ACV)為信號輸出手段，構(gòu)建了一種無酶和無納米材料修飾的傳感方法，可以實(shí)現(xiàn)對生活飲用水中Kan殘留的綠色化學(xué)檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

所有電化學(xué)檢測均在CHI1040C型多通道恒電位儀(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行。測試采用三電極系統(tǒng)：以制備的電極為工作電極，Ag/AgCl (3.0 mol/L KCl)電極為參比電極，鉑絲為對電極。交流伏安法電勢范圍：0～0.5 V，振幅:25 mV，頻率范圍：1～300 Hz；循環(huán)伏安法電勢范圍：0～0.5 V，掃描速率范圍:0.01～100 V/s。

適配體探針(CSP-MB)：5′-MB-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAGTCAC-(CH2)6-SH-3′購自生工生物工程(上海)股份有限公司。原始適配體為21個堿基序列：TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA[16]，增加GTCAC 5個堿基的目的是增大探針反應(yīng)區(qū)域與鈍化試劑間距以減小反應(yīng)空間位阻?？敲顾?A(Kan-A)、卡那霉素-B(Kan-B)、阿莫西林(AXL)、氨芐西林(ACL)、四環(huán)素(TCL)、左氧氟沙星(LFX)、磺胺甲基異惡唑(SMZ)，以及4-巰基-1-丁醇(C4-OH)、6-巰基-1-己醇(C6-OH)、9-巰基-1-壬醇(C9-OH)、三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP)均購自Sigma公司(美國)；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑為分析純。測試緩沖溶液和稀釋溶液分別為10 mmol/L PBS和PBS-300(10 mmol/L PBS含300 mmol/L NaCl)。所用的溶液均用去離子水(≥18.2 MΩ·cm)配制。

生活飲用水采集自重慶市涪陵新區(qū)當(dāng)?shù)刈詠硭到y(tǒng)，分為A(住宅區(qū)1)、B(住宅區(qū)2)、C(住宅區(qū)3)和D(住宅區(qū)4)四個地點(diǎn)收集。

1.2 傳感器構(gòu)建方法

金電極按文獻(xiàn)方法[17]處理。傳感器構(gòu)建分為4步：第一步將1.0 μL CSP-MB(0.2 mmol/L)和1.0 μL TCEP(10 mmol/L)混勻，置于暗處放置1 h以徹底還原二硫鍵；第二步用PBS-300稀釋至1.0 μmol/L后，取20 μL滴加到電極表面保持1 h；第三步用PBS-300沖洗電極，并用C6-OH(2 mmol/L)于暗處鈍化電極12 h；第四步用PBS-300再次沖洗電極去除多余的C6-OH。

探針覆蓋密度和MB電子傳遞速率常數(shù)按文獻(xiàn)方法[18，19]計(jì)算。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

所用目標(biāo)物溶液均為新鮮配制。條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用單因素法進(jìn)行；電流-濃度曲線以在10 mmol/L PBS中獲得的電流值對系列Kan-A濃度作圖得到，按線性確定線性范圍，按信噪比(S/N)=3確定檢測限；用于選擇性、傳感速度和再生循環(huán)性能考察的工作溶液均為50%自來水A(1∶1，自來水A/10 mmol/L PBS)，所用目標(biāo)物濃度均為100.0 μmol/L；方法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)在50%自來水溶液中進(jìn)行，以A體系配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液確定定量參數(shù)作為計(jì)算依據(jù)，以其他3個體系配制加標(biāo)溶液，采用線性范圍內(nèi)低、中、高3個濃度加標(biāo)點(diǎn)以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。

信號增益率(Signal Enhancement%，SE%)：SE%= [(I-I0)/I0]×100。其中，I為體系加入目標(biāo)物平衡后的電流信號值，I0為背景電流信號值。該參數(shù)作為傳感性能的評價指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為電極表面適配體探針CSP-MB起到兼捕獲和信號傳輸雙重作用。加入Kan-A之前，CSP-MB以自然彈性擺動狀態(tài)存在，MB遠(yuǎn)離電極表面，電子傳遞效率低，背景電流?。患尤隟an-A后，Kan-A被CSP-MB捕獲形成莖結(jié)狀復(fù)合物[20]，該構(gòu)型變化能有效驅(qū)動MB至電極表面，使電子傳遞效率增大，檢測電流升高。圖1為傳感器構(gòu)建與信號傳導(dǎo)機(jī)制原理圖。

圖1 傳感器構(gòu)建與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制Fig.1 Schematic diagram showing the sensor fabrication and signal transduction mechanism

