響應(yīng)面法優(yōu)選黃芩苷水提工藝

翟陽 趙渤年

摘 ? ? ?要：為了優(yōu)選黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用了響應(yīng)面分析法，以黃芩苷含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選黃芩藥材中黃芩苷的水提工藝參數(shù)。結(jié)果最佳水提工藝參數(shù)為提取時(shí)間2.25 h，料液比57 mL/g，提取次數(shù)2次。優(yōu)選的工藝合理可行，提取效率高，可作為黃芩中黃芩苷的水提工藝，更適合于臨床實(shí)際需求。

關(guān) ?鍵 ?詞：黃芩苷;響應(yīng)面法;水提工藝;含量測定

中圖分類號(hào)：R284.2 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ?文章編號(hào)： 1671-0460（2020）02-0349-04

Abstract： To optimize the extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis， on the basis of single factor experiment， the response surface analysis was used to optimize the extraction parameters of baicalin from scutellariabaicalensis with the baicalin content as the evaluation index. The optimum water extraction process parameters were determined as follows： the extraction time 2.25 h， material-to-liquid ratio 57 mL/g， and extraction times 2 times. The optimized process is reasonable and feasible. It can be used for the water extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis and it is more suitable for clinical practice.

Key words： Baicalin; Response surface method; Water extraction technology; Content determination

中藥黃芩最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬于唇形科植物，呈性寒，味苦，有清熱、瀉火、止血之功效，黃酮類和多糖類以及揮發(fā)油等是黃芩的主要化學(xué)成分[1]，其中黃芩苷為黃芩主要有效成分，藥理作用廣泛，主要包括抑菌作用、抗腫瘤作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化作用、抗炎作用、抗病毒作用等[2-7]。

目前黃芩苷提取工藝主要有電磁裂解提取、超聲提取、微波提取、乙醇回流提取等方式，但相比而言水提法成本低、安全性高，普遍性廣、實(shí)用性好，且與傳統(tǒng)中醫(yī)用藥方法相契合[8-10]。

提取工藝的參數(shù)優(yōu)化通過響應(yīng)面法和正交設(shè)計(jì)法均可實(shí)現(xiàn)，但是響應(yīng)面法能夠以圖形的形式將自變量與因變量之間的函數(shù)關(guān)系表現(xiàn)出來，具有數(shù)據(jù)直觀明確、更易于發(fā)現(xiàn)最佳工藝、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采取響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩藥材中黃芩苷的水提工藝[11]。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

FW-80高速萬能粉碎機(jī)（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）;BP211D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;VS-1300-U 型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰工空技術(shù)有限公司）;Molgene 1820D摩爾基因型純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司公司）;德國默克密理博Milli-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)（南京科麟得科學(xué)儀器有限公司）;Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;KDM-A控溫電熱套（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 ?試劑

磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）;甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，色譜純）;高效液相色譜用水為超純水。

1.3 ?試藥

黃芩藥材購自同仁堂（批號(hào)：20180712，產(chǎn)地：內(nèi)蒙，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究院鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根），經(jīng)含量測定質(zhì)量合格[12];黃芩苷（批號(hào)：110715-200815，中國藥品生物制品鑒定所）。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?黃芩苷的含量測定

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相;檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 ?L。理論塔板按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500[12]。

2.1.2 ?樣品溶液的制備

（1）對照品溶液的制備 ?精密稱取黃芩苷對照品0.6 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

（2）供試品溶液的制備 ?取干燥黃芩藥材，粉碎至中粉，精密稱定0.5 g，按照試驗(yàn)條件加入一定比例的水，回流提取，放冷，濾過，濾液置于100 mL容量瓶中，用少量水粉刺洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 ?線性關(guān)系考察

精密吸取2、4、6、8、10、20 μL的對照品溶液依次注入液相色譜儀，測定，得回歸方程：y =133 691x-2 507.4，r2 =0.999 7結(jié)果表明，黃芩苷在0.12～1. 20 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取10μL的黃芩苷對照品溶液，接連進(jìn)樣6次，測定，RSD值為1.11%，證明儀器精密度良好。

2.1.5 ?重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定黃芩中粉0.5 g，平行6份，制備供試品溶液，測定，RSD值為1.79%，證明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一定量供試品溶液分別在第0，2，4，8，12，24 h注入液相色譜儀，測定，結(jié)果黃芩苷峰面積值RSD值為0.69%，證明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 ?加樣回收試驗(yàn)

