硒鎘伴生對富硒土壤柑橘生長及生理代謝的影響

孫協(xié)平 周廣文 羅友進(jìn) 韓國強 張玲玲

(1長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,重慶 408100;2重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所,重慶 401329)

硒(selenium,Se)是人和動物必需的微量元素,具有營養(yǎng)和解毒雙重生物學(xué)功能,被譽為生命保護(hù)劑,在提高人體免疫力和預(yù)防癌癥方面起著積極作用[1]。我國是農(nóng)業(yè)大國,但超過70%的國土面積處于缺硒水平,容易導(dǎo)致人體硒攝入不足,使得人體免疫力下降,引發(fā)各種病癥[2-3]。為了提高國民對硒的攝入量,富硒農(nóng)業(yè)孕育而生,即通過硒生物轉(zhuǎn)化方法,利用富硒地區(qū)豐富的硒資源或者通過根部施肥和葉面噴硒措施來發(fā)展種植業(yè),生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品,亦或通過喂食富硒飼料來發(fā)展養(yǎng)殖業(yè),生產(chǎn)富硒動物產(chǎn)品。

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展、礦產(chǎn)的開發(fā)和礦物廢料的利用,鎘(cadmium,Cd)已成為環(huán)境的主要污染物之一[4]。鎘對植物的毒害作用主要表現(xiàn)在抑制植物生長,降低作物產(chǎn)量,其對人體的毒害作用主要是通過人體進(jìn)食含鎘植物的可食部分而影響人體健康。研究指出硒與鎘存在一定的伴生關(guān)系,富硒地區(qū)存在重金屬污染的威脅[5]。羅友進(jìn)等[3]研究三峽庫區(qū)(重慶段)發(fā)現(xiàn),硒與土壤中的鎘、鉻、砷等均存在顯著正相關(guān)。低濃度硒能夠抑制重金屬的吸收起到拮抗作用,通過增加蛋白質(zhì)的積累(如提高谷?；っ富钚院徒档透彼嵫趸富钚?可減緩鎘毒害導(dǎo)致的活性氧脅迫;高濃度硒反而促進(jìn)重金屬的吸收起到協(xié)同作用[5-7]。

富硒地區(qū)土壤硒含量一般介于0.4～3.0 mg·kg-1之間,我國部分地區(qū)土壤屬于富硒土壤[5,8],但易被植物吸收的硒酸鹽、亞硒酸鹽、小分子有機(jī)硒等僅占土壤總硒量的0.4%～14.6%[9-11],其中植物有機(jī)硒的生物學(xué)功能遠(yuǎn)超過無機(jī)硒[12]。因此,富硒土壤中不一定能夠生產(chǎn)出富硒農(nóng)產(chǎn)品。人工強化富硒是目前生產(chǎn)富硒產(chǎn)品的主要途徑。如以聚硒植物檳榔青(Spondias pinnata)(硒的主要形態(tài)為硒代甲基半胱氨酸)改良土壤能夠連續(xù)幾年生產(chǎn)出富含有機(jī)硒的西蘭花和胡蘿卜[13]。柑橘是世界上栽培面積最廣、產(chǎn)量最大的果樹,發(fā)展富硒柑橘生產(chǎn)具有重要意義。本研究通過施用小分子有機(jī)硒(硒代蛋氨酸SeMet)模擬富硒土壤,分析柑橘在硒鎘伴生條件下的生長和生理變化,以期為富硒柑橘的安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以盆栽當(dāng)年嫁接的大雅柑橘(Citrus reticulataBlanco.Daya)為試驗材料,其砧木為資陽香橙(Citrus junosSieb.ex Tanaka)由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。塑料盆體積為10.0 L。

