水稻短胚芽鞘基因SCP1的圖位克隆

王芳芳, 李宇翔, 梁宇航, 黃榮峰, 張玉瓊, 秦華*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230036; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081)

水稻是重要的糧食作物，作為半水生作物，其需要長期對抗低氧環(huán)境。水稻黃化苗的胚芽鞘能夠在低氧、無光環(huán)境下保護(hù)真葉，胚芽鞘通過伸長使真葉盡快接觸到氧氣和光，對于水稻幼苗的形態(tài)建成尤其重要[1]。胚芽鞘伸長受到諸多因素影響，植物激素在此過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。

水稻G蛋白α亞基(OsRGA1)參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長發(fā)育和耐逆性調(diào)控。osrga1突變體表現(xiàn)出植株矮化、小粒、穗直立、耐鹽、耐旱等表型[4-5]。近些年通過正向遺傳學(xué)等方法已克隆了8個(gè)OsRGA1等位突變體，其中d1突變體耐旱性比野生型顯著增強(qiáng)，在連續(xù)干旱14 d的條件下，d1突變體葉片依然呈現(xiàn)深綠的狀態(tài)，而野生型葉片早已萎蔫發(fā)黃[4]。sd58是OsRGA1的另一個(gè)等位突變體，與野生型相比，sd58突變體耐鹽性更強(qiáng)，進(jìn)一步研究表明，OsRGA1通過調(diào)控鹽脅迫條件下水稻體內(nèi)活性氧的積累來提高水稻的耐鹽性[5]。油菜素內(nèi)酯處理d1突變體，發(fā)現(xiàn)其葉夾角和胚芽鞘對油菜素內(nèi)酯敏感性降低，說明OsRGA1可能參與油菜素類固醇信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。除此之外，OsRGA1位于赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵組分SLR1的下游，參與GA 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。在水稻中敲除OsRGA1將抑制乙烯誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞死亡[8-9]，說明OsRGA1參與乙烯信號的傳遞。

乙烯作為一種重要的植物激素，在植株的生長發(fā)育及應(yīng)對外界環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[10],植物內(nèi)源乙烯含量主要取決于乙烯合成。乙烯的合成是以甲硫氨酸(Met)作為前體在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase, SAMS)的催化作用下生成SAM，SAM進(jìn)一步由1-氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS) 催化生成 5′-甲硫基核糖(5′-methylthiribose，MTR)和1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-amino-cyclopropanecarboxylic acid，ACC)，ACC在ACC氧化酶(ACO)作用下生成乙烯[11]，該步驟是整個(gè)乙烯合成過程的限速步驟[12]。已有研究表明，對乙烯合成基因的調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，水淹可以誘導(dǎo)OsACS1、OsACS5和OsACO1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)胚芽鞘生長和節(jié)間伸長來使機(jī)體免受損害[13-14]；OsEOL1和OsEOL2都編碼E3連接酶，均可與OsACS5相互作用，促進(jìn)其泛素化并加速其降解，從而降低體內(nèi)乙烯含量[15]。乙烯合成后，會通過相應(yīng)的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行傳遞，調(diào)控下游乙烯響應(yīng)基因，從而調(diào)節(jié)植株生長發(fā)育和應(yīng)對外界生物和非生物脅迫[16]。水稻中乙烯能夠抑制黃化苗根生長和促進(jìn)胚芽鞘伸長，即典型的“二重反應(yīng)”[17]。目前利用此“二重反應(yīng)”，對水稻黃化苗外源施加乙烯，已經(jīng)篩選和鑒定出很多乙烯響應(yīng)缺陷突變體，如mhz2[18]、mhz3[19]、GY1[20]、mhz4[21]、mhz5[22]、mhz6[3]、mhz7[2]等。但是對本身具有組成型乙烯表型即與內(nèi)源乙烯合成相關(guān)的突變體克隆較少。

雖然關(guān)于OsRGA1已有很多報(bào)道，但是該基因是否參與調(diào)控乙烯的合成還并不清楚。本研究利用水稻的乙烯“二重反應(yīng)”從本課題組構(gòu)建的水稻突變體庫中篩選到一個(gè)短胚芽鞘突變體(shortcoleoptile1，scp1)，其乙烯合成基因表達(dá)水平及乙烯釋放量均低于野生型，并且表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽和耐旱性。通過圖位克隆將突變基因定位在5號染色體上32.01 kb的區(qū)間內(nèi)，擴(kuò)增與測序發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)OsRGA1基因存在大片段缺失，從而導(dǎo)致該基因功能缺失。本研究結(jié)果為探究OsRGA1調(diào)控水稻乙烯合成，解析影響胚芽鞘的生長及耐逆性的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，有助于豐富水稻體內(nèi)乙烯合成的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料 野生型華占(Huazhan，HZ)與中花11(Zhonghua11，ZH11)水稻種子由本課題組保存，并創(chuàng)建3 000份以HZ為背景且用鈷誘變后的水稻突變體庫，篩選獲得scp1突變體，創(chuàng)建用于克隆SCP1基因的F2群體。d1突變體由中國科學(xué)院植物研究所種康研究員惠贈，并由本實(shí)驗(yàn)保存和繁殖。

