蒙成藥扎沖十三味丸對(duì)大鼠心臟的亞急性毒理學(xué)研究

強(qiáng) 欣，塔娜，韓 雪，張 娟，孫曉宇，張小芬，陶 春，奧·烏力吉

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.赤峰市醫(yī)院司法鑒定所，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蒙成藥扎沖十三味丸早已被《藥典》收錄，是蒙醫(yī)臨床傳統(tǒng)名貴藥方之一.出自《至高要方》，由訶子、草烏（制）、禹糧土、麝香、珊瑚（制）、珍珠（制）、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、磁石（制）、肉豆蔻13種成份組方配伍而成［1］.臨床治療使用療程長(zhǎng)、范圍廣.檢索國(guó)內(nèi)外主流數(shù)據(jù)庫(kù)至今未發(fā)現(xiàn)關(guān)于心臟毒理學(xué)研究方面的文獻(xiàn)報(bào)道.本研究通過(guò)觀(guān)察大鼠在用藥后的一般情況、心率、心電圖、生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)及臟器系數(shù)方面的變化，探討不同劑量時(shí)蒙成藥扎沖十三味丸對(duì)心臟亞急性毒性作用，從而指導(dǎo)臨床安全用藥.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、主要試劑和儀器

健康成年清潔級(jí)（Sprague-Dawley，SD）大鼠80只，雄性，體重（200±20）g.由《遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司》提供，許可證號(hào)為《SCXK（遼）2015-0001》.蒙成藥扎沖十三味丸由內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司生產(chǎn)，生藥扎沖十三味由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院生產(chǎn)，其余試劑均購(gòu)買(mǎi)于索萊寶生物科技有限公司.CPA225D 型電子天平購(gòu)置賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)置成都泰盟科技有限公司，MR-96A 型酶標(biāo)儀和MW-12A 型洗板機(jī)購(gòu)置深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，其余設(shè)備均來(lái)自德國(guó)徠卡公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及記錄資料

取80只SD大鼠分為正常對(duì)照組、蒙成藥扎沖十三味丸中劑量組、蒙成藥扎沖十三味丸高劑量組、生藥扎沖十三味組等4組.實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，后在恒溫清潔房間內(nèi)飼養(yǎng)2周，每天記錄大鼠的基本情況.1.2.2 動(dòng)物稱(chēng)重、給藥劑量、藥物配制方法、給藥方法、喂養(yǎng)、觀(guān)察及處死1.2.2.1 稱(chēng)重及計(jì)算動(dòng)物給藥劑量 將每只SD 大鼠使用電子天平進(jìn)行體重測(cè)量，根據(jù)人民衛(wèi)生出版社《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［2］得出大鼠用藥量約是成人用藥量的6倍，但是前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本研究沒(méi)有設(shè)計(jì)低劑量組.即：中劑量組用藥量為0.432 g·kg-1，高劑量組（最大耐受量）為

10.80 g·kg-1，生藥組劑量同于高劑量組，為10.80 g·kg-1.

1.2.2.2 藥物配制方法 蒙成藥扎沖十三味丸以蒸餾水配制研磨、溶解.生藥組按照蒙成藥扎沖十三味丸的組方稱(chēng)取生藥1080 g，磨碎、混勻，用1000 mL蒸餾水溶解（劑量約1.08 g/mL），放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2.3 給藥方法 按大鼠體重計(jì)算藥量，使用專(zhuān)業(yè)灌胃針每日定時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行藥物灌注一次，連續(xù)給藥21天.將正常對(duì)照組以等同劑量蒸餾水進(jìn)行灌胃.

1.2.2.4 喂養(yǎng)及觀(guān)察 將SD大鼠在恒溫清潔狀態(tài)下進(jìn)行飼養(yǎng)，每天定時(shí)喂食并觀(guān)察一般情況、中毒反應(yīng)及死亡情況.

1.2.2.5 處死 在第22天采取腹主動(dòng)脈取血的方法將其處死.

1.3 心率和心電圖的檢測(cè)

灌胃給藥后第21天采用10%的水合氯醛麻醉后，在大鼠的四肢分別插入一根注射針頭，然后將導(dǎo)線(xiàn)與大鼠四肢連接后使用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)引導(dǎo)出導(dǎo)聯(lián)心電圖，觀(guān)察大鼠心率和心電圖的變化.

1.4 血清LDH、AST和α-HBDH的檢測(cè)

提取血液離心后，取血清，采用Mindray MR-96A 酶標(biāo)儀進(jìn)行雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè).嚴(yán)格按照試劑及儀器設(shè)備說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作.在EXCEL工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度（OD）值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，并按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值.

1.5 組織病理學(xué)觀(guān)察

心臟離體后迅速放入4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定，后常規(guī)制片、HE染色.光學(xué)顯微鏡觀(guān)察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)的變化.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn).對(duì)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)使用xˉ±s進(jìn)行描述；各組樣本均數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn).P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示存在顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組大鼠在用藥21天內(nèi)出現(xiàn)不同的反應(yīng).見(jiàn)表1.

表1 各組大鼠一般情況Tab.1 General condition of rats in each group

2.2 心率及心電圖

正常對(duì)照組及中劑量組大鼠心律齊，呈竇性心律，心率在每分鐘320～500次之間，但中劑量組偶有ST段改變；高劑量組和生藥組大鼠與正常對(duì)照組相比較，心率降低（P＜0.01），見(jiàn)表2，高劑量組大鼠心率在每分鐘150～440次之間，心律不齊，心電圖顯示QRS波形提前出現(xiàn)，寬大畸形.生藥組大鼠心律不齊，每分鐘75～390次，心電圖顯示P波消失，QRS波形寬大畸形，五個(gè)以上室性期前收縮連續(xù)出現(xiàn).

