一種聚合型弱陽離子交換/親水相互作用色譜固定相的制備及色譜性能

婁旭華, 左慧穎, 王 媛, 趙文杰

(河南工業(yè)大學化學化工學院, 河南 鄭州 450001)

隨著蛋白質組學、代謝組學、中藥現(xiàn)代化、環(huán)境毒理學等研究領域的迅速發(fā)展,強極性和親水性的小分子物質已成為分析化學和生命科學領域的重要研究對象。對于這些極性化合物,反相色譜往往不能提供合適的保留和分離選擇性,而正相色譜的流動相溶解性較差、毒性大,且與質譜不兼容[1]。親水相互作用色譜(HILIC)作為一種新型的色譜分離類型,克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過程中的不足,能夠提供與反相色譜截然不同的分離選擇性并與電噴霧離子源質譜具有很好的兼容性[2,3]。

按照Alpert[4]提出的觀點,HILIC的保留機制主要是依靠溶質在固定相表面親水基團吸附的“富水層”與流動相之間的分配,除此之外,溶質與固定相和流動相之間的相互作用力也影響著HILIC的分離性能,以至于不同結構HILIC固定相的保留性質表現(xiàn)出較大的差異[5,6]。通過優(yōu)化固定相功能化的親水基團,改變“富水層”的分布和調整溶質與固定相之間的相互作用力,進而獲得更好的分離選擇性,這已成為HILIC固定相的一個重要研究方向。采用共價鍵合、原子轉移自由基聚合、點擊化學等技術手段將離子液體[7-10]、氨基酸和小肽[11]、糖[12-17]、葫蘆脲[18-20]、弱陽離子交換[21-23]等功能基團作為色譜配體極大豐富了HILIC固定相的類型。弱陽離子交換/親水相互作用混合模式固定相是將含有羧基的功能基團鍵合在硅膠表面,對親水性的陽離子化合物表現(xiàn)出良好的分離性能,例如馮玉锜等組[24]通過“硫醇-烯”點擊化學反應將巰基乙酸鍵合到硅膠表面,得到高表面電荷和強親水性的固定相,對核苷、核酸堿和水溶性維生素具有良好的分離能力。白泉等[25]通過“炔烴-疊氮”點擊化學制備了3種弱陽離子交換色譜固定相,溶菌酶等6種蛋白質得到良好的分離。

受到硅膠本身比表面積和鍵合效率的制約,小分子鍵合相的官能團數(shù)量有限,親水性已經很難大幅提升,因此,發(fā)展親水性聚合物鍵合相,通過增加聚合物鏈的長度和改變聚合物鏈的組成,可提高分離材料的親水性和分離選擇性。目前,制備聚合物鍵合相主要有“從表面接枝(grafting from)”和“接枝到(grafting to)”兩種方法?！皬谋砻娼又Α狈椒╗26]是將反應活性以化學鍵的形式接枝到基體表面,然后在表面引發(fā)單體接枝聚合。該方法中分子體積小,易擴散至基體表面發(fā)生鏈增長反應,鍵合密度高,但得到聚合物的分子量分布較寬,均勻性差?！敖又Φ健狈椒╗27]是將預合成的聚合物通過具有反應活性的末端或側基與功能化表面的化學反應接枝到基體表面。該方法可較容易地控制聚合物的分子量及其分布,鍵合相有較好的規(guī)整度,但由于分子體積較大,存在空間位阻效應,使鍵合效率較低,鍵合量受限。