供試藥品L-硒代蛋氨酸(SeMet)和氯化鎘(CdCl2)均為分析純,成都化夏化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2015年8月在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)園的避雨棚中進(jìn)行。供試基質(zhì)為紫色壤土、草炭土以及珍珠巖,其體積比為10∶10∶1。篩選長勢較好、整齊一致的盆栽大雅幼苗進(jìn)行硒處理。根據(jù)前期試驗結(jié)果,即香橙砧木在2.0～4.0 mg·L-1硒處理下,植株的生長指標(biāo)及體內(nèi)抗氧化水平較高[14],本試驗設(shè)計盆栽土壤硒含量為3.0 mg·L-1。根據(jù)GB 15618 -1995[15]土壤二級污染界限,將土壤鎘含量設(shè)為0.6 mg·L-1。根據(jù)盆栽土壤體積、SeMet、CdCl2的分子量計算施用量,將試劑溶解于1.0 L 水中緩慢倒入盆中,使對照(control,CK)盆栽土壤硒含量為3.0 mg·L-1,而處理的盆栽土壤硒含量為3.0 mg·L-1、鎘含量為0.6 mg·L-1以模擬硒鎘伴生。試驗材料統(tǒng)一日常管理,238 d后,結(jié)束試驗,采集葉片并用液氮速凍,于-40℃冰箱儲存并用于相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長指標(biāo)和干重 每個處理選4～6株整齊一致的橘苗,洗凈帶回實驗室,測定株高、新梢總長度、新梢數(shù)量。新梢總長度為每個新梢長度的總和,新梢數(shù)量為當(dāng)年萌發(fā)的新梢個數(shù);測定后將植株分成根、莖、葉三部分,洗凈擦干后105℃殺青15～20 min,60℃烘干72 h 稱重。稱量各器官干重后裝袋儲存。

1.3.2 硒和鎘含量 硒和鎘元素采用原子熒光光度法測定,烘干樣品委托青島科標(biāo)檢測研究院有限公司測定。

1.3.3 硒和鎘富集系數(shù) 柑橘對硒/鎘的富集系數(shù)(biological concentration factor,BCF)定義為柑橘干物質(zhì)體內(nèi)硒/鎘的平均含量與土壤中硒/鎘含量的比值。按照公式計算:

式中,Ci代表柑橘干植物體內(nèi)硒/鎘平均含量(根據(jù)根、莖、葉硒/鎘濃度以及各器官干重計算);Cei代表土壤硒/鎘的含量(土壤硒/鎘含量除以土壤容重)。

1.3.4 硒和鎘轉(zhuǎn)運系數(shù) 柑橘對硒/鎘的轉(zhuǎn)運系數(shù)(translocation factor,TF)定義為柑橘葉片或莖的硒/鎘含量與柑橘根系硒/鎘含量的比值。按照公式計算:

式中,Cls代表柑橘葉片或莖的硒/鎘含量;Cr代表柑橘根系的硒/鎘含量。

1.3.5 葉綠素和過氧化氫(H2O2)含量 葉綠素和H2O2含量均采用丙酮提取法測定,具體參考蔡永萍[16]的方法。

1.3.6 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)物質(zhì)與酶 還原型抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)、氧化型脫氫抗壞血酸(ascorbic acid,DHA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽還原酶(glutathione peroxidase,GR)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbic acid peroxidase,APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydrogenation of ascorbic acid reductase,DHAR)均采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定,委托青島科標(biāo)檢測研究院有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個處理檢測4個重復(fù),利用Origin 8.5軟件作圖和數(shù)據(jù)分析,其中顯著性差異采用LSD,顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘生長的影響

由圖1可知,硒鎘伴生處理的株高為61.7 cm,富硒土壤(CK)為59.4 cm;硒鎘伴生處理的新梢總長度為90.4 cm,CK為98.6 cm;硒鎘伴生處理的新梢數(shù)量為7個,CK為8個。硒鎘伴生增加了大雅柑橘的株高,降低了新梢總長度和新梢數(shù)量,但均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05),說明硒鎘伴生對大雅柑橘的生長參數(shù)影響不顯著。

2.2 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘干重的影響

圖1 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘株高、新梢總長度、新梢數(shù)量的影響Fig.1 Effect of Se-Cd treatment on plant height,total new shoot length,new shoot number of Daya citrus in SeMet-enriched soil

由表1可知,CK的大雅根干重為12.2 g,硒鎘伴生處理的根干重為12.3 g;CK的莖干重為10.8 g,而硒鎘伴生處理下降至10.7 g;CK的大雅葉干重為7.7 g,而硒鎘伴生的葉干重為7.3 g。兩處理根、莖、葉的干重均未達(dá)到差異顯著水平(P＞0.05),表明硒鎘伴生對柑橘干物質(zhì)的積累影響不大。

表1 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘根、莖、葉片和總干重的影響Table1 Effect of Se-Cd treatment on root,stem,shoot,and total dry mass of Daya citrus in Se-enriched soil

