雙功能聚合物基質(zhì)陽離子交換固定相的制備及其在離子色譜中的應(yīng)用

張 愷, 支明玉, 何 藝, 朱 巖, 曾秀瓊, 壽 旦

(1.寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 浙江 寧波 315212; 2.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 浙江 杭州 310018; 3.浙江大學(xué)化學(xué)系, 浙江 杭州 310028; 4.浙江省中醫(yī)藥研究院, 浙江 杭州 310007)

陽離子交換色譜(CEC)作為離子色譜(IC)的一個分支,已成為目前檢測陽離子型化合物的重要方法之一。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)的基體組成較為復(fù)雜時,陽離子交換色譜與傳統(tǒng)的原子吸收光譜法相比,是更加合適的分析方法[1]。同時,陽離子交換色譜能實(shí)現(xiàn)對不同價態(tài)的金屬離子以及有機(jī)胺類的定量分析,這也是其他陽離子檢測手段所不具備的能力。作為離子色譜的核心部件,離子交換色譜固定相一直以來受到了研究人員的廣泛關(guān)注。與陰離子交換固定相不同,用于現(xiàn)代離子色譜的陽離子交換固定相多采用羧酸、膦酸等弱酸性基團(tuán)作為離子交換功能基[2-5],其所需的修飾密度較大,對接枝、涂覆工藝手段具有較高的要求。近年來離子交換色譜固定相的進(jìn)展以陰離子交換固定相為主,新型陽離子交換固定相的報道比較少見,整體發(fā)展趨勢并不均衡。

“巰基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)修飾方法反應(yīng)條件溫和,具有高度的選擇性和反應(yīng)效率,被廣泛應(yīng)用于親水作用色譜以及混合模式色譜等固定相的制備當(dāng)中。成曉東等[6]將不同比例的氨基和巰基化硅烷偶聯(lián)劑鍵合到硅球表面,再利用巰基與乙烯基膦酸進(jìn)行點(diǎn)擊修飾,得到正負(fù)電荷可調(diào)控的親水作用色譜固定相,應(yīng)用于多種極性化合物的分離;胡靜等[7]將半胱氨酸點(diǎn)擊修飾到乙烯基化580 nm粒徑硅球表面,得到亞微米親水作用色譜固定相,應(yīng)用于加壓毛細(xì)管電色譜中?！皫€基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)正交性好,且易于模塊化,使之非常適合于多元功能基的修飾,用于混合模式色譜。王曉歡等通過巰基化微球和苯乙烯型極性化合物間的“巰基-烯”反應(yīng),分別制備了反相/陽離子交換[8,9]以及反相/陰離子交換[10]混合模式固定相,應(yīng)用于多種色譜分離模式,并考察了極性化合物的保留機(jī)理;呂倩楠[11]將半胱氨酸點(diǎn)擊修飾到聚倍半硅氧烷微球,制備得到了反相/親水作用色譜固定相,應(yīng)用于中草藥中活性成分的分離;王照地等[12]在硅膠顆粒表面分別進(jìn)行C18鍵合以及C10-羧酸的點(diǎn)擊修飾,制備得到反相/親水作用色譜固定相實(shí)現(xiàn)了多種堿性藥物的高效分離。此外,Peng等[13]將硫代蘋果酸修飾到乙烯基硅球表面,制備得到了二元羧酸鍵合的新型弱陽離子交換固定相,首次將“巰基-烯”點(diǎn)擊修飾方法應(yīng)用到非抑制型離子色譜當(dāng)中。

