黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)對(duì)篩選物敏感性研究

黃 浩，韋 瑩，翟勇進(jìn)，白隆華*，陳曉陽(yáng)

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023，2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510462）

黃梁木（Neolamarckia cadamba）為茜草科團(tuán)花屬速生型喬木，10 年左右成材，衰退期晚，是華南地區(qū)特有的速生鄉(xiāng)土樹種。雖然黃梁木有工業(yè)用材、藥用、園林景觀和飼用等多種用途，但因不耐零度低溫[1-2]和易遭蟲害[2-4]，使得其人工栽培區(qū)域僅局限于廣東、廣西和海南等氣溫較高的地區(qū)[1]。選育抗寒、抗蟲性強(qiáng)的植株類型，以提高黃梁木產(chǎn)量，是發(fā)展黃梁木用材林亟待解決的問(wèn)題。

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)具目的性強(qiáng)、周期短的特點(diǎn)，可打破種間雜交不親和的界限[5-6]，因此，利用該技術(shù)對(duì)生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的林木進(jìn)行遺傳改良具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，建立高效的再生體系和篩選體系是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。不同物種、不同外植體對(duì)于篩選物和抑菌劑的敏感性有較大差別，在遺傳轉(zhuǎn)化之前，找出適宜的篩選物、抑菌劑的類型和濃度是遺傳轉(zhuǎn)化能否順利進(jìn)行的關(guān)鍵。因此，利用篩選物和抑菌劑對(duì)外植體進(jìn)行敏感性試驗(yàn)非常必要。目前，有關(guān)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化研究仍無(wú)報(bào)道。因此，本研究在已建立的黃梁木再生體系基礎(chǔ)上[7-8]，選取在植物遺傳轉(zhuǎn)化中被廣泛作為篩選物的卡那霉素和潮霉素，以及抑菌劑頭孢霉素，在對(duì)篩選物較敏感的誘導(dǎo)不定芽分化和生根階段，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，為后續(xù)黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化研究特別是為提高黃梁木耐寒、抗蟲的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、農(nóng)桿菌株和試劑

飽滿成熟的黃梁木種子，來(lái)源于廣西藥用植物園本草綱目園區(qū)內(nèi)一株20 a 樹齡的健康植株。

在超凈臺(tái)上將種子滅菌，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 d 后，切取無(wú)菌植株的子葉和胚軸作為不定芽分化誘導(dǎo)材料；生根誘導(dǎo)材料則將無(wú)菌植株莖的下部分切除，先轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，再進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn)。

卡那霉素（kanamycin，簡(jiǎn)寫 Km）、潮霉素（hygromycin，簡(jiǎn)寫 Hm）、頭孢霉素（cefotaxime，簡(jiǎn)寫Cef），以及所使用的 DCR 培養(yǎng)基、MS 培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂和激素等均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，含植物表達(dá)載體pBI121-GUS 的農(nóng)桿菌LBA4404 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

按前期再生體系優(yōu)化得到的培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基DCR+TDZ2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L；增殖培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.05 mg/L；生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L。

所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30.0 g/L，瓊脂5.6g/L，pH 值均調(diào)至5.8～6.0，高溫高壓滅菌后，冷卻到55 ℃左右，按不同試驗(yàn)?zāi)康募尤胂鄳?yīng)的篩選物，搖勻、分裝，凝固1 d 后待用。

1.3 篩選物對(duì)外植體分化和生根影響的濃度梯度設(shè)置方法

參考其他木本植物對(duì)篩選物敏感情況和預(yù)試驗(yàn)，同一種篩選物在不定芽分化和生根誘導(dǎo)這兩個(gè)試驗(yàn)階段，設(shè)置的濃度梯度相同，即卡那霉素的濃度梯度為 0、4、6、8、10、15、20 和 50 mg/L；潮霉素的濃度梯度為 0、2、4、6、8、10 和 12 mg/L，而頭孢霉素的梯度設(shè)置為 0、25、50、100、150、200、300 和 400 mg/L。每個(gè)濃度均設(shè)置3 次重復(fù)。

