基于2-羥丙基-β-環(huán)糊精修飾的CdTe熒光探針定量分析結(jié)晶紫及機理探討

嚴梅敏,李麗娜

(宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000)

結(jié)晶紫(CV)是一種人工合成的有毒堿性三苯甲烷類染料[1]，因其價格低廉、使用方便，被用于治療水產(chǎn)品因細菌和真菌引起的各種疾病。然而，三苯甲烷類染料會危害人體機能，其降解產(chǎn)物苯胺具有致畸、致癌、致突變作用[2]，嚴重威脅著消費者的身體健康。研究表明，結(jié)晶紫在魚的肌肉組織中的消除過程長，代謝物會殘留在魚體內(nèi)，并迅速在生物體內(nèi)富積[3]，最后可能通過食用進入人體。目前水產(chǎn)品中CV的檢測主要依賴高效液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜等[4-5]大型分析儀器，這些方法在檢測中存在樣品前處理復雜、成本高、耗時耗力等問題。因此，建立新方法測定水產(chǎn)品中的CV具重要研究意義。

量子點具有優(yōu)異的光學和電學性能，其合成具有巨大的應用潛力[6]。而進一步對量子點表面進行功能修飾對其結(jié)合性能具重要作用，可通過改變量子點表面配體分子以及覆蓋功能配體使其表面鈍化，以實現(xiàn)量子點的功能化，促進量子點與環(huán)境的兼容性[7]，如利用冠醚、環(huán)糊精、杯芳烴等分子化合物對量子點表面進行修飾,可直接降低量子點表面的缺陷程度，實現(xiàn)量子點功能化，改善其熒光量子效率和穩(wěn)定性[8]。申晨凡等[9]通過制備高穩(wěn)定性、高量子產(chǎn)率的 CdSe/ZnS量子點構建了檢測多巴胺的熒光方法。

本文采用TGA作穩(wěn)定劑和2-Hp-β-CD作修飾劑，在水相中合成2-Hp-β-CDCdTe量子點，其結(jié)合了CdTe熒光量子點的性能和2-Hp-β-CD的包容能力，提高了量子點的水溶性和增強了熒光能量的穩(wěn)定性。以2-Hp-β-CDCdTe量子點和CV分別為供體和受體，構建的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系可實現(xiàn)對CV的熒光猝滅，從而發(fā)展了基于量子點與CV的相互作用實現(xiàn)對水產(chǎn)品中CV快速、廉價、靈敏檢測的分子光譜法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司)，用于記錄RRS光譜;F-280型熒光分光光度計(天津港東科技有限公司)，用于熒光光譜并進行相應的測量；FE28型PH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)調(diào)節(jié)溶液酸度；Evolution Model 201紫外-可見分光光度計(UV-Vis，賽默飛世爾科技中國有限公司)用于吸收光譜的掃描；F200透射電鏡(日本電子)用于測定量子點的形貌；HJ-5型多功能攪拌器(蘇州威爾實驗用品有限公司)用于合成量子點過程中攪拌加熱。

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)、巰基乙酸(TGA)、CV、亞碲酸鈉(Na2TeO3)購于山東西亞化學工業(yè)有限公司；2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-Hp-β-CD)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購于國藥集團化學試劑有限公司；所有試劑純度均為分析純，水為去離子水。

1.2 實驗過程

CdTe量子點的合成:以TGA為穩(wěn)定劑，采用水熱法合成CdTe量子點，將0.02 mol/L CdCl2· 2.5H2O溶液置于三口燒瓶中，通過不斷攪拌使新加入的0.277 mL TGA全部溶解，用1 .0 mol/L NaoH調(diào)至pH 10.5，在N2環(huán)境中驅(qū)除溶液中的溶解氧[10]。在N2下加入0.1 g NaBH4和0.022 2 g Na2TeO3，并在空氣下加熱(100 ℃)回流2 h。