二乙烯基苯型聚合微球與傳統(tǒng)的硅球和甲基丙烯酸型微球相比,能完全耐受強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性的淋洗液,因此完全滿足現(xiàn)代抑制型離子色譜非常嚴(yán)苛的兼容性要求,具有顯著的優(yōu)勢。不過,由于這種固定相基質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性很好,其化學(xué)衍生修飾方法較為有限。目前常采用傅克烷基化、酰基化的方法[14-18]對微球進(jìn)行改性,再做進(jìn)一步的接枝以得到離子交換填料,其反應(yīng)條件較為苛刻,步驟相對繁瑣,而且還會引入金屬離子催化劑的污染。近年來發(fā)展了惰性聚合物微球的“巰基-烯”的修飾方法[19,20]:使用含巰基的氨基化試劑在溫和的條件下處理二乙烯基苯型微球,使之表面的殘余雙鍵與巰基發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng),可以直接實(shí)現(xiàn)此類惰性聚合物微球的功能化;再通過簡單的“環(huán)氧-胺”修飾,即得到多種接枝型陰離子交換固定相。單純的“巰基-烯”修飾功能化密度較為有限,僅適用于容量較小的陰離子交換固定相。利用“巰基-烯”的自由基機(jī)理,以巰基化合物作為鏈轉(zhuǎn)移試劑進(jìn)行自由基聚合,是一種較為高效的接枝手段,被應(yīng)用于硅膠基質(zhì)的反相色譜[21]以及親水作用色譜[22]固定相中。本文在聚合物微球“巰基-烯”修飾方法的基礎(chǔ)上,使用不飽和羧酸和羧酸酐作為單體,巰基磺酸為改性劑,在乙基乙烯基苯-二乙烯基苯微球表面實(shí)現(xiàn)了“巰基-烯”聚合修飾,制備了含有羧基和磺酸基的高交換容量雙功能基陽離子交換固定相,將其應(yīng)用于離子色譜當(dāng)中,對其色譜分離能力色譜以及離子保留行為進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ICS-3000離子色譜儀(美國Thermo Fisher公司,配備有四元梯度泵、電導(dǎo)檢測池、CSRS300陽離子抑制器以及Chromeleon v7.2色譜工作站); Vario MICRO Cube元素分析儀(德國Elementar Analysensysteme公司); ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀(美國Thermo Fisher公司); SU8010掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); KQ-500DE超聲清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司); SHZ-D(M)循環(huán)水真空泵(河南予華儀器制造有限公司); BAO-50A鼓風(fēng)干燥箱(美國STIK公司); K-1959氣動泵(德國Knauer公司)。

2-巰基乙基磺酸鈉(MESANa, 98%)、丙烯酸(99%)、順丁烯二酸酐(99%),以及偶氮二異丁氰(AIBN, 98%)購自阿拉丁生化科技股份有限公司;甲基磺酸(MSA, 99%,購自ACROS試劑公司)用于配制色譜用淋洗液;乙腈(色譜純)購自Tedia試劑公司;實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率大于18.20 MΩ·cm的二次去離子水(GenPure Pro UV/UF超純水儀,美國Thermo Fisher公司)。色譜用標(biāo)準(zhǔn)樣品均用分析純試劑配制。

單分散聚合物微球乙基乙烯基苯-二乙烯基苯(EVB-DVB,交聯(lián)度55%,粒徑4.6 μm)通過兩步溶脹法制備,具體參考文獻(xiàn)[23-25]。

1.2 陽離子交換固定相的制備

1.2.1“巰基-烯”聚合修飾

以丙烯酸和順丁烯二酸酐作為聚合的單體材料,MESANa作為鏈轉(zhuǎn)移修飾改性劑對EVB-DVB微球進(jìn)行“巰基-烯”點(diǎn)擊自由基聚合。具體制備過程如下:首先配制溶解有1.44 g丙烯酸、1.96 g順丁烯二酸酐以及0.1 g AIBN的10 mL乙腈溶液作為單體溶液,以及溶解有一定量MESANa的10 mL水溶液。在30 mL玻璃反應(yīng)瓶中加入2.5 g EVB-DVB微球和單體溶液并充分混合均勻,隨后再加入MESANa水溶液并充分混合均勻?；旌弦和ǖ?dú)獬?超聲分散5 min并密封,隨后置于65 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)6 h。待反應(yīng)結(jié)束后,微球分別用乙腈、1%(v/v)MSA和純水充分洗滌,除去過量的游離聚合物,得到陽離子交換固定相,以濕餅狀態(tài)冷藏保存。若試樣需要進(jìn)行表征,則取少量,用乙腈充分洗滌后在60 ℃干燥箱中烘干。

圖1 陽離子交換固定相的制備過程

如圖1所示,制得的陽離子交換固定相具有雙功能基,分別是由丙烯酸-順丁烯二酸共聚物和MESA封端殘基。其中,固定相的弱陽離子交換部分由共聚物鏈的羧基組成,強(qiáng)陽離子交換部分來自于共聚物鏈末端的磺酸基。通過改變MESANa的初始加入量,對固定相的強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)比例進(jìn)行控制,以探究MESA殘基對固定相色譜性能的影響。分別制備了3種陽離子交換固定相,計作CE-1、CE-2以及CE-3。它們的MESANa初始加入量分別為丙烯酸和順丁烯二酸酐單體總量的3.8%、5.6%和7.5%(物質(zhì)的量分?jǐn)?shù))。同時,還制備了對照組固定相,其中未添加巰基改性劑,計作CE-R。