1.4 篩選物頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌抑制效果的處理方法

為了便于校正和檢驗(yàn)抑菌試驗(yàn)可能存在的誤差，共設(shè)計(jì)農(nóng)桿菌直接浸染外植體和OD600 光密度值測(cè)定法進(jìn)行農(nóng)桿菌抑制試驗(yàn)。前者直接觀察菌斑的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)農(nóng)桿菌出現(xiàn)的時(shí)間（d），后者通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)液的OD600 光密度值，作為判斷菌株的生長(zhǎng)情況。頭孢霉素濃度梯度設(shè)置為0、25、50、100、150、200、300 和 400 mg/L。每個(gè)濃度均設(shè)置 3 次重復(fù)。

1.4.1 直接浸染外植體法

①在含有卡那霉素、利福平的YEB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404 至OD600 值為0.8；

②將在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d 的愈傷組織，切長(zhǎng)、寬和高均約為0.3 mm 小塊，用步驟1 培養(yǎng)好的YEB 菌液浸染5 min；將愈傷組織表面菌液吸干，轉(zhuǎn)入含頭孢霉素濃度梯度的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4.2 OD600 測(cè)定法

①取已滅菌的8 個(gè)100 mL 錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶裝20 mL YEB 培養(yǎng)液；按上述頭孢霉素濃度梯度將頭孢霉素分別準(zhǔn)確添加到8 個(gè)錐形瓶中；

②將OD600值為0.8 的農(nóng)桿菌LBA4404 各吸取10 μL，分別加入 8 個(gè)錐形瓶中；置于 28 ℃，180 rpm的搖床上恒溫培養(yǎng)；培養(yǎng)后24 和48 h，測(cè)定8 個(gè)錐形瓶中YEB 培養(yǎng)液的OD600值。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

外植體的分化率、平均長(zhǎng)芽個(gè)數(shù)、白化率、生根率、死亡率和農(nóng)桿菌斑生長(zhǎng)情況。

分化率=誘導(dǎo)出不定芽的外植體個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)×100%；平均長(zhǎng)芽個(gè)數(shù)=不定芽總個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)×100%；白化率=白化的外植體個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)×100%；生根率=誘導(dǎo)出根的外植體個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)×100%；死亡率=外植體死亡個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和作圖采用SPSS Ver19.0、Excel 2016進(jìn)行。試驗(yàn)采用3 次重復(fù)，結(jié)果為3 次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并通過(guò)Duncan's multiple range test方法進(jìn)行分析顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選物對(duì)不定芽分化的影響

2.1.1 篩選物卡那霉素對(duì)不定芽分化的影響

在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，篩選物卡那霉素（Km）對(duì)黃梁木不定芽分化有顯著的抑制作用（表1）。Km濃度增大對(duì)分化率影響非常明顯，當(dāng)Km 濃度由0增大到4 mg/L 的時(shí)候，分化率由100%下降到95.00%，平均長(zhǎng)芽個(gè)數(shù)由1.44 個(gè)下降為1.25 個(gè)；當(dāng)Km 濃度為8 mg/L，分化率已下降為52.6%，平均芽個(gè)數(shù)僅為1.0 個(gè)，近一半外植體白化；當(dāng)Km 濃度15 mg/L 時(shí)，分化率已下降為2.50%，平均芽個(gè)數(shù)僅為0.25 個(gè)，白化率高達(dá)97.5%。當(dāng)Km 濃度為20 mg/L時(shí)，已完全抑制不定芽分化，愈傷組織的體積較小；當(dāng)Km 濃度大于50 mg/L 時(shí)，愈傷組織形成已嚴(yán)重受抑制，外植體幾乎不膨大（圖1）。由此可見，在黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化中，如采用卡那霉素作為篩選物，不定芽分化的篩選濃度可選擇20 mg/L。

