基于FlowJo 軟件生物信息學降維方法的小鼠骨髓造血干祖細胞流式分析

梁昊岳，張 森，于文穎，付偉超，董樹旭，趙軾軒，茹永新，高瀛岱

（中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學科學院血液學研究所），實驗血液學國家重點實驗室，國家血液病臨床醫(yī)學研究中心，天津300020）

0 引言

作為研究最多的組織干細胞類型之一，造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）能夠自我更新并產生體內的所有血液和免疫細胞。在不同遺傳背景的小鼠中，HSC 的活性似乎與壽命相關，穩(wěn)態(tài)條件下小鼠體內造血干祖細胞分化發(fā)育和免疫調控是當前科學研究的熱點[1-4]。HSC 能夠在接受輻照的移植小鼠體內自我更新并進行多系造血重建。因此，基于流式細胞術建立的小鼠骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）技術是通常用于檢查小鼠HSC 活性的主要檢測方法，被廣泛應用于小鼠骨髓造血干祖細胞生物學研究[5-8]。

以FACS Diva 和FlowJo 為代表的流式分析軟件可幫助研究者獲得細胞群體比例、平均熒光強度分析、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖等有效的實驗分析數(shù)據，發(fā)揮著重要的實驗支撐功能[9-12]。近期問世的FlowJo 分析方法在已有功能的基礎上，結合生物信息學原理，提供了多種科學、直觀的降維分析方法，具有廣闊的應用前景[13-15]。

本實驗應用流式細胞儀對小鼠骨髓造血干祖細胞進行分析。同時，對應用t-分布鄰域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding，tSNE）、統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）和流式自組織特征映射（flow selforganizing feature map，F(xiàn)lowSOM）分析所得結果與傳統(tǒng)流式分析結果進行比較，以期為小鼠造血干祖細胞流式分析提供一種新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL/6J（B6）同類系小鼠用于小鼠骨髓造血干祖細胞流式分析實驗。實驗小鼠來自中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學科學院血液學研究所）實驗動物中心。

1.2 實驗試劑

流式細胞分析所需抗體APC-Cy7 標記的小鼠Lineage markers 抗體、APC 標記的小鼠c-kit 抗體、PE-Cy7 標記的小鼠Sca-1 抗體、FITC 標記的小鼠CD34 抗體、PE 標記的小鼠CD16/32 抗體均購自美國eBioscience 公司。Cytometer Setup&Tracking beads、Rainbow beads、Accudrop beads 均購自美國BD公司。

1.3 儀器與設備

流式細胞儀（Becton，Dickinson and Company CantoⅡ，美國），離心機（Beckman，美國）。

1.4 供體小鼠骨髓細胞的分離獲取

（1）B6-Ly5.1 小鼠脫頸處死，在醫(yī)用酒精中浸泡消毒5 min 后從兩條腿上解剖出脛骨和股骨，將其放入裝有預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的6 或10 mm 培養(yǎng)皿中。（2）使用鋒利的手術剪刀從骨骼中移除肌肉。對于每根骨頭，使用5 ml注射器和25 號針頭吸取3 ml 冰冷的磷酸鹽緩沖電解液（phosphate buffer electrolyte，PBE）。將針頭插入骨頭的一端，然后將骨髓從小孔中取出放入5 ml 流式管中。（3）徹底混合細胞懸浮液，將細胞通過30～70 μm 尼龍篩網過濾器后放入新的5 ml 流式管中，以去除細胞團塊。用血細胞計數(shù)器或自動計數(shù)器計算有核細胞的數(shù)量。將細胞懸浮在冰上備用。

1.5 流式細胞染色及上機檢測

用PBE 將細胞濃度調節(jié)至每50 μl 約1×107個細胞。每50 μl 染色系統(tǒng)向細胞中加入抗體（APC-Cy7標記的小鼠Lineage markers 抗體，APC 標記的小鼠c-kit 抗體，PE-Cy7 標記的小鼠Sca-1 抗體，F(xiàn)ITC 標記的小鼠CD34 抗體，PE 標記的小鼠CD16/32 抗體），并在冰上孵育細胞60～90 min。孵育后，用2 ml PBE 洗滌細胞2 次。通過30～70 μm 的尼龍網過濾細胞。將細胞懸浮在適當體積的預冷PBE 中進行流式檢測。為了區(qū)分死細胞，在使用樣品進行流式檢測之前提前加入最終濃度為1 μg/ml 的DAPI（Pacific Blue 通道）。