1.1.2種植條件 用于農(nóng)藝性狀調(diào)查及基因定位的群體均在河北廊坊試驗(yàn)基地種植。用于鹽及干旱處理的幼苗種植于小方盒中土培，放在28 ℃溫室中(16 h光/8 h 暗)，生長14 d后分成三組，對照組正常條件下生長，鹽處理組加入適量150 mmol·L-1NaCl溶液生長7 d，干旱處理組保持干旱狀態(tài)生長7 d。用于觀察胚芽鞘表型的幼苗種植于放在水中的鐵絲網(wǎng)架上，保持水面剛好接觸到種子，放入28 ℃避光生長3～5 d左右。

1.1.3試驗(yàn)試劑 用于提取RNA的Trizol試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司； 用于反轉(zhuǎn)錄的試劑盒購自南京諾唯贊有限公司；用于熒光定量 PCR的SYBR Green Mix購自依聯(lián)軒生物科技有限公司，用于普通PCR的Mix購于擎科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要儀器及設(shè)備 用于培養(yǎng)水稻幼苗的GP-01光照培養(yǎng)箱購自湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；用于測定乙烯含量的GC-2014氣相色譜儀購自日本島津公司； Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自于美國伯樂公司；用于擴(kuò)增DNA序列的ETC-811 PCR儀購自于北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 突變體篩選

將輻射誘變的每一份突變體材料各取出30粒種子，37 ℃浸種24 h，選取萌動一致的種子種在不銹鋼網(wǎng)架上，放入塑料盒中，加水至液面剛接觸到種子，置于黑暗條件下，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，篩選出胚芽鞘較野生型過長或過短的突變體，用于后續(xù)研究。

1.3 乙烯的測定

在150 mL的透明玻璃小瓶中倒入50 mL 1/2 MS固體培養(yǎng)基[23]，待培養(yǎng)基冷卻后將已萌動的水稻種子均勻種在瓶子里，光照培養(yǎng)箱(28 ℃，光照16 h/黑暗8 h )生長3 d后用封口膜將瓶口密封，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，從每個(gè)小瓶中抽取1 mL氣體，用氣相色譜儀測定瓶內(nèi)乙烯含量[24]。

1.4 表型分析及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

將scp1突變體材料和野生型HZ浸水后放在37 ℃培養(yǎng)箱中，待萌動后，挑取萌動一致的種子種在不銹鋼網(wǎng)架上，暗培養(yǎng)3 d，觀察并統(tǒng)計(jì)胚芽鞘長度。選取土培14 d左右的幼苗進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)株高；成苗株高、節(jié)間長與分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀在大田中選取成熟期植株進(jìn)行拍照和統(tǒng)計(jì)；在種子成熟后對其稱重，并拍照統(tǒng)計(jì)粒形與千粒重；重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取暗下培養(yǎng)3 d幼苗的胚芽鞘，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，檢測目的基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，正反向引物各0.3 μL(表1)，雙蒸水8.4 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；以每30 s上升0.5 ℃的速率從55 ℃升至95 ℃來作為溶解曲線程序。

1.6 耐鹽性和耐旱性實(shí)驗(yàn)

將在溫室生長14 d的HZ和scp1幼苗分成三組，對照組澆自來水，鹽處理組澆含有150 mmol·L-1NaCl的水溶液，干旱處理組不澆水保持干旱狀態(tài)，每日觀察葉片萎蔫和黃化情況，當(dāng)同組內(nèi)材料之間存在顯著差異時(shí)拍照并復(fù)水，復(fù)水培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)成活率，重復(fù)3次。