再稱取1 g 2-Hp-β-CD 溶于50 mL水中，加至已制備的CdTe量子點，繼續(xù)加熱回流2 h，制得2-Hp-β-CDCdTe量子點。

1.3 CV的測定

于5 mL 比色管中依次加入1.6 mL 2.0×10-4mol/L 2-Hp-β-CDCdTe量子點、1.0 mL 1.37×10-4mol/L CTAB、1.0 mL Tris-HCl 緩沖溶液(pH 8.0)和一定量的CV標準溶液，定容混勻，室溫下穩(wěn)定 20 min。以330 nm為激發(fā)波長，測定其熒光強度F和空白溶液(未加CV標準溶液)的熒光強度F0，計算相對熒光強度 ΔF=F0-F，以ΔF對CV濃度作圖并繪制標準曲線。

圖1 CdTe QDs(a,c)和2-Hp-β-CDCdTe QDs(b,d)的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

2 結(jié)果與討論

2.1 2-Hp-β-CDCdTe量子點的紫外吸收光譜和熒光光譜

圖1顯示了水溶液中CdTe量子點分別與2-Hp-β-CD結(jié)合前后的紫外-可見吸收光譜(曲線a、b)和熒光發(fā)射光譜(曲線c、d)。從曲線a、b可知，二者結(jié)合后，紫外光譜吸收強度下降，最大吸收峰紅移，但譜圖形狀無較大改變，均具有較寬的激發(fā)光譜范圍；比較曲線c、d，發(fā)現(xiàn)結(jié)合2-Hp-β-CD后的CdTe量子點熒光強度顯著增加，發(fā)射峰位輕微紅移；選擇330 nm 處激發(fā)時，其熒光發(fā)射最大波長位于550 nm 處，且發(fā)射峰峰形對稱，半峰寬窄，熒光強度較高。表明CdTe量子點被2-Hp-β-CD修飾后具有良好的熒光性能。究其原因，很可能是由于2-Hp-β-CD的作用鈍化了量子點表面，抑制了表面空穴處的非輻射重組[11]。此外，觀察c、d的發(fā)射峰位置，發(fā)現(xiàn)2-Hp-β-CDCdTe量子點與CdTe量子點的光譜寬度基本相同，說明水溶液中的2-Hp-β-CDCdTe量子點保持了量子點的光學特性。與原來的CdTe量子點相比，2-Hp-β-CD可以很好地改善其性能，如增加水溶性，增強熒光能量的穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)分子包含體的效果。

2.2 2-Hp-β-CDCdTe量子點的表征

圖2為2-Hp-β-CDCdTe量子點(無CTAB)，以及CTAB存在下CV與2-Hp-β-CDCdTe QDs體系的高分辨透射電鏡(HRTEM)圖。從圖中可以看出，所制備的2-Hp-β-CDCdTe量子點近似呈球形，粒徑約為4 nm，且分布均勻，有很好的分散性(圖2A)。當量子點體系中加入1.0 ×10-5mol/L CV時，可觀察到產(chǎn)物粒徑明顯增大，粒徑從4 nm左右增至10 nm左右，形態(tài)也從較規(guī)則的近圓形變化為不規(guī)則形狀，形成團聚(圖2B)。說明在CTAB存在下，溶液中CV和2-Hp-β-CDCdTe QDs隨機結(jié)合，生長成穩(wěn)定且大小不同的復合物。

圖2 2-Hp-β-CDCdTe QDs(A)及CV與2-Hp-β-CDCdTe QDs體系(B)的TEM圖

圖3 2-Hp-β-CDCdTe QDs的發(fā)射光譜(a)和CV的紫外-可見吸收光譜(b)

