表達(dá)Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3對四種主要鱗翅目害蟲的抗性評價

徐曉麗,姜媛媛,王鵬飛,來勇敏,陳笑蕓,徐俊鋒*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所, 杭州 310021;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 杭州 310012)

玉米是全球主要種植作物之一，也是我國重要的糧食作物和飼料作物，對穩(wěn)定農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和食品安全有重要作用。在我國，玉米在生育期極易受黏蟲Mythimnaseparata(Walker)、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等鱗翅目害蟲的為害，嚴(yán)重時會導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收[1-2]。亞洲玉米螟屬于鱗翅目草螟科，是我國玉米生產(chǎn)上為害較嚴(yán)重的害蟲，幼蟲為害玉米未展開的幼嫩心葉，大齡幼蟲蛀莖，阻斷營養(yǎng)運輸，還直接蛀食玉米雌穗，造成霉變，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。黏蟲和棉鈴蟲屬于鱗翅目夜蛾科，黏蟲取食玉米葉片，形成缺刻，嚴(yán)重時可造成絕收，近幾年黏蟲在局部爆發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重發(fā)生的局面常有發(fā)生；黃淮海地區(qū)由于棉花種植面積降低，棉鈴蟲對玉米為害加重[5]。除上述幾種常見害蟲外，2019年草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J. E. Smith)成為威脅我國玉米產(chǎn)業(yè)的又一重要害蟲。草地貪夜蛾源于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，屬鱗翅目夜蛾科，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅糧食安全的重大災(zāi)害生物，2019年侵入我國，并快速擴(kuò)散[6]，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[7]。

長期以來，化學(xué)農(nóng)藥是防治害蟲的主要方法，不僅污染生態(tài)環(huán)境，同時易殺傷非靶標(biāo)生物，不利于有害生物的綜合治理[8]，由于長期單一用藥產(chǎn)生的抗藥性導(dǎo)致化學(xué)防治效果不斷降低。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的商業(yè)化種植為防治害蟲提供了新途徑，并逐漸成為一些國家防控害蟲的主要的手段。殺蟲晶體(insecticidal crystal，Cry)蛋白是應(yīng)用廣泛的殺蟲蛋白，其中在玉米上應(yīng)用的抗鱗翅目害蟲的Cry蛋白主要包括Cry1和Cry2，Cry1包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry1A.105等，Cry2主要是Cry2Ab[9]。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的種植大大減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，提高了玉米產(chǎn)量，但是20多年來持續(xù)地種植轉(zhuǎn)基因抗蟲植物也導(dǎo)致一些國家和地區(qū)抗性害蟲的出現(xiàn)[10-12]，為延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，目前采取的策略是高劑量和庇護(hù)所，以及同時表達(dá)2種以上不同類型的殺蟲蛋白，前者是通過采用提高殺蟲蛋白的表達(dá)水平以及按比例在轉(zhuǎn)基因作物周圍種植非轉(zhuǎn)基因作物，使敏感個體和抗性個體交配，達(dá)到稀釋抗性基因的目的；后者通過雜交或多基因同時轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)基因植物中同時表達(dá)2個及以上不同類型的殺蟲基因，既擴(kuò)大了殺蟲譜，又能延緩害蟲抗性的產(chǎn)生[13-14]。

目前，我國已研發(fā)獲得多個轉(zhuǎn)基因玉米新品系進(jìn)入不同階段試驗[15]。轉(zhuǎn)cry1Ab和cry2Ab基因抗蟲玉米GAB-3是浙江大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品系[16]。Cry1Ab和Cry2Ab蛋白在昆蟲中腸上的作用位點不同，有研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ab和Cry2Ab在草地貪夜蛾中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上的結(jié)合位點不同，并且二者在控制害蟲上具有協(xié)同作用[17]，因此，同時表達(dá)這兩種殺蟲蛋白能夠起到擴(kuò)大殺蟲譜和延緩害蟲抗性發(fā)生的作用。本研究旨在通過田間接蟲和室內(nèi)生測的方法，研究評價轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3對玉米生產(chǎn)上4種主要的鱗翅目害蟲的抗性。

1 材料與方法

1.1 供試玉米材料

轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3表達(dá)Cry1Ab和Cry2Ab抗蟲蛋白，同時以G10evo-EPSPS基因作為篩選標(biāo)記，供試用的轉(zhuǎn)基因玉米材料及其非轉(zhuǎn)基因親本對照種子瑞豐1號均由浙江大學(xué)沈志成提供，田間抗蟲性測試中除了非轉(zhuǎn)基因親本對照，還增加了浙江當(dāng)?shù)貙φ沼衩灼贩N浚單58，種子購自市場。