本文將氨基硅膠與聚乙烯馬來酸酐反應,首先制得聚乙烯馬來酸酐修飾硅膠,然后將殘余馬來酸酐水解得到一種新型的羧基功能化聚合物基HILIC固定相(Sil-PolyCOOH)。希望這種聚合物基固定相在能提供親水分配機理的同時,又可與溶質分子產生氫鍵、離子交換等多重作用力,進而提高分離選擇性。本文以核苷、核酸堿、糖類化合物為溶質探針,考察了固定相的色譜性能,通過考察流動相組成,離子強度和pH等因素對溶質因子保留的影響,探討了固定相的分離性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津SPD-10A系列高效液相色譜儀(Shimadazu,日本),包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、柱溫箱、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)和紫外檢測器。固態(tài)交叉極化/魔角旋轉核磁共振(13C CP/MAS NMR)測試儀為Bruker AVⅢ 600(Karlsruhe,德國);元素分析所用儀器為Vario EL Ⅲ元素分析儀(Elementar,德國);Malvern Zetasizer Nano-ZS90馬爾文納米粒徑電位分析儀(Malvern,英國)。

氨基球形多孔硅膠(粒徑5 μm,孔徑6 nm,比表面積160 m2/g)購自天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心。聚乙烯馬來酸酐(純度99%,相對分子質量105)購自美國Sigma-Aldrich公司。流動相乙腈和甲醇為色譜純,購自德國默克公司產品。核苷、核酸堿、糖類化合物及其他試劑均為分析純,購自百靈威科技有限公司。水純化自Milli-Q純水凈化系統(tǒng)(Billerica,美國)。

1.2 聚合物基色譜固定相Sil-PolyCOOH的制備

聚合物基色譜固定相Sil-PolyCOOH的合成路線見圖1。向250 mL三頸圓底燒瓶中加入4 g氨基硅膠、90 mL無水N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)和1 g聚乙烯馬來酸酐,于110 ℃下回流反應6 h后加入5 mL水,繼續(xù)反應2 h,反應液降溫至室溫,產物用砂芯漏斗抽濾,分別用30 mL水和30 mL甲醇洗滌。所得填料在80 ℃下干燥過夜,得到固定相Sil-PolyCOOH。

圖1 聚合物基弱陽離子交換/親水相互作用色譜固定相的制備過程

1.3 ζ-電勢測定

具體步驟如下:取50 mg填料均勻分散于30 mL水中作為儲備液。分別配制pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.5的100 mmol/L HCOONH4作為緩沖鹽。取1 mL填料儲備液,加入2 mL緩沖液,然后用水稀釋至10 mL,充分混合均勻后立即轉移至電位分析儀的測量池進行測定。

1.4 色譜柱裝填

取2.5 g Sil-PolyCOOH填料,加入40 mL四氯化碳,超聲分散5 min,倒入40 mL勻漿罐中。用填裝機在50 MPa恒壓下將勻漿液推入不銹鋼色譜柱管(150 mm×4.6 mm),使用甲醇作為頂替液,頂替15 min。

2 結果與討論

2.1 固定相的制備與表征

聚乙烯馬來酸酐的主鏈分子上有多個馬來酸酐基團,可以通過親核取代反應將聚乙烯鏈鍵合在氨基硅膠表面,接下來將聚合物鏈上殘余的馬來酸酐水解得到一種含有羧基的色譜填料,采用“一鍋法”進行了兩步連續(xù)固液反應。聚合物鏈通過多個“觸角”與硅膠發(fā)生鍵合反應,增強了固定相的穩(wěn)定性,另一方面,在聚合物鏈上延伸出多個羧基,增強了固定相的親水性。

圖2 固定相Sil-PolyCOOH的固體13C CP/MAS NMR譜圖

為了驗證聚乙烯馬來酸酐是否成功鍵合至硅膠表面,采用元素分析和13C CP/MAS NMR對固定相Sil-PolyCOOH進行表征,元素分析結果表明,該固定相含碳量為7.4%,與巰基硅膠(含碳量為4.5)相比含碳量有所增加。固體核磁結果如圖2所示,化學位移165和180的峰為酰胺鍵碳原子和羧基碳原子,化學位移10和21的峰為固定相上距離羰基較遠的碳原子和氨丙基硅膠上的碳原子,化學位移在30～50的一系列峰可歸屬為聚合物鏈及硅膠上距離羰基較近的碳原子。