2.3 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘硒和鎘含量的影響

由圖2-A可知,硒鎘伴生處理根、莖、葉的硒含量分別為16.7、0.5、3.2 mg·kg-1,較CK 分別增加9.5、0.1、1.2 mg·kg-1,增幅表現(xiàn)為根＞葉＞莖,其中根和葉的硒含量與CK 差異顯著(P＜0.05)。CK的柑橘鎘含量為0 mg·kg-1,而硒鎘伴生處理根、莖、葉的鎘含量分別為2.9、0.2、0.2 mg·kg-1(圖2-B),均顯著高于CK(P＜0.05),增幅也表現(xiàn)為根＞葉＞莖。說明富硒土壤硒鎘伴生條件下,鎘的存在促進(jìn)了硒的吸收,且鎘主要分布在根系中。

2.4 富硒土壤硒鎘伴生對大雅柑橘硒和鎘富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)的影響

由表2可知,硒鎘伴生處理顯著增加了硒的BCF(P＜0.05),而TF 則呈下降趨勢,其中兩處理硒的TF(stem/root)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。硒鎘伴生處理中鎘的BCF低于硒;但鎘的TF(leaf/root)低于硒,而TF(stem/root)高于硒。說明富硒土壤硒鎘伴生提高了硒的富集能力,卻降低了其轉(zhuǎn)運能力。

2.5 富硒土壤硒鎘伴生對大雅柑橘葉片色素和H2O2含量的影響

由表3可知,硒鎘伴生處理增加了大雅葉片葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量,分別較CK 高17.3%、18.6%、14.5%、15.2%,其中,葉綠素a、類胡蘿卜素和葉綠素a+b含量與CK 達(dá)到差異顯著水平(P＜0.05);硒鎘伴生處理葉片H2O2含量較CK顯著增加45.5%(P＜0.05)。說明硒鎘伴生促進(jìn)葉片色素合成,提高了H2O2含量。

2.6 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)物質(zhì)的影響

AsA和GSH是植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),在清除H2O2過程中起著重要作用。由圖3可知,硒鎘伴生處理的大雅柑橘葉片AsA含量較CK顯著增加8.6%(P＜0.05);GSH含量較CK顯著降低14.0%(P＜0.05);DHA含量較CK 增加10.0%,但未達(dá)到顯著水平(P＞0.05);GSSG含量較CK顯著降低7.0%(P＜0.05)。AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)比值是反映植物體內(nèi)抗氧化水平的重要參數(shù)之一,硒鎘伴生處理下,AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)比值均較CK 降低,且均未達(dá)顯著水平(P＞0.05)。由上可知,硒鎘伴生會影響AsA-GSH 氧化循環(huán),但總體抗氧化水平差異不顯著。

圖2 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘葉片、莖和根硒和鎘含量的影響Fig.2 Effect of Se-Cd treatment on Se and Cd contents of Daya citrus leaf,stem,and root in Se-enriched soil

表2 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘硒、鎘富硒系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響Table2 Effect of Se-Cd treatment on BCF and TFs of Se and Cd of Daya citrus in Se-enriched soil

表3 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘葉片色素和過氧化氫含量的影響Table3 Effect of Se-Cd treatment on pigment and H2O2 content in leaves of Daya citrus in Se-enriched soil

2.7 硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)酶活性的影響

由圖4可知,硒鎘伴生處理APX活性較CK顯著提高23.0%(P＜0.05),而GPX活性較CK顯著降低了13.0%(P＜0.05);硒鎘伴生處理的DHAR活性和GR活性較CK 分別顯著提高了58.0%、13.0%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明,大雅柑橘對硒鎘伴生逆境環(huán)境產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng),APX、DHAR、GR 酶活性顯著上升而GPX活性顯著下降。

3 討論

大量研究表明,鎘脅迫會抑制種子的萌發(fā)、植株的生長以及作物產(chǎn)量的形成[17]。鎘雖然不是植物的必需元素,但鎘對一些植物生長存在劑量效應(yīng),即在一定范圍內(nèi),鎘能促進(jìn)植物的生長。這在水稻、小麥、白菜等植物上已得到相關(guān)證實[18-19]。但植物對鎘存在耐受閾值,且因植物不同而存在差異,有研究表明柑橘屬于耐鎘植物[20]。本研究發(fā)現(xiàn)大雅柑橘在富硒條件下添加0.6 mg·L-1鎘并未顯著降低植株的生長,這也印證了上述觀點。

圖3 硒隔伴生對富硒土壤大雅柑橘葉片AsA、DHA、AsA/(AsA+DHA)、GSH、GSSG、GSH/(GSH+GSSG)的影響Fig.3 Effect of Se-Cd treatment on AsA、DHA、AsA/(AsA+DHA)、GSH、GSSG、GSH/(GSH+GSSG) of Daya citrus in Se-enriched soil