1.6 分析方法

應用FlowJoTMv10.6.1 流式細胞分析軟件（購自美國BD 公司）對小鼠骨髓造血干祖細胞進行降維分析。

2 研究結果

2.1 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞分析結果

通過流式細胞檢測小鼠骨髓造血干祖細胞結果如圖1 所示。首先使用Lineage Cocktail markers 去除成熟血液細胞，再經c-kit+選出造血干祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC），結合Sca-1、CD34 和CD16/32 圈選出長周期造血干細胞（long term HSC，LT-HSC，CD34-LSK CD16/32-）、短周期造血干細胞（short term HSC，ST-HSC，CD34+LSK CD16/32-）和多能祖細胞（multipotent progenitor，MPP，CD34+LSK CD16/32+）。各流式圖中細胞分群特征明顯，流式門圈選準確，為后續(xù)生物信息學分析打下了基礎。

2.2 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞tSNE 分析

小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞tSNE 分析結果如圖2 所示，每個點對應一個單細胞，并根據熒光通道進行著色，（a）～（f）分別表征DAPI、Lineage markers、c-kit、Sca-1、CD34 和CD16/32 的表 達 水平。tSNE 分析將多維度顯示的造血干祖細胞各群以二維形式呈現(xiàn)出來，處于相近位置的細胞具有相近的抗原表達水平和相近的細胞類型。這種形式改變了常規(guī)流式分析中逐級圈門的方式，將各群細胞的抗原表達情況全面直觀地展示出來。由圖2 中可以看出，細胞群體中DAPI-細胞占絕大多數(shù)，表明細胞活性較好。Lineage markers 表達較低，c-kit 呈弱陽性表達，Sca-1也呈弱陽性表達，表明細胞群體主要為低分化的干祖細胞。CD34 表達以陽性為主，與ST-HSC（58.3%）和MPP（12.6%）所占細胞群比例相符。CD16/32 有少量陽性，與LT-HSC（22%）所占細胞群比例相符?？傮w來看，tSNE 分析結果很好地反映了細胞群體的流式分群和比例情況，所得結果直觀可信。

圖1 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞分析結果

圖2 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞tSNE 分析結果

2.3 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞UMAP 分析

小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞UMAP 分析結果如圖3 所示，每個點對應一個單細胞，并根據熒光通道進行著色，（a）～（f）分別表征DAPI、Lineage mar-kers、c-kit、Sca-1、CD34 和CD16/32 的表達水平。分析結果與tSNE 結果相近。UMAP 分析結果圖中細胞分為3 個群，LTHSC（22%）單獨成群，其CD34 和CD16/32表達呈陰性，與所占細胞群比例相符。STHSC（58.3%）和MPP（12.6%）細胞群呈連續(xù)狀態(tài)，CD16/32 陰性群為ST-HSC，陽性群為MPP，與所占細胞群比例相符。

2.4 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞FlowSOM 分析

如圖4（a）所示，UMAP 分析結果中紅色為LT-HSC 細胞群，紫色為ST-HSC 細胞群，綠色為MPP 細胞群。如圖4（b）所示，細胞群體經FlowSOM 分析分為8 組，熱圖顏色密度表示給定抗原的平均表達，經歸一化后形成熱圖。8 組細胞中DAPI、Lineage 以陰性為主，c-kit、Sca-1 以陽性為主，CD34 和CD16/32 陰、陽性群體各有分布，反映了LT-HSC、ST-HSC 和MPP 的分布情況，與tSNE 和UMAP 結果相近。如圖4（c）所示，每種顏色線條代表Flow-SOM 分析所得的一組細胞，折線圖反映了8 組細胞中6 個抗原的表達變化情況，其結果與圖4（b）反映的情況相一致。

如圖5 所示，100 個單細胞以抗原表達情況為依據，形成聚類分析結果。標識顏色越相近、所在位置越相近的細胞，其抗原表達和細胞類型越接近。著色的扇形標識表示該抗原表達強弱情況，扇形標識越大，該抗原表達越多。由圖5（c）可見，主要細胞群包括3 個，細胞比例最高的一群為ST-HSC（綠色），其CD34 表達為陽性，CD16/32 表達為陰性。細胞比例次之的為LT-HSC（紅色），其CD34 和CD16/32 表達均為陰性。細胞比例第三的為MPP（藍色），其CD34 和CD16/32表達均為陽性。聚類分析結果與3 種細胞的細胞群比例相符，呈依次降低關系（58.3%、22.0%、12.6%）。