2.3 CV與2-Hp-β-CDCdTe量子點的FRET構建

熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET)是指化合物分子受光激發(fā)后，分子內(nèi)部發(fā)生了供體與受體之間的一種能量轉(zhuǎn)移。FRET的發(fā)生需滿足3個條件：① 供體能發(fā)射熒光；② 供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定程度的重疊；③ 供、受體足夠接近，且作用距離一般為2～8 nm[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)2-Hp-β-CDCdTe量子點和CV可分別作為供體和受體，根據(jù)2-Hp-β-CDCdTe量子點的發(fā)射光譜和結(jié)晶紫的吸收譜(圖3)可知，2-Hp-β-CDCdTe 量子點的熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長為550 nm)均落在CV的紫外吸收光譜(CV最大吸收波長為 600 nm)圖內(nèi)，可見二者的光譜重疊性較好，達50%以上(大于30%)。因此，可認定二者之間形成了FRET，導致量子點發(fā)生熒光猝滅效應[14]。

根據(jù) Stern-Volmer 方程[15]，進一步判斷CV對2-Hp-β-CDCdTe量子點的熒光猝滅類型，實驗設定CV濃度在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)。根據(jù)公式：F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]，式中的F0和F分別為加入猝滅劑前后熒光物質(zhì)的熒光強度，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)，τ0為未加猝滅劑熒光物質(zhì)的平均壽命(通常為 10-8s)，[Q]表示猝滅劑的濃度。根據(jù)公式計算出Kq=1.8×1014L·mol-1·s-1，該值遠遠大于猝滅劑與熒光分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，可判定CV對2-Hp-β-CDCdTe量子點的猝滅為靜態(tài)猝滅[16 ]。引起靜態(tài)猝滅的主要原因為能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移、表面吸附[15],進一步佐證了二者之間建立的FRET引發(fā)了2-Hp-β-CDCdTe量子點的靜態(tài)猝滅。

2.4 CTAB對2-Hp-β-CDCdTe-CV體系FRET的影響

圖4 CTAB對體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移的影響

圖5 pH 值對2-Hp-β-CDCdTe QDs-CV 體系熒光強度的影響

圖6 CTAB濃度對2-Hp-β-CDCdTe QDs-CV 體系熒光強度的影響

考察了加入CV前后2-Hp-β-CDCdTe量子點體系的熒光強度變化(圖4曲線a、b)，及加入表面活性劑CTAB前后熒光強度的變化(圖4曲線b、c)。結(jié)果顯示，加入CV后2-Hp-β-CDCdTe的熒光強度降低不明顯，說明猝滅劑和熒光劑之間雖然發(fā)生了反應，但形成的新物質(zhì)不穩(wěn)定，當進一步加入CTAB后，熒光強度大幅度降低。原因可能為2-Hp-β-CDCdTe量子點表面帶負電荷，可與帶正電荷的CTAB陽離子表面活性劑分子通過靜電作用結(jié)合形成QDs-CTAB復合體[17]，也可能因CTAB分子中烴基可與CV 分子通過分子間作用力結(jié)合使得CV和量子點的距離縮短，從而加深了能量間的傳遞，形成了更穩(wěn)定的化合物。

2.5 實驗條件的優(yōu)化

2.5.1 pH值對體系熒光強度的影響將2-Hp-β-CDCdTe 量子點應用于分子檢測時，其熒光強度易受溶液 pH值的影響。實驗以Tris-HCl 為緩沖溶液，考察了pH 值在5.0 ～10.0范圍內(nèi)對體系熒光強度的變化情況。圖5顯示，在較酸或較堿性條件下熒光強度變化不大，當溶液pH值為7.0～9.0時，反應體系的熒光猝滅效應較為明顯，且以pH 8.0左右的猝滅效果最強烈。因此，實驗選擇pH 8.0 Tris-HCl緩沖溶液作為體系最佳反應環(huán)境。這是由于2-Hp-β-CDCdTe量子點表面TGA存在著羧基基團，在較強的酸性條件下，羧基電離程度低，使得量子點的親水性降低[18]，導致量子點在較強酸性條件下熒光較低的現(xiàn)象；當pH較堿性時，溶液中存在的大量OH-會與量子點表面配體產(chǎn)生競爭作用，2-Hp-β-CD分子含羥基鍵，而羥基的吸附和配體的離去會在量子點表面形成新的缺陷，導致非輻射躍遷增大，熒光猝滅強度降低[19]。