2.1.2 篩選物潮霉素對(duì)不定芽分化的影響

從表2可看出，潮霉素對(duì)不定芽分化的抑制作用較強(qiáng)，不定芽的分化率隨著潮霉素濃度的增大而減少。當(dāng)潮霉素濃度為2 mg/L 時(shí)，不定芽分化率即降低到75.00%，與對(duì)照組（CK）比較，分化率減少了1/4，同時(shí)，芽的伸長(zhǎng)也略受抑制；當(dāng)潮霉素濃度為4 mg/L 時(shí)，不定芽分化率約為對(duì)照組的1/4，僅為28.57%；當(dāng)潮霉素濃度為8 mg/L時(shí)，不定芽分化率僅為14.29%，而死亡率達(dá)60%，有70%的外植體褐化，芽伸長(zhǎng)、葉伸展均嚴(yán)重受抑制；當(dāng)潮霉素為8 mg/L 時(shí)，愈傷呈淡綠色，體積很小，當(dāng)濃度大于10 mg/L 后，基本無(wú)愈傷組織生成，外植體不分化出芽（圖2），45 d 后，所有外植體均褐化死亡。

表1 卡那霉素對(duì)不定芽分化的影響Table 1 Effect of different concentrations Km on adventitious bud induction

圖1 外植體在不同Km 濃度下誘導(dǎo)分化的情況（30 d）Figure 1 Induced differentiation of explants at different Km concentrations （30 d）

表2 不同濃度潮霉素對(duì)不定芽分化的影響Table 2 Effect of different concentrations Hm on adventitious bud induction

圖2 外植體在不同Hm 濃度下誘導(dǎo)分化的情況（30 d）Figure 2 Induced differentiation of explants at different Hm concentrations （30 d）

2.1.3 篩選物頭孢霉素對(duì)不定芽分化的影響

從表3 可看出，頭孢霉素對(duì)黃梁木不定芽的分化影響不大。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所有外植體均無(wú)白化或褐化，依然呈疏松膨大狀態(tài)，當(dāng)頭孢霉素濃度不超過(guò)200 mg/L 時(shí)，分化率均為100%，平均長(zhǎng)芽個(gè)數(shù)差異不大；當(dāng)頭孢霉素濃度為400 mg/L 時(shí)，不定芽分化率依然為高達(dá)91.12%，平均長(zhǎng)芽個(gè)數(shù)為1.30 個(gè)，外植體生長(zhǎng)情況仍較好。

2.2 篩選物對(duì)黃梁木無(wú)菌苗生根的影響

由圖3 可見，隨著卡那霉素（Km）和潮霉素（Hm）濃度的增大，生根率和根長(zhǎng)均迅速降低。

當(dāng)卡那霉素濃度從4.0 mg/L 增大到8.0 mg/L時(shí)，生根率從100%迅速降低為65.62%，根長(zhǎng)也由2.6 cm 降低為1.2 cm；當(dāng)卡那霉素濃度等于或大于10 mg/L 時(shí)，無(wú)菌苗無(wú)法誘導(dǎo)出不定根；另外，當(dāng)卡那霉素濃度為50 mg/L 時(shí)，嫩葉和芽出現(xiàn)了白化，芽的生長(zhǎng)也受到抑制。

當(dāng)潮霉素濃度從0 到6 mg/L 間變化時(shí)，無(wú)菌苗的生根率較高，均不低于85.00%的生根率；隨著濃度增大到8 mg/L，生根率迅速降低至35.00%；而根長(zhǎng)則對(duì)潮霉素濃度的增大變得較敏感，當(dāng)潮霉素濃度為2 mg/L 時(shí)，根長(zhǎng)就降低為2.1 cm，比沒有添加潮霉素的對(duì)照組減少了1.4 cm，當(dāng)潮霉素濃度為8 mg/L 時(shí)，根長(zhǎng)迅速降至0.3 cm；當(dāng)濃度為10 mg/L以上時(shí)，無(wú)菌苗已無(wú)法誘導(dǎo)出不定根。另外，當(dāng)潮霉素濃度大于6 mg/L 后，對(duì)芽、莖的伸長(zhǎng)和葉片正常伸展均有較明顯的抑制作用。