1.2.2色譜柱裝填

采用勻漿法對固定相進(jìn)行裝填,取約4 g(濕重)上小節(jié)中制備得到的固定相微球,分散于50 mL純水中,超聲均勻后傾入勻漿罐中;勻漿罐用純水補(bǔ)滿,擰緊固定后以30 mmol/L NH4Cl作為頂流液,氣動泵保持40 MPa壓力,將固定相裝入不銹鋼柱管中。除了對照組固定相采用200 mm×4.6 mm規(guī)格的柱管外,其余3種固定相均采用150 mm×4.6 mm規(guī)格的柱管。裝柱完成后,固定相用50 mmol/L MSA在1 mL/min的流速下沖洗凈化過夜,以便進(jìn)行色譜性能的測試。

1.2.3色譜條件

配制不同濃度的MSA作為淋洗液,在1 mL/min的流速下進(jìn)行色譜分離;進(jìn)樣量為25 μL;柱溫為30 ℃。

1.2.4交換容量的測定

CSO3H=S/MS×5 000

(1)

其中S為含硫量(%),MS為硫的相對原子質(zhì)量。固定相中的氧元素可認(rèn)為來源自羧基、磺酸基以及吸收的水分。以EVB-DVB微球的含氧量作為空白,排除水分帶來的干擾,則固定相的弱陽離子交換容量(μequiv/g)和固定相含硫量、含氧量滿足如下關(guān)系:

CCOOH=(O-1.5×S-OEVB-DVB)/MO×5 000

(2)

其中O和OEVB-DVB分別為固定相和EVB-DVB微球中的含氧量(%),MO為氧的相對原子質(zhì)量。EVB-DVB微球基質(zhì)和4種陽離子交換固定相的氮、碳、氫3種元素的含量由元素分析方法測定(見表1);試樣中的氧、硫兩種元素的含量比例則通過X射線光電子能譜(XPS)確定。假設(shè)固定相完全由氮、碳、氫、氧和硫5種元素構(gòu)成,可通過固定相的氧/硫比和其余元素的總含量計算出氧、硫兩種元素的含量,然后根據(jù)交換容量計算方法分別估算出固定相的強(qiáng)陽離子交換容量和弱陽離子交換容量(詳見表1)。

表1 陽離子交換固定相的元素含量以及估算的交換容量

EVB: ethylvinylbenzene; DVB: divinylbenzene; n.a.: not available.

圖2 固定相微球的掃描電鏡圖像

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡表征

使用掃描電子顯微鏡對EVB/DVB基質(zhì)微球和陽離子交換固定相進(jìn)行表征。如圖2所示,微球的粒徑在4.6 μm左右,單分散性良好;經(jīng)“巰基-烯”聚合修飾改性后(見圖2b),微球仍保持良好的單分散性和完整性,粒徑和表面形貌均沒有發(fā)生明顯的變化,這表明離子交換功能基以非常薄的形態(tài)均勻地鍵合在微球表面。

2.2 陽離子交換容量與分離能力的對比

根據(jù)1.2.4節(jié)方法估算得到陽離子交換固定相的強(qiáng)、弱陽離子交換容量。根據(jù)表1, CE-1, CE-2和CE-3 3種固定相具有比較接近的弱陽離子交換容量,均為3 500 μequiv/g左右。3種固定相交換容量的差異主要體現(xiàn)在強(qiáng)陽離子交換容量上,隨著巰基改性劑MESANa初始加入量的增加,固定相的含硫量由0.34%遞增至0.42%,相應(yīng)的強(qiáng)陽離子交換容量由53 μequiv/g增加至66 μequiv/g;作為對比,對照組固定相CE-R是采用自由基聚合直接接枝的弱陽離子交換固定相,其交換容量為1 600 μequiv/g左右,不足“巰基-烯”聚合修飾的二分之一。這說明巰基改性劑MESANa不但作為強(qiáng)陽離子交換功能基團(tuán)的載體,也能提高聚合的效率,提升固定相羧基的含量。

圖3 陽離子交換固定相的色譜圖對比

2.3 色譜性能表征與評價

2.3.17種無機(jī)陽離子的等度分離

圖4 7種無機(jī)陽離子的色譜圖

2.3.2離子保留模型

根據(jù)線性溶劑強(qiáng)度模型(LSSM)[26],離子在交換樹脂上的保留因子k的對數(shù)值與淋洗液中競爭離子濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系。在陽離子交換模式下,淋洗液濃度的對數(shù)值可等效為pH值,此時線性溶劑強(qiáng)度模型可表示為:

logk=C1+C2×pH

(3)