硒主要具有提高植物抗逆性、調(diào)節(jié)植物生物鐘、緩解重金屬脅迫等顯著作用[21],其生物功能不僅取決于硒濃度,而且與硒形態(tài)密切相關(guān)[22]。當(dāng)硒、鎘兩種元素同時存在于土壤中,兩種元素的含量及存在形態(tài)均是影響植物對硒鎘元素吸收的決定性因素[23]。大雅柑橘對硒的吸收富集能力遠(yuǎn)高于鎘,而在轉(zhuǎn)運載體方面,植物根系吸收SeMet可能需要硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的參與[24],而植物對鎘的吸收主要通過鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋[25-26],推測硒和鎘通過不同的通道進(jìn)入植物體。然而它們之間也存在一定的拮抗與協(xié)同作用,即適量濃度的硒能夠降低植物鎘含量,而當(dāng)硒提升到一定濃度會與鎘吸收有協(xié)同效應(yīng)[27]。本研究中,硒鎘伴生促進(jìn)了富硒土壤大雅柑橘對SeMet的吸收,提高了硒的BCF,表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。硒與鎘在大雅柑橘中主要儲存在根系,其次是葉片和莖,可知根部是兩者的主要儲存部位。這與沈瀟等[28]對核桃幼苗的研究結(jié)果相似,但也有一些植物吸收的鎘主要儲存到地上部[29],可見不同植物對鎘分配有一定的差異。

硒、鎘互為地球化學(xué)伴生元素,富硒地區(qū)也常伴隨重金屬污染。研究表明外源硒處理可通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)來緩解鎘毒害作用[7]。葉綠素是判斷鎘損傷的一個重要生理參數(shù)[30]。本研究結(jié)果表明,在富硒土壤中,硒鎘伴生處理顯著提高了大雅柑橘葉片H2O2含量,葉綠素含量也呈上升趨勢,這與柑橘對鎘脅迫有一定的耐受性有關(guān)。Khan 等[7]研究指出鎘脅迫下施用硒能夠增加GR和GPX活性以降低活性氧脅迫,進(jìn)而促進(jìn)植物生長。GPX和APX是清除H2O2的兩種主要酶類[31]。本研究中硒鎘伴生處理增加了APX活性,而降低了GPX活性,這可能與本試驗的土壤富含硒有關(guān)。外源硒處理能夠提高植物的AsA-GSH 循環(huán)效率,進(jìn)而提高其抗逆性[32]。Wu 等[33]研究表明施用外源硒能夠增加GSH和AsA含量,增加GR和DHAR活性,提高AsA-GSH 循環(huán)效率;施硒能夠提高香橙幼苗的生長,但不同形態(tài)硒對AsA-GSH 相關(guān)物質(zhì)含量和酶活性影響差異顯著[14]。本研究中,CK 較不添加硒的空白對照提高了AsA-GSH 相關(guān)物質(zhì)含量和酶活性(數(shù)據(jù)未提供),硒鎘互作處理增加了AsA和DHA含量,降低了GSH、GSSG含量以及AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)的比值。在AsA-GSH 循環(huán)中,

圖4 富硒土壤硒鎘伴生對富硒土壤大雅柑橘葉片APX、DHAR、GPX、GR活性的影響Fig.4 Effect of Se-Cd treatment on APX、DHAR、GPX、GR activities of Daya citrus in Se-enriched soil

GPX和DHAR 消耗共同的底物GSH 既可直接清除活性氧又能夠與鎘結(jié)合,進(jìn)而降低鎘的毒害[34]。因此可以解釋本研究中硒鎘互作處理消耗掉一部分GSH,進(jìn)而降低了GSH含量。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,硒鎘伴生對大雅柑橘生長指標(biāo)影響不顯著,但顯著提高了大雅柑橘對硒的富集能力,降低了硒的轉(zhuǎn)運系數(shù);硒鎘伴生提高了富硒土壤大雅柑橘葉片葉綠素含量,同時也顯著提高了H2O2含量,大雅柑橘通過調(diào)整AsA-GSH 氧化循環(huán)來維持機(jī)體的穩(wěn)定性。富硒土壤存在鎘脅迫威脅,但本試驗未對果實進(jìn)行相關(guān)研究,下一步應(yīng)明確富硒條件下鎘對柑橘生理參數(shù)、果實品質(zhì)影響的相關(guān)機(jī)理。