1.2 供試蟲源及培養(yǎng)條件

供試黏蟲、亞洲玉米螟、棉鈴蟲和草地貪夜蛾蟲卵購自北京延美生物科技有限公司，在人工氣候培養(yǎng)箱(BIC-250，上海博迅)孵化，溫度(27±1)℃，濕度(90%±5%)，光周期16 h光照/8 h黑。

1.3 玉米組織Cry1Ab和Cry2Ab蛋白表達(dá)量測定

采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米各組織中殺蟲蛋白含量。在玉米心葉期(V7～V8)取植株幼嫩心葉，抽雄期取未散粉雄穗，吐絲期取花絲、苞葉、穗尖、穗軸，灌漿期取幼嫩籽粒，每種組織設(shè)10個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。取30 mg不同玉米組織加入1 mL提取液，迅速研磨成漿，靜置2 h，離心后取上清。采用Cry1Ab/Cry1Ac和Cry2A檢測試劑盒(美國ENVIROLOGIX公司)檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用680酶標(biāo)儀(美國伯樂)450 nm下測定吸光值。

1.4 室內(nèi)抗蟲性測定

對黏蟲的抗性測定選取V6～V7期玉米相同部位葉片；對亞洲玉米螟和棉鈴蟲的抗性測定分別選取V7～V8期玉米幼嫩心葉、抽雄期尚未抽出的雄穗、吐絲期玉米的幼嫩花絲、苞葉、穗尖、穗軸及灌漿期玉米幼嫩籽粒；對草地貪夜蛾的抗性測定選取V6～V8期玉米相同部位葉片。黏蟲和亞洲玉米螟的生測以20頭初孵幼蟲為1個處理，設(shè)5次重復(fù)；為防止試蟲密度大導(dǎo)致自殘，棉鈴蟲和草地貪夜蛾采用5頭初孵幼蟲為1個處理，設(shè)20次重復(fù)。培養(yǎng)皿用封口膜封閉防止幼蟲鉆出，然后放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天固定時間檢查幼蟲存活情況并記錄活蟲數(shù)，同時更換相同來源的玉米組織，毛筆輕觸幼蟲不能爬行則視為死亡。當(dāng)轉(zhuǎn)基因玉米組幼蟲存活率為0時，試驗結(jié)束。草地貪夜蛾生長至2齡后時容易出現(xiàn)自殘現(xiàn)象，測試時間為4 d。

1.5 田間抗蟲性測定

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每品種設(shè)三次重復(fù)，小區(qū)面積為30 m2(5 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，并在試驗小區(qū)設(shè)置隔離帶。常規(guī)播種方式和栽培管理，全生育期不噴灑殺蟲劑。

1.5.1心葉期黏蟲抗蟲性評價 玉米心葉期(V6～V7)，用毛筆將黏蟲初孵幼蟲輕刷到玉米心葉，每小區(qū)接蟲40株，每株玉米接蟲40～60頭。接蟲14 d后逐株調(diào)查玉米葉片被害程度，分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部 953 號公告[18]。

1.5.2心葉期亞洲玉米螟抗蟲性評價 玉米心葉期(V7～V8)，用毛筆將亞洲玉米螟初孵幼蟲輕刷到玉米心葉，每小區(qū)接蟲40株，每株玉米心葉接蟲40～60頭。接蟲14 d后逐株調(diào)查玉米植株中上部位被亞洲玉米螟為害情況，分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參照玉米抗玉米螟鑒定技術(shù)規(guī)范[19]。

1.5.3吐絲期亞洲玉米螟抗蟲性評價 玉米吐絲期(全田60%以上的植株雌穗花絲露出苞葉)，用毛筆將亞洲玉米螟初孵幼蟲輕刷到花絲，每小區(qū)接蟲40株，每株玉米花絲接蟲40～60頭，接蟲14 d后調(diào)查玉米雌穗被害情況(包括花絲和穗尖被害情況、存活幼蟲數(shù)量和齡期及蛀孔隧道長度)，同時剖稈調(diào)查莖稈受害情況。雌穗被害級別分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參考農(nóng)業(yè)部 953 號公告[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0系統(tǒng)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法對玉米組織ELISA檢測結(jié)果和田間抗蟲性數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，室內(nèi)抗蟲性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，百分?jǐn)?shù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，采用LSD進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAB-3不同組織Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量

GAB-3不同組織中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量見表1。ELISA檢測結(jié)果顯示，GAB-3不同組織中Cry1Ab含量為2.70～28.49 μg·g-1，心葉期葉片中Cry1Ab含量最高，達(dá)28.49 μg·g-1，接下來依次是灌漿期籽粒、雄穗、穗尖、穗軸、苞葉和花絲，不同組織Cry1Ab蛋白含量有顯著性差異(ANOVA:F=197.928;df=6;P<0.05)；GAB-3