圖3 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞UMAP 分析結果

圖4 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞FlowSOM 分析結果

圖5 小鼠骨髓造血干祖細胞流式細胞FlowSOM 聚類分析結果

3 討論

小鼠骨髓造血干祖細胞流式檢測原理主要包括LSK（Lineage/Sca-1/c-kit）、SLAM（signaling lymphocytic activation molecule）和SP（side population）3 種方法，分別以Lineage/Sca-1/c-kit、CD48/CD150 和Hoechst33342 為主要識別標志。本研究以LSK 方法為基礎，結合CD34 和CD16/32 標記LT-HSC、STHSC 和MPP 進行流式數(shù)據分析，為后續(xù)流式分選和小鼠骨髓造血干細胞移植實驗打下基礎。小鼠骨髓造血干細胞移植并檢測造血重建能力是研究造血干細胞干性的金標準，該實驗對研究造血干細胞的自我更新、多向分化、歸巢和發(fā)育等生物學功能有著十分重要的意義。因此，流式細胞檢測和數(shù)據分析對造血干細胞生物學研究發(fā)揮著舉足輕重的作用。

流式細胞儀數(shù)據分析常見軟件包括FlowJo、FACS Diva、FACS Sortware 等，可以提供經典的流式細胞表型、熒光蛋白、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖、胞內鈣動員、染色體核型、磷酸化蛋白分析、活性氧分析及微小顆粒物分析等實驗血液學研究必備的數(shù)據分析方法[16-17]。FACS Diva 和FACS Sortware 均可與流式細胞儀聯(lián)動使用，分別為BD LSRⅡ、LSRFortessa、CantoⅡ、AriaⅢ及Influx 等型號流式細胞儀分析及分選實驗提供軟件支撐。FACS Diva 界面設計友好，電壓調節(jié)、補償調節(jié)、圈門十分方便，但導出流式圖片功能有待改善。FACS Sortware 主要為Influx分選儀提供支持，具有自動輔助圈門的功能，避免流式門圈選重疊，造成分選混亂。FlowJo 是專為流式數(shù)據離線分析設計的軟件，以Excel 文件形式導出數(shù)據更加便捷，結合生物信息學降維分析，將傳統(tǒng)的逐級圈門流式分析方法進行降維分析，形成可視化的數(shù)據圖形，有助于發(fā)現(xiàn)新的細胞群體和獲得更為直觀的分析效果。與此同時，以FlowJo 為代表的流式數(shù)據分析軟件為白血病免疫分型、淋巴瘤分型、血液系統(tǒng)腫瘤微小殘留病及部分實體腫瘤檢測提供了科學的分析方法，有效地促進了臨床血液學和腫瘤生物學檢測技術的發(fā)展[18-19]?；诹魇郊毎g的不斷深入發(fā)展，流式數(shù)據分析方法研究也不斷向前發(fā)展，結合生物信息學方法，為多激光多色流式分析和高速高通量流式分選實驗奠定了基礎[20]。

本研究采用tSNE、UMAP 和FlowSOM 分析與傳統(tǒng)流式分析方式相比較的方法，分析流式細胞術檢測的小鼠骨髓造血干祖細胞。tSNE 和UMAP 依據不同的算法對流式數(shù)據進行降維處理，使圖形可視化水平更好。FlowSOM 對研究對象進行聚類分析，以樹狀圖的形式反映被測細胞間的相互關系和抗原表達水平。這3 種FlowJo 軟件分析功能所得結果反映了LTHSC、ST-HSC 和MPP 的分布情況，豐富了數(shù)據的表征形式，與傳統(tǒng)流式分析方式所得細胞群比例相符，印證了tSNE、UMAP 和FlowSOM 分析方法的可行性和穩(wěn)定性。本研究關注的小鼠造血干細胞流式分析是實驗血液學研究的重要基礎，但缺乏造血系統(tǒng)其他細胞如定向祖細胞及成熟細胞的流式分析，且與以熱圖為表征的聚類分析結合不夠緊密。在未來的研究中，將以小鼠為模式生物的髓系祖細胞（common myeloid progenitor，CMP）、粒細胞-巨噬細胞祖細胞（granulocyte-macrophage progenitor，GMP）、髓系-紅系祖細胞（myelo-erythroid progenitor，MEP）、單核細胞、淋巴細胞等造血細胞納入分析，將基于Flowjo 軟件平臺的生物信息學流式細胞分析研究推向深入。

綜上，流式細胞術與FlowJo 軟件生物信息學分析方法相結合，可以很好地檢測、分析小鼠骨髓造血干祖細胞各群分布和比例，反映群體細胞的抗原表達水平，對細胞進行分群和聚類，并且可以提供傳統(tǒng)流式分析方法所不具備的直觀視角，有助于造血干細胞生物學的研究發(fā)展，具有深遠的科研和臨床意義。