使用電位分析儀對弱陽離子交換固定相Sil-PolyCOOH的表面電荷特性進行表征(見圖3),在pH逐漸增大的過程中,Sil-PolyCOOH材料表面電勢逐漸降低,在pH≥6的條件下,羧基全部電離,顯示出負離子特性,因此,固定相表面的電荷特性可通過調節(jié)pH值進行簡單的調控,進而調控固定相的分離機理。

圖3 Sil-PolyCOOH材料在不同pH條件下的ζ-電勢

2.2 固定相Sil-PolyCOOH色譜性能的評價

為了考察色譜固定相Sil-PolyCOOH的色譜性能,以胸苷(辛醇比lgP=-0.93)、尿苷(lgP=-1.98)、肌苷(lgP=-2.1)、腺嘌呤(lgP=-0.09)、2-氨基-腺嘌呤核苷(lgP=-1.24)、胞苷(lgP=-2.51)和胞嘧啶(lgP=-1.73)作為模型化合物對其進行簡單的評價。如圖4所示,乙腈/緩沖鹽(85∶15, v/v)體系下,7種核苷類化合物在Sil-PolyCOOH柱呈現(xiàn)良好的分離和較高的柱效(26 000～36 000塔板/米),相鄰兩色譜峰的分離度在0.8～2.5之間,除2-氨基腺嘌呤核苷的拖尾因子稍大(1.32)外,其他色譜峰的拖尾因子介于0.85～1.2之間,色譜峰對稱性良好。

圖4 核苷和核酸堿類化合物在Sil-polyCOOH柱上的分離

2.2.1流動相水含量對固定相Sil-polyCOOH保留行為的影響

為了進一步研究色譜固定相Sil-PolyCOOH的保留行為,改變流動相中的水含量(15%～40%),考察上述溶質保留的變化規(guī)律。研究水含量影響的過程中,水相中乙酸銨濃度保持為15 mmol/L不變(pH=3.3)。如圖5所示,隨著流動相中水含量(CB)的增加,溶質的保留因子(k)逐漸減弱,符合親水作用色譜的典型保留特性。然而,各個溶質的流出順序與他們的辛醇比值并不一致,說明在親水分配機理的同時,固定相與溶質之間還存在氫鍵、酸堿作用等吸附作用力。

圖5 流動相中水含量對核苷和核酸堿保留的影響

通過考察流動相中水含量與溶質保留的定量關系,可判定溶質在固定相上的分配或吸附保留機制,用來表征分配作用的模型為:

lgk=lgkw-Sφ

(1)

k表示保留因子,kw是僅以弱洗脫溶劑(如乙腈)為流動相時溶質的保留因子,φ是流動相中強洗脫溶劑(水)的體積分數(shù),S是線性回歸的斜率。

用來表征吸附機理的模型為:

lgk=lgkB-(As/nB)lgNB

(2)

kB是僅以強洗脫溶劑水為流動相時溶質的保留因子,AS和nB分別為溶質分子和水分子在固定相表面所占的橫截面積(m2),NB為流動相中水的摩爾分數(shù)。

由表1可知,基于分配模型,7個極性化合物的回歸系數(shù)為0.947～0.987;基于吸附模型,7個化合物的回歸系數(shù)為0.839～0.973。因此可以推測溶質在Sil-PolyCOOH上的保留并非由單純的分配或吸附機理所控制。頂替吸附-液相相互作用模型可更全面表征溶質、溶劑和固定相之間的相互作用,其模型為:

lnk=a+blnCB+cCB

(3)

其中a是與溶質的摩爾體積、溶質和固定相及流動相之間的作用能相關的常數(shù),b是與分析物和固定相之間的直接作用相關的系數(shù),c是與溶質和溶劑之間的作用能相關的系數(shù),CB是含水量。