頭孢霉素對(duì)無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)的影響見圖4。隨著頭孢霉素濃度的增大，生根率和根長(zhǎng)緩慢下降。當(dāng)頭孢霉素濃度在0 至150 mg/L 的范圍內(nèi)，生根率均為100%，根長(zhǎng)均為3.5 cm，并不受頭孢霉素的影響；當(dāng)濃度為200 mg/L 時(shí)，生根率為98.6%，根長(zhǎng)為3.2 cm，僅比對(duì)照組的生根率和根長(zhǎng)分別減少1.4%、0.3 cm；當(dāng)濃度為400 mg/L 時(shí)，生根率和根長(zhǎng)也只降低至95.52%和2.1 cm，無(wú)菌苗的莖、葉顏色仍呈綠色，無(wú)白化或褐化現(xiàn)象出現(xiàn)。表明頭孢霉素對(duì)無(wú)菌苗誘導(dǎo)生根的影響較小。

表3 頭孢霉素對(duì)不定芽分化的影響Table 3 Effect of different concentrations Cef on adventitious bud induction

圖3 卡那霉素和潮霉素對(duì)無(wú)菌苗誘導(dǎo)生根的影響（20 d）Figure 3 Effects of different concentrations Km and Hm on aseptic seedling rooting （20 d）

圖4 頭孢霉素對(duì)無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)的影響（20 d）Figure 4 Effects of different concentrations Cef on aseptic seedling rooting （20 d）

2.3 頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌抑制的效果

2.3.1 直接浸染外植體法

采用直接浸染外植體法的抑制結(jié)果見表4。在沒有添加頭孢霉素的培養(yǎng)基中，在接種次日，愈傷周圍即出現(xiàn)菌斑，感染率達(dá)100%，隨著頭孢霉素濃度的增大，菌斑出現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)，感染率也逐漸下降，當(dāng)濃度為50 mg/L 時(shí)，7 d 后才開始出現(xiàn)菌斑，感染率僅為10%。當(dāng)頭孢霉素濃度為100 mg/L 或更高時(shí)，已沒有菌斑出現(xiàn)，表明農(nóng)桿菌生長(zhǎng)已完全被抑制。

表4 不同頭孢霉素濃度抑菌效果Table 4 The inhibitive effects of different concentrations Cef on agrobacterium

2.3.2 OD600光密度值測(cè)定法

采用OD600光密度值測(cè)定法檢測(cè)抑菌效果見圖5。隨著頭孢霉素濃度的增大，抑制效果越強(qiáng)，當(dāng)YEB 液體培養(yǎng)基中沒有添加頭孢霉素時(shí)，培養(yǎng)12 h和 48 h 后，OD600值分別為 2.787 和 2.801，當(dāng)頭孢霉素濃度為25 mg/L 時(shí)，培養(yǎng)12 h 和48 h 時(shí)的OD600值分別為0.327、1.789，隨著頭孢霉素濃度的逐漸增加，2 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的OD600值均逐漸降低，當(dāng)濃度為100 mg/L 或更大時(shí)，各處理的菌液OD600值均接近0，表明頭孢霉素濃度等于或大于100 mg/L 時(shí)，已完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)（圖5）。

圖5 頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌抑制效果Figure 5 The inhibitive effects of different concentrations Cef on agrobacterium