表1 轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3不同發(fā)育階段各組織中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量Table 1 Content of Cry1Ab and Cry2Ab in transgenic maize GAB-3 tissues at different growth stages (μg·g-1 FW)

不同組織Cry2Ab含量為0.98～9.26 μg·g-1，雄穗中Cry2Ab含量最高為9.26 μg·g-1，接下來依次是穗尖、心葉期葉片、苞葉、穗軸、灌漿期籽粒和花絲，不同組織Cry2Ab含量有顯著性差異(ANOVA:F=139.962;df=6;P<0.05)。

2.2 GAB-3對4種鱗翅目害蟲的室內(nèi)殺蟲效果

GAB-3不同生育期不同組織對4種鱗翅目害蟲的生測結(jié)果如表2所示。

表2 4種害蟲初孵幼蟲取食GAB-3和其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭鹘M織后的存活率Table 2 Survival of neonate larvae of of feeding on different tissues of GAB-3 and its control

GAB-3心葉對黏蟲有很強(qiáng)的抗性，初孵幼蟲取食GAB-3葉片4 d后存活率為0，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M黏蟲存活率為100%。

GAB-3心葉、雄穗、花絲、苞葉、穗尖、穗軸和籽粒等組織對亞洲玉米螟有很強(qiáng)的毒殺作用，各組織處理組的亞洲玉米螟初孵幼蟲在測試2～3 d內(nèi)全部死亡；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩滋幚斫M亞洲玉米螟存活率為89.00%～99.00%。

GAB-3心葉、雄穗、花絲、穗尖、籽粒等組織對棉鈴蟲有很強(qiáng)的抗性，取食GAB-3各組織的棉鈴蟲初孵幼蟲在測試2～5 d內(nèi)全部死亡；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩滋幚斫M棉鈴蟲存活率為80.00%～96.00%。

GAB-3心葉對草地貪夜蛾初孵幼蟲有很強(qiáng)的抗性，測試4 d后，幼蟲存活率為11.00%，存活的草地貪夜蛾也停止生長發(fā)育，處于1齡的狀態(tài)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M幼蟲已進(jìn)入3齡，存活率為81.00%(圖1)。

A：取食GAB-3的幼蟲；B：取食非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏挠紫x。A: Larva feeding on GAB-3 maize; B: Larva feeding on non-transgenic control maize.圖1 測試5 d后存活的草地貪夜蛾幼蟲 Fig.1 Larvae of Spodoptera frugiperda feeding on GAB-3 or non-transgenic control maize for 5 d

2.3 GAB-3對亞洲玉米螟和黏蟲的田間抗性

2.3.1心葉期GAB-3田間抗蟲性 田間接蟲14 d后調(diào)查結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3接黏蟲和亞洲玉米螟后未觀察到任何為害癥狀，抗性等級為高抗；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸彤?dāng)?shù)貙φ沼衩诪楹^重，黏蟲的食葉級別達(dá)到2.78和3.71，抗性級別為抗蟲，亞洲玉米螟的食葉級別達(dá)到6.64和6.46，抗性水平為感蟲(表3)。表明心葉期轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3對黏蟲和亞洲玉米螟有良好的抗蟲效果。

表3 心葉期GAB-3對黏蟲和亞洲玉米螟田間抗性Table 3 Resistance of GAB-3 to larvae of Mythimna seperata and Ostrinia nubilalis at whorl stage under artificial infestations in field

2.3.2吐絲期GAB-3田間抗蟲性 吐絲期玉米接亞洲玉米螟14 d后調(diào)查植株雌穗受害情況。調(diào)查結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3被害級別為1.06，抗性類型為高抗；其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀彤?dāng)?shù)貙φ沼衩妆缓墑e為5.86和6.19，抗性類型均為感蟲(表4)。轉(zhuǎn)基因玉米單株蛀孔數(shù)、隧道長度及亞洲玉米螟活蟲數(shù)均為0，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ照{(diào)查獲得單株活蟲數(shù)達(dá)到1.28頭，蛀孔數(shù)為1.02個，幾乎每一株都有被害。

表4 吐絲期GAB-3雌穗對亞洲玉米螟的田間抗性Table 4 Resistance of GAB-3 to larvae of Ostrinia nubilalis at silking stage under artificial field infestations

剖稈調(diào)查結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3莖稈無被害，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀彤?dāng)?shù)貙φ沼衩浊o稈受害嚴(yán)重，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諉沃曛讛?shù)為0.71個，單株活蟲數(shù)為0.3個，單株隧道長度達(dá)1.39 cm；當(dāng)?shù)貙φ沼衩讍沃曛讛?shù)達(dá)1.15個，單株活蟲數(shù)達(dá)0.45，單株隧道長度為1.36 cm(表5)。

表5 玉米莖稈受害情況Table 5 Maize stalk-damage level by lepidopteran pests under field conditions