使用上述保留模型分別對7個化合物容量因子進行線性回歸,結果如表1所示?；陧斕嫖?液相相互作用模型,7個化合物的回歸系數(shù)為0.964～0.995。

上述結果表明,在HILIC模式下,弱陽離子交換色譜固定相對極性化合物的保留并不僅僅取決于分析物在固定相表面富水層和流動相之間的分配,同時受分析物與固定相之間的氫鍵作用、靜電作用等多種作用力的影響。

表1 基于保留模型(1)、(2)和(3)的線性回歸系數(shù)

kw: retention factor of analytes using acetonitrile as the mobile phase;S: slope;R2: correlation coefficient;kB: retention factor of analytes using water as the mobile phase;AS: the cross-sectional area of analytes on the surface of the stationary phase;nB: the cross-sectional area of water molecules on the surface of the stationary phase;a,b, andc: constants.

圖6 (a)流動相中緩沖鹽濃度和(b)pH對模型化合物保留的影響

2.2.2鹽濃度和pH值對固定相Sil-polyCOOH保留行為的影響

在HILIC模式下,流動相中緩沖鹽的濃度對極性化合物,尤其是離子型化合物的保留行為產生重要影響,通過調控分析物在流動相和固定相表面富水層之間的分配以及分析物與固定相之間的電荷作用等可調節(jié)極性分析物的保留性質和選擇性。為了研究鹽濃度對固定相保留性質的影響,保持流動相中乙腈含量為85%,乙酸銨的濃度為5～25 mmol/L。隨著流動相中鹽濃度的增加,緩沖鹽會向固定相表面富水層遷移,增加富水層的親水性,從而增強極性溶質的保留。如圖6a所示,對于胸苷、尿苷、肌苷和胞苷,隨著流動相中鹽濃度的增加而增加,說明其保留服從分配機理,同時其流出順序與其辛醇比數(shù)值變化一致。而對其他3種溶質,保留值隨著流動相中鹽濃度的增加而稍微減少,這可能由于隨著鹽濃度的增加,固定相與溶質之間的氫鍵作用受到削弱所致。

流動相的pH值影響著離子型化合物的電離,進而改變其保留特性。為了研究pH值對溶質保留行為的影響,在pH值3～8范圍內考察7種分析物保留因子的變化。流動相中乙腈含量為85%,乙酸銨濃度恒定為15 mmol/L, pH值分別為3.3、4.1、4.8、6.0、7.2和8.0。如圖6b所示,隨著pH值增加,固定相表面的羧基電離程度增強,對胸苷、尿苷、肌苷和胞苷來說,其與固定相之間的靜電和氫鍵作用增強,因此其保留值呈現(xiàn)先上升后逐漸穩(wěn)定的變化規(guī)律,而對于胞嘧啶來說,隨著流動相pH值的升高,其質子化能力降低,與固定相之間的靜電和氫鍵作用隨之降低,從而呈現(xiàn)先降低而后逐漸穩(wěn)定的變化規(guī)律。綜上所述,在HILIC模式下,極性分析物在固定相Sil-polyCOOH上的保留受其在流動相和固定相表面富水層之間的分配作用和離子交換作用共同的影響。

2.2.3柱溫對溶質在固定相Sil-polyCOOH保留行為的影響

柱溫作為影響分析物在固定相上保留的重要因素,直接影響擴散系數(shù)、流動相黏度和分析物從流動相轉移至固定相的熱力學參數(shù)。柱溫對溶質保留值的影響可通過范特霍夫方程(van’t Hoff equation)表示。

(4)

其中,ΔH和ΔS分別為分析物在色譜系統(tǒng)中轉移的摩爾焓(kJ/mol)和摩爾熵(J/(mol·K)),φ=VS/V0(Vs為色譜柱中固定相的體積,V0為色譜柱死體積),R為氣體常數(shù),T為熱力學溫度。為了研究色譜固定相Sil-polyCOOH柱的熱力學特性,在20～60 ℃考察了7個模型化合物的lnk值與1/T的關系。如圖7所示,7個極性分析物的保留值隨著溫度的升高而逐漸減低,模型化合物的lnk值與1/T呈現(xiàn)良好的線性關系(相關系數(shù)r2為0.994 2～0.999 8),表明在該范圍內隨著溫度的改變,固定相的保留機理基本不變。