表2 各組大鼠的心率及LDH、AST、α-HBDH在各組的水平（xˉ±s）Tab.2 Heart rate and LDH，AST and α-HBDH levels in each group of rats（xˉ±s）

2.3 生化指標(biāo)結(jié)果

2.3.1 血清乳酸脫氫酶（LDH）水平 與正常對(duì)照組血清LDH水平比較：中劑量組水平略有降低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組及生藥組水平均升高，均存在顯著性差異（P＜0.01）.見(jiàn)表2.

2.3.2 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平 與正常對(duì)照組血清AST水平比較：中劑量組水平略有升高，但二者之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；高劑量組及生藥組水平均升高，具有顯著性差異（P＜0.01）.見(jiàn)表2.

2.3.3 血清α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）水平 與正常對(duì)照組血清α-HBDH水平比較：中劑量組、高劑量組及生藥組水平均有所降低，且均存在顯著性差異（P＜0.05）.見(jiàn)表2.

2.4 臟器系數(shù)

與正常對(duì)照組臟器系數(shù)相比較：中劑量組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；高劑量組大鼠的心臟、肝臟和腎臟的臟器系數(shù)水平升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生藥組大鼠的心臟、肝臟及腎臟的臟器系數(shù)均有不同程度的升高，均具有顯著性差異（P＜0.01）.見(jiàn)表3.

表3 各組大鼠的臟器系數(shù)（xˉ±s）Tab.3 Organ coefficient of each group of rats（xˉ±s）

2.5 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

正常對(duì)照組及中劑量組心臟在細(xì)胞形態(tài)方面未見(jiàn)異常（圖1，圖2）.高劑量組部分橫斷心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)粉染顆粒樣物質(zhì)，甚至形成空泡（圖3）.生藥組大部分心肌細(xì)胞腫脹，染色明顯變淺，形成空泡狀，甚至個(gè)別心肌細(xì)胞肌纖維溶解（圖4）.

3 討論

扎沖十三味丸中劑量組大鼠在用藥21天后未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，心率、心電圖正常，生化指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)異常，說(shuō)明中劑量安全可靠.高劑量組和生藥組在用藥21天后均出現(xiàn)一般中毒反應(yīng)，且均出現(xiàn)心率降低、心律不齊和室性期前收縮等表現(xiàn).有學(xué)者認(rèn)為可能是由于制草烏炮制不當(dāng)造成［3-4］，制草烏內(nèi)含有劇毒成分烏頭堿.有研究表明［5-6］，烏頭堿中毒后由于副交感神經(jīng)興奮，可導(dǎo)致流涎增多；亦可出現(xiàn)唇舌及四肢發(fā)麻、言語(yǔ)困難、心律不齊等癥狀；心電圖顯示頻發(fā)多源性期前收縮，室性心動(dòng)過(guò)速及房室傳導(dǎo)阻滯等變化.研究提示［7］，烏頭堿對(duì)心臟的毒性作用機(jī)制可能是由于其直接作用于心臟后使心肌細(xì)胞膜上的Na+-K+ATP活性降低，Na+通道開(kāi)放，Na+向內(nèi)流動(dòng)速度增加，使細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，K+濃度降低，促進(jìn)細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生高頻異位節(jié)律［8-9］.高劑量組和生藥組大鼠的中毒反應(yīng)、心率和心電圖的改變符合烏頭堿中毒的表現(xiàn).

研究表明［10］，當(dāng)病毒和細(xì)菌感染、中毒及腫瘤等造成心肌損害時(shí)，心肌細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，LDH、AST易漏出到細(xì)胞外致使其水平升高.本研究中生藥組和高劑量組檢驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)血清LDH、AST濃度水平升高，中劑量組血清LDH 水平未見(jiàn)明顯改變.王永田等［11-12］發(fā)現(xiàn)藥物中毒后，LDH、α-HBDH、CK、CKMB 及AST 的檢測(cè)可以作為確診心肌損傷的重要方法.本研究中劑量組、高劑量組及生藥組血清α-HBDH水平均不同程度降低，理論上講，細(xì)胞損傷后，酶原大量釋放，α-HBDH水平應(yīng)該上升，本研究中各組血清α-HBDH水平均降低，這與Preus M［13］的研究結(jié)果相一致，α-HBDH降低機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究探討.

臟器系數(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中重要的觀(guān)察指標(biāo)，其變化可反映毒物對(duì)該臟器的毒性綜合作用，從而幫助對(duì)內(nèi)臟器官的功能狀態(tài)和病變的性質(zhì)等進(jìn)行判斷.臟器系數(shù)升高常表明臟器發(fā)生增生、水腫等病理改變，其降低常提示臟器萎縮或退行性等病理改變［14］.生藥組和高劑量組大鼠心臟的臟器系數(shù)均增大，組織學(xué)觀(guān)察主要因?yàn)樾募〖?xì)胞發(fā)生了水腫等改變引起.目前，扎沖十三味丸中毒對(duì)心臟損害的機(jī)制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)心臟缺血或缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)缺氧、代謝產(chǎn)物的蓄積和跨膜蛋白功能的喪失可導(dǎo)致心肌水腫等損傷.

通過(guò)心率、心電圖、生化指標(biāo)及形態(tài)學(xué)觀(guān)察等指標(biāo)結(jié)果顯示，其中生藥組的毒性要重于蒙成藥；故認(rèn)為制草烏等炮制不規(guī)范導(dǎo)致生藥組中烏頭堿含量過(guò)高，所以在一定程度上可能與心肌組織中烏頭堿含量有關(guān).