2.5.2 CTAB用量對體系熒光強度的影響考察了不同體積(0.1、0.3、0.8、1.0、1.2 mL)CTAB對體系熒光強度的影響。結(jié)果顯示，當CTAB用量逐漸增大時，熒光猝滅效應逐漸增強，當CTAB用量為0.8 mL時，體系的熒光猝滅最強，此后，繼續(xù)增加CTAB用量，其熒光猝滅效應反而減弱。因此，實驗選取0.8 mL CTAB為實驗最佳用量。固定CTAB用量及其他條件，考察了CTAB濃度對體系的影響。根據(jù)圖6可知，CTAB濃度過低時體系猝滅效應不明顯，過高時,溶液易出現(xiàn)白色渾濁，且穩(wěn)定性降低。因此實驗選擇CTAB的最佳濃度為1.37×10-4mol/L。

2.5.3 量子點濃度對體系熒光強度的影響量子點濃度的變化會影響體系的相對熒光強度。當量子點的濃度較大、熒光強度高時，加入少量CV時的熒光強度變化不明顯，導致分析的靈敏度低；當量子點的濃度較小、熒光強度低時，加入少量CV可使得熒光強度發(fā)生明顯變化，靈敏度好，但線性范圍窄。綜合考量靈敏度和線性范圍，本實驗選擇2-Hp-β-CDCdTe量子點溶液為2.0×10-4mol/L(按Cd2+濃度計算)。

2.6 干擾實驗

2.7 線性范圍與檢出限

在最佳實驗條件下，考察了不同CV濃度對體系熒光強度的影響，并繪制標準曲線(見圖7)。結(jié)果表明：CV濃度在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與體系的相對熒光強度呈良好的線性關系，線性方程為ΔF=43.195c+42.377(c：μmol/L),相關系數(shù)(r2)為0.995 2，檢出限(3δ/k)為1.74×10-8mol/L。

圖7 不同濃度CV對2-Hp-β-CDCdTe QDs體系熒光強度的影響

2.8 實際樣品的分析

為驗證該方法在實際應用中的可行性，本文對湖水中的CV含量進行測定。水樣取自岐山村漁業(yè)養(yǎng)殖廢水排口下游的湖塘，將1 L水樣加熱濃縮至100 mL，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8.0，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。取上述處理后的水樣，按實驗方法對其進行檢測，均未檢出CV。采用標準加入法進行回收率實驗，在樣品中分別加入0.2、1.0、3.0 μmol/L 3種濃度的CV標準溶液，測得CV的回收率分別為103%、106%、99%，相對標準偏差(RSD)分別為2.0%、4.3%、1.5%。說明該方法具有較好的準確度和精密度，可用于漁業(yè)養(yǎng)殖廢水中CV的測定。

3 結(jié) 論

本研究以TGA作為穩(wěn)定劑和2-Hp-β-CD作為修飾劑在水相中合成CdTe量子點，利用CV對2-Hp-β-CDCdTe量子點的猝滅效應，建立了CdTe量子點測定水中CV的方法。研究發(fā)現(xiàn)2-Hp-β-CD修飾的CdTe量子點的水溶性強、熒光能量的穩(wěn)定性較好，量子點同CV間產(chǎn)生了能量共振轉(zhuǎn)移作用，導致靜態(tài)熒光猝滅的發(fā)生，加入CTAB后導致猝滅效應大大增強。根據(jù)此機理，優(yōu)化了量子點同CV的反應條件，并對漁業(yè)養(yǎng)殖廢水中的CV實現(xiàn)了定量檢測，結(jié)果滿意。

致謝：感謝南昌大學唐群教授和付鑫同學在本文完成過程中提供的幫助和指導！