其中,C1、C2均為無量綱常數(shù)。相應(yīng)地,在二次項(xiàng)模型(QM)中,保留因子k的對數(shù)值與淋洗液pH值呈二次關(guān)系,可表示為:

logk=C1+C2×pH+C3×pH2

(4)

其中,C3為無量綱常數(shù)。

以2.3.1節(jié)中的7種陽離子為目標(biāo)離子,使用上述兩種模型對3種固定相的色譜保留行為進(jìn)行擬合。CE-1的線性擬合方程的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.979 9～0.984 7; CE-2和CE-3線性擬合方程的r2均在0.99以上。如圖5所示,固定相CE-1的色譜保留行為更加符合二次項(xiàng)模型;固定相CE-2和CE-3的色譜保留行為則與線性溶劑強(qiáng)度模型符合得很好(顯然也符合二次項(xiàng)模型)。在陽離子交換固定相中,由于H+會抑制羧基的解離,其有效交換容量會隨著淋洗液pH值的減小而減小。由于線性強(qiáng)度溶劑模型是將固定相交換容量作為定值近似處理的,使之在一定程度上與固定相的真實(shí)保留產(chǎn)生偏差。在擬合實(shí)驗(yàn)中,CE-1采用的是濃度較低的一組淋洗液(～15 mmol/L, pH 1.82),這與固定相的功能基的有效pKa值較為接近,因此交換容量變化程度較大,其色譜行為與線性溶劑強(qiáng)度模型偏離最明顯。這種現(xiàn)象也與基于IonPac CS12色譜柱的一項(xiàng)研究結(jié)果一致[27]。

2.3.3有機(jī)胺的色譜分離與保留行為

圖5 7種無機(jī)陽離子在固定相上的保留因子-淋洗液pH對數(shù)關(guān)系圖以及色譜模型的擬合

圖6 銨根離子、脂肪胺以及烷醇胺在CE-3上的保留因子-正辛醇/水分配系數(shù)對數(shù)關(guān)系圖

借助梯度淋洗模式,使用CE-3對7種無機(jī)陽離子和3種脂肪族胺進(jìn)行分離。如圖7所示,10種陽離子均實(shí)現(xiàn)梯度分離,與等度淋洗模式相比,分離時間可縮短至24 min,顯示出這種陽離子交換固定相具有很好的應(yīng)用價值。

圖7 10種陽離子在CE-3上的梯度分離色譜圖

2.4 固定相穩(wěn)定性評價

以CE-3為例,對其連續(xù)運(yùn)行超過1 200個柱體積,期間進(jìn)行9次進(jìn)樣,分離6種常規(guī)陽離子,考察交換容量(保留因子)、柱效(理論塔板數(shù))以及柱床(背壓)的穩(wěn)定性。6種目標(biāo)離子的保留因子k和理論塔板數(shù)的RSD值分別小于0.3%和1.7%,證明了功能基具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性;固定相色譜柱背壓變化也小于0.6%,證明了柱床良好的機(jī)械穩(wěn)定性。其余兩種固定相也能在各自的工作條件下維持穩(wěn)定的色譜性能,在數(shù)月中未見到交換容量損失和柱效降低。

3 結(jié)論

本文提出了基于“巰基-烯”聚合修飾的聚合物基質(zhì)陽離子交換固定相的制備方法。以丙烯酸和順丁烯二酸酐作為弱陽離子交換聚合單體,選用MESANa作為巰基改性劑提供強(qiáng)陽離子交換功能基,進(jìn)行巰基參與的自由基聚合接枝,可一步得到新型雙功能基陽離子交換固定相。該固定相具有良好的色譜分離性能,使用簡單的強(qiáng)酸淋洗液即可完成堿金屬、堿土金屬離子的基線分離;若采取梯度淋洗模式,可在24 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)無機(jī)陽離子和多種有機(jī)胺的高效分離。本文提出的巰基改性聚合修飾方法具有簡單、高效的特點(diǎn)。通過調(diào)節(jié)巰基改性劑的比例能夠?qū)崿F(xiàn)對固定相交換能力的調(diào)控,具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外,若能在“巰基-烯”聚合修飾的基礎(chǔ)上引入非功能性的親水性單體,有望提升固定相親水性,減少功能基脂肪鏈和固定相內(nèi)核對陽離子的非特異性作用,從而改善疏水性陽離子的峰形,進(jìn)一步提高固定相的柱效和分離能力。