2.2 主要傳感參數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對影響傳感性能的4個主要參數(shù)，即探針孵育濃度、鈍化溶劑鏈長度、ACV頻率和檢測溫度進(jìn)行了優(yōu)化。探針孵育濃度可有效調(diào)控電極表面的探針數(shù)量，這是影響傳感性能的主要構(gòu)建參數(shù)之一[21]。如圖2(a)所示，隨濃度由0.5 μmol/L變化至5.0 μmol/L，SE%先由176.3±3.8%增大至230.6±5.6%后，降低至97.3±15.6%，最大值對應(yīng)濃度為0.8 μmol/L，確定為體系的最佳探針孵育濃度，該濃度時計(jì)算CSP-MB探針覆蓋密度為1.22E+12±1.3E+11(分子/平方厘米)。鈍化溶劑鏈長度是另一個影響傳感性能的主要構(gòu)建參數(shù)。如圖2(b)所示，隨著溶劑鏈長度由C4增大至C9SE%先由198.2±6.2%升至228.2±9.0%后，降低至126.2±7.8%，C6-OH的SE%最高，確定為最佳溶劑鏈長度。除以上兩個構(gòu)建參數(shù)外，實(shí)驗(yàn)還對傳感性能產(chǎn)生較大影響的兩個檢測參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。如圖2(c)所示，隨著交流伏安法的頻率由1 Hz變化到300 HzSE%由45.5±2.6%增大到226.2±8.8%后，降低到29.6±8.6%，50 Hz時SE%最大，確定為最優(yōu)頻率。對于檢測溫度影響來說，如圖2(d)所示，隨著溫度由10 ℃變化到45 ℃，SE%由155.5±4.8%上升到230.0±13.0%后，減小到214.6±12.2%，35 ℃時SE%達(dá)到最大值，確定其為最佳檢測溫度。

圖2 CSP-MB濃度(a)、鈍化溶劑鏈長度(b)、ACV頻率(c)及檢測溫度(d)對SE%的影響Fig.2 Effect of CSP-MB concentration(a),passivation diluent-chain length(b),ACV frequency(c) and temperature(d) on SE%

圖3 (a)加入2.0 mmol/L Kan-A前后的交流伏安圖；(b)加入2.0 mmol/L Kan-A前后的循環(huán)伏安圖Fig.3 (a) Alternate current voltammograms obtained before and after adding 2.0 mmol/L Kan-A;(b) Cyclic voltammograms obtained before and after adding 2.0 mmol/L Kan-A

2.3 傳感器表征

實(shí)驗(yàn)采用交流伏安法和循環(huán)伏安法兩種電化學(xué)伏安技術(shù)對傳感器反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)行確認(rèn)與表征，見圖3。對于ACV法來說，如圖3(a)所示，加入Kan-A前，在～-0.26 V出現(xiàn)了330.0 nA的背景電流峰，依據(jù)出峰電勢位置判斷其為MB的還原電流峰[22]；加入Kan-A后，電流明顯增大到 1105.2 nA，說明隨著Kan-A的加入，CSP-MB與Kan-A發(fā)生了鍵合反應(yīng)形成復(fù)合物的同時引發(fā)構(gòu)型發(fā)生變化，帶動MB至電極表面并激發(fā)電子傳遞效率的提高，驅(qū)動傳感過程的發(fā)生。對于循環(huán)伏安法來說，如圖3(b)所示，加入Kan-A前MB的氧化與還原峰電位之差(ΔE)為33.2 mV，加入Kan-A平衡后減小至4.0 mV，說明Kan-A的加入增強(qiáng)了電極表面的電化學(xué)活性，有效提高了電子傳遞效率，佐證了傳感過程的發(fā)生。根據(jù)Laviron方程[18]計(jì)算得到反應(yīng)前后電子傳遞速率常數(shù)(ks)分別為36.0±2.6 s-1和142.5±5.8 s-1。

2.4 傳感器綜合性能

2.4.1 靈敏度和選擇性實(shí)驗(yàn)對傳感體系在純緩沖介質(zhì)中的電流-濃度信號關(guān)系進(jìn)行了考察，并確定檢測限和線性范圍。如圖4(a)和4(b)所示，電流信號與Kan-A的濃度正相關(guān)，隨Kan-A濃度的增大而升高，在3.0 mmol/L時達(dá)到飽和，同時確定體系檢測限(S/N=3)為～33.0 nmol/L。另外，如圖4(b)中插圖所示，線性范圍在0.2～1.0 mmol/L之間，線性方程為：y=136.42x+1370.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.9726。