綜合雌穗受害情況和莖稈受害情況，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3抗性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩祝谕陆z期對亞洲玉米螟具有良好抗蟲效果。

3 討論

Cry1和Cry2類Bt蛋白是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中應(yīng)用最廣泛的殺蟲蛋白，Cry1類對鱗翅目害蟲有殺蟲活性，Cry2類對鱗翅目和雙翅目昆蟲有殺蟲活性。Cry1類Bt蛋白中應(yīng)用較多的有Cry1Ab和Cry1Ac，其中Cry1Ab在轉(zhuǎn)基因玉米中的推廣應(yīng)用面積最大，比如Bt11、Bt176、MON810及其衍生品系等。Cry2Ab在殺蟲譜上與Cry1類殺蟲蛋白有所不同，并且在鱗翅目害蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上的結(jié)合位點不同[20]，因此，Cry2Ab常與Cry1類殺蟲蛋白組合使用，如MON89034同時表達(dá)Cry2Ab2和Cry1A.105，從而達(dá)到延緩害蟲抗性發(fā)展的目的。

在我國，第一代亞洲玉米螟的發(fā)生通常在春玉米心葉期，幼蟲主要取食幼嫩的心葉，葉片展開后會形成排孔，第二代玉米螟為害春玉米雄穗、花絲、穗軸和穗尖。在心葉期玉米田間抗蟲性試驗中，自然發(fā)生和人工接的亞洲玉米螟共同為害，導(dǎo)致非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸彤?dāng)?shù)貙φ沼衩子捎趤喼抻衩酌∈吃斐傻钠骄橙~級別達(dá)到6以上，而GAB-3未觀測到任何被害狀；在田間進(jìn)行人工接黏蟲試驗中，接蟲3 d后在非轉(zhuǎn)基因玉米上觀察到黏蟲取食較多，但由于接蟲時期多雨，黏蟲未發(fā)育至暴食期大多已死亡，接蟲2周后調(diào)查顯示非轉(zhuǎn)基因玉米的為害并不嚴(yán)重，食葉級別為2.78和3.71，但依然高于轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3(食葉級別為1)，顯示心葉期轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3對黏蟲也有很高的抗性。

亞洲玉米螟除了取食玉米心葉，對玉米全株都可造成為害，吐絲期玉米田間接蟲試驗顯示GAB-3雌穗沒有明顯為害狀，未檢測到活蟲和蛀孔，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀彤?dāng)?shù)貙φ沼衩资芎車?yán)重，幾乎每一株都有被害。田間對玉米雌穗的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，穗上的害蟲除了亞洲玉米螟外，桃蛀螟Conogethespunctiferalis的為害也非常嚴(yán)重。近年來，桃蛀螟在玉米上的為害逐年上升，已經(jīng)成為夏玉米區(qū)穗期主要害蟲[4-5,21-22]。本研究中與非轉(zhuǎn)基因玉米上自然發(fā)生的桃蛀螟造成的嚴(yán)重為害相比，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3上幾乎沒有發(fā)生桃蛀螟的為害，這表明GAB-3也對桃蛀螟有很高的抗性。在穗期同時進(jìn)行了剖稈調(diào)查，為害非轉(zhuǎn)基因玉米莖稈的害蟲主要有亞洲玉米螟和桃蛀螟，而GAB-3也沒有發(fā)生任何為害，顯示GAB-3全株對亞洲玉米螟和桃蛀螟都具有很高的抗性。

草地貪夜蛾侵入我國后，成為我國的又一玉米重大害蟲[7,23]，并且該害蟲對多種轉(zhuǎn)基因作物和農(nóng)藥產(chǎn)生較強(qiáng)抗性，李國平等[24]研究顯示,入侵我國的草地貪夜蛾對Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A五種Bt蛋白未產(chǎn)生抗性，GAB-3對草地貪夜蛾的生測結(jié)果顯示取食GAB-3心葉的幼蟲死亡率顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M，并且存活的幼蟲停止生長發(fā)育，表明GAB-3在抗草地貪夜蛾上具有良好的應(yīng)用前景。

隨著我國玉米種植面積的增加，玉米病蟲害發(fā)生一直呈加重趨勢，傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用帶來環(huán)境污染、抗性產(chǎn)生等等方面的問題。自1996年以來，國際上轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積逐年增長，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。我國于2020年1月21日發(fā)布2019年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(生產(chǎn)應(yīng)用) 批準(zhǔn)清單，其中包括2個轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品種[25]，意味著我國在轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化進(jìn)程上邁出了重要一步。在轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)上，我國各科研院所及企業(yè)一直在進(jìn)行不懈的努力，目前已研制出多種具有良好抗性的轉(zhuǎn)基因玉米新品系。本研究表明，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3對玉米上五種鱗翅目害蟲具有很強(qiáng)的抗性，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。