精密稱定黃芩中粉0.5 g，平行5份，回流提起，分別精密移取提取液1 mL（黃芩苷0.085 5 mg/mL）分別精密加入黃芩苷對照品溶液1 mL（黃芩苷0.085 mg/mL），制備供試品溶液，測定，計(jì)算得平均回收率為97.23%，RSD為2.17%。

2.2 ?水提工藝的響應(yīng)面法優(yōu)選

2.2.1 ?響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

（1）設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次數(shù)（C， 次）為黃芩苷水提工藝中的自變量，進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃芩苷的提取率為因變量，進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，其中1、2、9、10、12為中心試驗(yàn)，3、4、5、6、7、8、11、13、14、15、16、17為析因?qū)嶒?yàn)。

提取時(shí)間（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次數(shù)（C， 次）三個(gè)因素經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到提取率（Y）對三因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=16.97+0.20A+0.31B+0.20C-0.35AB-0.34AC+0.28BC-0.78A2-0.33B2-1.26C2

（2）模型建立及顯著性分析采用 Design- Expert 8.0.6 對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到黃芩苷提取參數(shù)回歸分析結(jié)果，如表2所示。

由表2黃芩苷參數(shù)回歸分析可知，擬合模型P=0.045 1<0.05，說明回歸模型已達(dá)顯著程度，失擬度P=0.675 3>0.05，表明未知因素對該試驗(yàn)影響較小，殘差均有隨機(jī)誤差引起。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.912 3，說明該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小。從F值來看，在所選因素范圍內(nèi)，料液比對黃芩苷提取率影響最大，提取時(shí)間、提取次數(shù)影響較小。交互項(xiàng)AB、AC、BC，P值均大于0.05，說明對黃芩苷提取率影響不顯著。二次項(xiàng)A2對提取率影響顯著（P<0.05），二次項(xiàng)C2對提取率影響極顯著（P<0.01），說明了各種水提工藝與黃芩苷提取率之間并不是簡單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。綜上所述，該模型擬合度較高，可用該模型描述各工藝與黃芩苷提取率之間的關(guān)系，可用該模型來合理推測黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝。

2.2.2 ?響應(yīng)面結(jié)果及分析

通過響應(yīng)面3D圖能直觀地看出各因素對提取率的影響，其中料液比對黃芩苷的提取率影響加大，提取時(shí)間與提取次數(shù)影響較小，從交互作用來看，料液比與提取次數(shù)的交互作用最為明顯，其次是提取次數(shù)與提取時(shí)間，最后是料液比與提取時(shí)間。通過對回歸模型求解方程，得出黃芩苷最佳水提工藝條件為：提取時(shí)間2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次數(shù)2.12次。此條件下黃芩苷的理論提取率為17.103 7%（圖1-6）。

2.2.3 ?驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼鎸?shí)性、可靠性、可行性，進(jìn)行以下驗(yàn)證試驗(yàn)：精密稱定同一批次0.5 g黃芩中粉，平行三次，按照 “2.1.2.2”項(xiàng)下操作，黃芩苷提取率為16.97%，RSD值1.27%，與預(yù)測誤差僅為0.133 7%，證明通過響應(yīng)面法優(yōu)化的黃芩苷水提工藝合理可靠。

3 ?討論

目前黃芩苷提取工藝種類豐富，如：電磁裂解提取工藝、超聲提取法、微波提取法等。這些提取方法雖然省時(shí)環(huán)保，但對儀器設(shè)備要求較高，并不符合實(shí)際生產(chǎn)生活需求。傳統(tǒng)中藥提取物多采用口服給藥的方式，但黃芩苷的提取多用各種溶度的乙醇作為溶媒[13-15]，無法直接給藥和用于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。水煎法是傳統(tǒng)中藥提取方法，適用范圍廣，安全系數(shù)高，操作簡便，經(jīng)濟(jì)成本低，更加適用于臨床實(shí)際需求。

目前優(yōu)化黃芩苷的水提工藝多采用正交設(shè)計(jì)法[16-18]，響應(yīng)面法鮮有報(bào)道，本次試驗(yàn)以黃芩苷的提取率為衡量指標(biāo)，在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對水提工藝中的提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)三個(gè)因素進(jìn)行分析研究，優(yōu)選最佳提取工藝。得出黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝為：提取時(shí)間2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次數(shù)2.12次，此條件下，黃芩苷的提取率為17.103 7%，考慮到實(shí)際操作條件將工藝條件調(diào)整為提取時(shí)間2.25 h，料液比57 mL/g，提取次數(shù)2次。

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