圖7 模型化合物在Sil-polyCOOH柱上的范特霍夫曲線

此外,7個模型化合物均呈現(xiàn)負焓值(見表2),說明分析物從流動相轉移至固定相是一個放熱的過程,證明了吸附作用對分析物保留的貢獻度小,即模型化合物的分離主要基于分配機理。

2.3 糖在固定相Sil-PolyCOOH上的分離

幾種單糖混合物包括鼠李糖(lgP=-1.56)、阿拉伯糖(lgP=-2.91)、果糖(lgP=-1.55)、半乳糖(lgP=-2.43)和葡萄糖(lgP=-3.24)在Sil-poly-COOH柱上也得到了良好的分離(見圖8)。由于鼠李糖上的一個羥基被甲基取代造成其疏水性的增加,所以第一個流出。盡管阿拉伯糖辛醇比更小,極性較強,但是其羥基個數(shù)較六碳糖少,與Sil-polyCOOH之間氫鍵作用較小,所以其保留比六碳糖小。果糖、半乳糖和葡萄糖的保留順序與其辛醇比大小一致,服從親水分配機理。因此,Sil-polyCOOH對糖的分離機理仍然是親水分配兼具其他吸附作用力。

表2 Sil-polyCOOH柱上7個模型化合物的熱力學參數(shù)

ΔH: enthalpy change; ΔS: entropy change.

2.4 百草枯和敵草快在固定相Sil-polyCOOH上的分離

百草枯(1,1′-二甲基-4,4′-聯(lián)吡啶二氯鹽)和敵草快(1,1′-亞乙基-2,2′-聯(lián)吡啶二溴鹽)均為聯(lián)吡啶類季銨鹽,屬于高效、廉價的非選擇性觸殺滅生型除草劑。但是這類除草劑的濫用會污染環(huán)境,尤其是百草枯毒性極大,一旦中毒,無有效解毒藥物。因為百草枯和敵草快是陽離子型分子,對它們的分析存在一定的困難,由于其為強極性、帶正電荷,以反相色譜分析時,需要添加離子對試劑[28],而一般的親水相互作用色譜又難以將其徹底分離[29]。本文使用自制的Sil-polyCOOH柱,以乙腈/15 mmol/L乙酸銨(75∶25, v/v)為流動相在5 min之內可將百草枯和敵草快基線快速分離(見圖9)。在增加流動相pH時,兩種溶質的保留逐漸增強,說明百草枯和敵草快在Sil-polyCOOH上的分離是一種弱陽離子交換/親水相互作用相結合的混合模式。

圖8 糖類化合物在Sil-polyCOOH柱上的分離

圖9 百草枯和敵草快在Sil-polyCOOH柱上的分離

2.5 固定相Sil-polyCOOH的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

以保留時間為指標,連續(xù)進樣10次,考察固定相的重現(xiàn)性。對核苷和核酸堿的RSDs值為0.08%～0.35%,糖類物質的RSDs值為0.05%～0.15%,使用有機溶劑/水(緩沖鹽)為流動相連續(xù)沖洗了10 000柱體積,柱效下降了5%,表明固定相Sil-polyCOOH具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

3 結論

利用簡單的親核取代反應,將強親水性的聚乙烯馬來酸酐“接枝到”硅膠表面上,然后將殘余的馬來酸酐水解,制備了一種弱陽離子交換HILIC固定相Sil-polyCOOH。元素分析、核磁共振和ζ電勢測量表明了聚合物鏈的成功鍵合。采用核苷、核酸堿、糖類化合物、百草枯和敵草快對其分離性能進行了評價,說明此固定相具有典型的弱陽離子交換/親水相互作用保留特性,在極性化合物分離中具有較好的應用潛力。