圖4 (a)加入系列濃度Kan-A的交流伏安圖；(b)電流-濃度信號曲線(內(nèi)插圖為線性范圍)Fig.4 (a) Alternate current voltammograms after adding series concentrations of Kan-A;(b) Current-concentration curve(Inset:figure shows the linear regression line)

圖5 7種抗生素分子的SE%Fig.5 SE% of 7 antibiotics

為評估選擇性能，以Kan-A的同源結(jié)構(gòu)物質(zhì)Kan-B和其他5種抗生素AXL、TCL、ACL、LFX和SMZ為干擾物質(zhì)，在以50% 自來水A為檢測體系、抗生素濃度均為100 μmol/L和交流伏安法最佳頻率50 Hz的實(shí)驗(yàn)條件下，通過得到的SE%值評估傳感器的抗干擾能力。如圖5所示，加入Kan-A和Kan-B的SE%分別為82.3±4.2%和70.8±3.6%，區(qū)分度不大。究其原因是兩分子結(jié)構(gòu)上相似度較高，僅為一個基團(tuán)的差別，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的所用適配體對兩分子的解離常數(shù)(kd)相一致[16]。相比較看，其他5個抗生素的SE%均較小，說明傳感器區(qū)分能力較高，顯示出優(yōu)良的選擇性能。

2.4.2 傳感速度和循環(huán)再生性除靈敏度和選擇性外，實(shí)驗(yàn)還對傳感速度和循環(huán)再生使用性能進(jìn)行了考察。如圖6所示，電流在15、30、45 s時分別達(dá)到飽和值的75.8%、92.4%和99.7%，僅需約45 s基本達(dá)到平衡，如此快的響應(yīng)速度有利于建立快速的分析方法。傳感器再生過程簡單，以溫?zé)岬娜ルx子水(約為40 ℃)側(cè)向沖洗電極表面約1 min后，在工作溶液中平衡約20 min即可實(shí)現(xiàn)。圖7顯示了傳感器再生循環(huán)使用3次的SE%變化情況，每次使用后SE%為呈逐漸降低趨勢，可能與單次傳感后適配體探針發(fā)生降解或單分子膜有序性受損，增大了空間位阻進(jìn)而降低傳感效率有關(guān)，總下降率約為7%，傳感器3次后使用仍保持較高的傳感能力，表現(xiàn)出優(yōu)良的重復(fù)使用性能。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品分析

根據(jù)上述傳感器的綜合性能指標(biāo)，以50%自來水A為標(biāo)本溶液，對該方法在實(shí)際樣品中的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，并作為計(jì)算依據(jù)對其他3個實(shí)際自來水體系進(jìn)行了檢測，相關(guān)參數(shù)及檢測結(jié)果見表1。如表1所示，方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)中檢測限為0.06 mmol/L，加標(biāo)回收率在線性范圍內(nèi)高、中和低3個濃度點(diǎn)的平均值介于85.8%～94.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)介于5.6%～11.2%之間。參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)對農(nóng)獸藥殘留方法加標(biāo)回收率介于70%～130%之間，RSD≤20%，對牛奶中Kan的最大殘留限量≤150 nmol/L(生活飲用水中抗生素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)目前還未出臺)，該方法用于實(shí)際樣品檢測具有有效性。將該方法用于3個不同住宅區(qū)取水點(diǎn)樣品的檢測，結(jié)果均未檢出Kan-A殘留。

圖6 電流-時間曲線Fig.6 Current-time curve

圖7 再生循環(huán)曲線Fig.7 Regeneration-cycle curve

表1 實(shí)際自來水樣品中方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)和檢測結(jié)果一覽表Table 1 Data sheet of methodological validation parameters and analytical results in real tap water samples

*LR=linear range;DL=detection limit;SC=spiked concentration;MR=mean recovery;RC=residual concentration;nd=not detected.

3 結(jié)論

本文以適配體探針為特異性分子識別元件，建立了生活飲用水中Kan殘留的電化學(xué)傳感新方法。所構(gòu)建的傳感器具有免樣品前處理、操作簡單、響應(yīng)快速、無需添加外源試劑且可再生重復(fù)使用的特點(diǎn)，結(jié)合性能參數(shù)驗(yàn)證結(jié)果顯示，其用于實(shí)際樣品的分析具有有效性，預(yù)示該傳感體系利于發(fā)展成快速、準(zhǔn)確的應(yīng)用型定量檢測方法，并可用于借鑒到其他樣品體系如牛奶和血清等的檢測中。