通過(guò)上述兩種抑菌試驗(yàn)方法可看出，頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌LBA4404 有較好的抑制作用，當(dāng)濃度為100 mg/L 即可抑制農(nóng)桿菌株的生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，一般需建立高效再生體系和轉(zhuǎn)化體系。在轉(zhuǎn)化體系的建立中，要明確外植體對(duì)篩選物的敏感性，即篩選物在一定的濃度下可抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞因攜帶相應(yīng)的抗性基因能正常生長(zhǎng)、分裂和分化；同時(shí)，也要求該篩選物對(duì)外植體沒有嚴(yán)重的毒性[9]。不同物種、同一物種不同類型的相同外植體，以及同一物種的不同外植體，對(duì)篩選物的敏感性均不盡相同。例如，在紫雨樺離體葉片愈傷對(duì)不同篩選物的敏感試驗(yàn)中，頭孢霉素和頭孢曲松鈉的篩選壓范圍為200～400 mg/L、特美汀的則為400～800 mg/L[10]；在金發(fā)草愈傷的生長(zhǎng)分化中，卡那霉素的篩選壓為15 mg/L，但氨芐青霉素的濃度高達(dá)1 000 mg/L 時(shí)，對(duì)其愈傷的誘導(dǎo)分化仍影響不大[11]；在刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷分化的篩選物試驗(yàn)中，卡那霉素的篩選壓濃度范圍為100～125 mg/L，在無(wú)菌苗誘導(dǎo)生根的篩選濃度則為75 mg/L[12]。本試驗(yàn)使用的3 種篩選物，所得結(jié)果與上述3 種植物的結(jié)果不盡相同。因此，在遺傳轉(zhuǎn)化中，篩選物類型和濃度的選擇，需據(jù)植物不同植物、不同外植體和表達(dá)載體上攜帶的標(biāo)記基因等因子經(jīng)篩選而定。

卡那霉素能夠與非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)線粒體和葉綠體結(jié)合，而毒害植物綠色器官使其缺綠，導(dǎo)致白化或黃化死亡[12]；而潮霉素通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2 的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制肽鏈的延長(zhǎng)，破壞細(xì)胞的翻譯功能，使細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成受阻，使敏感組織褐化死亡。而轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株會(huì)編碼使對(duì)應(yīng)抗生素失活的酶，從而產(chǎn)生抗性[13]。本試驗(yàn)中，無(wú)論是不定芽分化還是生根誘導(dǎo)，外植體表現(xiàn)出對(duì)潮霉素更敏感，這與楸樹[14]、金發(fā)草[11]和黃連木[15]在遺傳轉(zhuǎn)化的抗生素試驗(yàn)結(jié)果相近；表明潮霉素較卡那霉素對(duì)黃梁木外植體的毒性更強(qiáng)，細(xì)胞發(fā)育和生長(zhǎng)受到更強(qiáng)的抑制。另外，采用卡那霉素作為篩選物，生根過(guò)程的篩選壓（10 mg/L）比不定芽分化過(guò)程的篩選壓（20 mg/L）低，表現(xiàn)出植體在生根過(guò)程對(duì)卡那霉素更敏感，結(jié)果與刺槐遺傳轉(zhuǎn)化中篩選物試驗(yàn)的結(jié)果相同[12]。

抑菌抗生素是農(nóng)桿菌的有效抑制劑，在抑菌篩選物篩選中，不僅需要篩選物在適宜濃度下可抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，而且在該濃度下，外植體的正常生長(zhǎng)不受影響或影響較小[9，16]。黃梁木外植體在不定芽分化和生根過(guò)程對(duì)頭孢霉素的敏感性較低，當(dāng)濃度高達(dá)400 mg/L 時(shí)，影響仍較??；但農(nóng)桿菌LBA4404較敏感，在頭孢霉素濃度為100 mg/L 時(shí)，即可抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，較適合作為黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌劑。

3.2 結(jié)論

卡那霉素、潮霉素作為黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化的篩選物，對(duì)黃梁木不定芽分化和生根有明顯的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增大而增強(qiáng)。用卡那霉素和潮霉素作為黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化不定芽分化、生根誘導(dǎo)過(guò)程的篩選物，卡那霉素的敏感濃度分別為20和10 mg/L，而潮霉素的敏感濃度均為10 mg/L；結(jié)合外植體在誘導(dǎo)不定芽分化、生根篩選試驗(yàn)中對(duì)頭孢霉素敏感性，以及農(nóng)桿菌對(duì)頭孢霉素敏感性試驗(yàn)，可使用濃度為200 mg/L 的頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)或脫菌。該結(jié)果為黃梁木采用生物技術(shù)手段特別是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行抗性育種奠定基礎(chǔ)。