1.7 基因定位

在實(shí)驗(yàn)田中將scp1和ZH11雜交獲得F1，加繁一代得到F2群體，篩選F2群體中具有短胚芽鞘表型的單株，用CTAB法提取基因組DNA后，隨機(jī)選取20份所提取的DNA等濃度混勻作為DNA混池。分別以混池DNA及HZ和ZH11的DNA作為模板，利用本實(shí)驗(yàn)室已鑒定的覆蓋水稻全基因組的SSR和Indel標(biāo)記作為引物(表1)進(jìn)行RCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL，2× PCR Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，雙蒸水8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用濃度為4% (質(zhì)量體積份數(shù)) 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。通過統(tǒng)計(jì)交換率確定SCP1基因所在的染色體及區(qū)間。通過國家水稻數(shù)據(jù)庫RAP-DB(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)查找該區(qū)域存在的功能基因，用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增候選基因并測序，確定突變基因。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 SCP1調(diào)控胚芽鞘的生長及乙烯合成

從圖1可以看出，scp1突變體胚芽鞘長度只有對照的57%左右。已有研究表明，乙烯促進(jìn)胚芽鞘的伸長[17]。為了探究scp1短胚芽鞘的表型是否是由于乙烯合成減少所致，測定scp1與HZ的乙烯釋放量，發(fā)現(xiàn)scp1乙烯釋放量明顯低于HZ，進(jìn)一步利用qPCR檢測scp1和HZ胚芽鞘中乙烯合成基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在scp1突變體中乙烯合成基因ACO5、ACO6、ACS2、ACS5、ACS6表達(dá)水平均明顯降低。以上結(jié)果說明，scp1突變體的短胚芽鞘表型是由于體內(nèi)乙烯合成量減少導(dǎo)致的。

2.2 scp1突變體農(nóng)藝性狀分析

從表2和圖2可以看出，scp1突變體除了短胚芽鞘的表型之外，在幼苗期和成熟期株高也顯著低于野生型，其中幼苗期scp1突變體株高只有HZ的一半。測量成熟期植株的節(jié)間長度發(fā)現(xiàn)，scp1突變體各節(jié)間長度均短于HZ，第三節(jié)間和第五節(jié)間最為顯著。scp1突變體的粒長只有HZ的51%左右，但粒寬沒有明顯差異，千粒重明顯低于HZ。這些結(jié)果表明，SCP1影響株高、粒形和產(chǎn)量。

圖2 scp1突變體的農(nóng)藝性狀Fig.2 Agronomic traits analysis of scp1 mutants

表2 scp1突變體農(nóng)藝性狀Table 2 Agronomic traits of scp1 mutants

2.3 SCP1參與鹽和干旱脅迫應(yīng)答

鹽和干旱是兩種常見的非生物脅迫，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，因此，提高水稻耐鹽性和耐旱性具有重要的意義。乙烯作為重要的植物激素，在調(diào)控植物耐鹽性[3]和耐旱性[25]中發(fā)揮重要作用。SCP1影響乙烯合成，表明SCP1可能參與調(diào)控水稻的耐鹽性和耐旱性。對土培14 d的幼苗進(jìn)行鹽處理和干旱處理，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)處理組內(nèi)scp1突變體的萎蔫率明顯低于HZ，且HZ的葉色發(fā)黃而scp1突變體葉片仍舊保持綠色且舒展。復(fù)水后scp1突變體成活率顯著高于HZ。以上結(jié)果表明，SCP1負(fù)調(diào)控水稻的耐鹽性和耐旱性，而這種調(diào)控作用可能是由于scp1突變體體內(nèi)乙烯合成降低導(dǎo)致的。

2.4 scp1突變體功能基因的圖位克隆

在scp1與ZH11雜交后代的F2群體中篩選具有短胚芽鞘表型的單株，統(tǒng)計(jì)分離比，短胚芽鞘與正常胚芽鞘的比例近1∶3，說明該突變表型是單基因控制的隱性遺傳。提取具有短胚芽鞘表型單株的DNA，利用圖位克隆技術(shù)將SCP1基因定位在5號染色體上兩個(gè)分子標(biāo)記(M1560與M1564)之間，該區(qū)間范圍32.01 kb。在水稻數(shù)據(jù)庫(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)中查詢，發(fā)現(xiàn)此區(qū)間內(nèi)存在5個(gè)功能基因(圖4)，其中3個(gè)編碼未知蛋白(LOC_ Os05g26860、LOC_Os05g26870、 LOC_Os05g26880)，1個(gè)編碼Dna J伴隨蛋白(LOC_Os05g 26902)，還有1個(gè)已克隆的基因OsRGA1(LOC_Os05g26890)，編碼GTP結(jié)合蛋白。在scp1突變體和HZ中對這五個(gè)功能基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)scp1突變體中OsRGA1基因組序列開放閱讀框第1 110 bp后完全缺失，通過qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)scp1突變體中OsRGA1基因完全不表達(dá)，從而導(dǎo)致功能完全喪失。而其他四個(gè)基因序列沒有突變且表達(dá)水平也沒有改變，表明scp1突變體的表型是由于OsRGA1基因突變所致。

注：*和**分別代表與HZ相比在 P<0.05和 P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: * and ** indicate statically significant difference compared to HZ at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖1 SCP1調(diào)控胚芽鞘的生長及乙烯合成Fig.1 SCP1 regulates coleoptile growth and ethylene biosynthesis

注：*代表與HZ相比在 P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: * indicates statically significant difference compared to HZ at P<0.05 level.圖3 HZ與scp1突變體鹽和干旱脅迫表型和成活率Fig.3 Phenotype and survival rate of HZ and scp1 mutants under salt and drought stress

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該突變體是由OsRGA1基因突變引起的，對osrga1的另一個(gè)等位突變體d1進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)d1也表現(xiàn)出短胚芽鞘的表型，乙烯釋放量測定結(jié)果表明，d1乙烯釋放量顯著低于野生型，與scp1突變體類似(圖5)。以上結(jié)果表明，scp1突變體是osrga1的另一個(gè)等位突變體。

3 討論

OsRGA1基因早已被克隆出來[26]，到目前已陸續(xù)報(bào)道了至少8個(gè)點(diǎn)突變體或者片段插入突變體，例如等位突變體d1、dwarf89[27]及cha-2[28]中OsRGA1基因表達(dá)水平顯著降低，且均表現(xiàn)出矮桿、粒小且圓等性狀特征。本研究篩選到一個(gè)短胚芽鞘突變體，通過圖位克隆發(fā)現(xiàn)OsRGA1基因組序列存在大片段缺失，導(dǎo)致scp1體內(nèi)OsRGA1基因不表達(dá)(圖4)。scp1表現(xiàn)出與osrga1突變體類似的株高、粒形等表型，說明scp1是osrga1的等位突變體。胚芽鞘在水稻破殼、出土[29]及逆境脅迫[30-31]應(yīng)答過程中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)OsRGA1通過調(diào)控水稻乙烯生物合成來調(diào)控胚芽鞘的生長及苗期耐逆性，進(jìn)一步豐富了OsRGA1在水稻中的功能，同時(shí)也為OsRGA1功能研究提供材料。

圖4 SCP1基因的圖位克隆Fig.4 Map-based cloning of the SCP1 gene

注：*代表與HZ相比在 P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: * indicates statically significant difference compared to HZ at P<0.05 level.圖5 d1胚芽鞘表型和乙烯釋放量Fig.5 Coleoptile phenotype and ethylene production in d1 coleoptile

乙烯是一種重要的植物激素，從植物種子萌發(fā)到器官衰老的過程中都有重要作用，而且在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫中起著關(guān)鍵作用[10]。目前已有研究表明，OsRGA1參與赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控節(jié)間伸長[32]，并且在乙烯介導(dǎo)的缺氧信號傳遞過程中起調(diào)節(jié)作用[9]，表明OsRGA1參與多種激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。但是OsRGA1與乙烯合成之間的關(guān)系還不清楚。本研究結(jié)果顯示，scp1突變體中乙烯合成基因的表達(dá)水平明顯低于野生型，并且其乙烯釋放量也顯著低于野生型(圖1)，說明OsRGA1參與調(diào)控水稻乙烯的合成。該研究豐富了該基因在激素合成與信號傳遞過程中的角色，但是目前還未研究清楚該基因具體如何調(diào)控乙烯合成的，這將是下一步工作的重點(diǎn)。

鹽和干旱是水稻可能面臨的兩大非生物脅迫[33]。從本研究可以看出，scp1突變體表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性和耐旱性(圖3)，這與已報(bào)到的d1突變體類似[4, 34]。同時(shí)scp1突變體中乙烯含量降低，表明SCP1可能通過調(diào)控乙烯合成來影響水稻的耐旱和耐鹽性。但具體機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，本研究克隆了一個(gè)與乙烯合成相關(guān)的突變體，表現(xiàn)出短胚芽鞘的表型。通過圖位克隆確定該表型是由于基因LOC_Os05g26890(OsRGA1)突變所致。scp1突變體表現(xiàn)出矮化、小粒、耐鹽性和耐旱性增強(qiáng)，說明該基因可能為育種專家權(quán)衡產(chǎn)量與耐逆性提供材料。同時(shí)scp1突變體的乙烯合成量減少，說明其可能參與了乙烯的合成調(diào)控途徑，拓展了OsRGA1的功能。