免疫親和凈化-光化學(xué)衍生液相色譜檢測不同樣品中的黃曲霉毒素

華麗霞, 曾華蘭, 蔣秋平, 何煉, 葉鵬盛, 張小軍, 韋樹谷,張小紅, 張敏, 王明娟, 何曉敏, 陳超

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所, 成都 610300)

黃曲霉毒素(aflatoxin, AFT)是一類主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusspeare)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有高毒性及致癌性，1993年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物[1-2]。常見的黃曲霉毒素有AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2，其中AFTB1的毒性最強(qiáng)[3]。黃曲霉毒素容易對堅(jiān)果類、麥類、飼料等農(nóng)產(chǎn)品造成污染[4-5]，嚴(yán)重影響著食品安全。Li等[6]對我國花生油和芝麻油黃曲霉毒素污染情況進(jìn)行了抽樣調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50份花生油樣品中，有41份AFTB1含量高達(dá)68.51 ug·kg-1；而100份芝麻油樣品中，37份AFTB1檢測值達(dá)20.45 ug·kg-1。黃曲霉菌在我國是一種常見的腐生真菌，既是重要的植物病原真菌，又能條件性地感染動(dòng)物器官[7]，主要產(chǎn)生AFTB1和AFTB2兩種毒素；而寄生曲霉在我國較為罕見，其大多數(shù)菌株都能產(chǎn)生黃曲霉毒素，且還可產(chǎn)生G族毒素[8]。目前，越來越多的研究人員對黃曲霉菌株的分布、產(chǎn)毒力及產(chǎn)毒條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，有助于分析預(yù)防和減少黃曲霉毒素污染的關(guān)鍵控制點(diǎn)，建立相關(guān)預(yù)防措施[9-10]。

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測是一種常用的黃曲霉毒素檢測技術(shù)，能同時(shí)對樣品中的黃曲霉毒素種類進(jìn)行定性、定量分析，具有快速、高效、靈敏、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在黃曲霉毒素檢測方面發(fā)揮著重要的作用，已經(jīng)成為檢測黃曲霉毒素的主要方法[11-13]。由于AFTB1及AFTG1熒光強(qiáng)度較弱，需進(jìn)行柱前或柱后衍生來增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。柱后光化學(xué)衍生是近期發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，該方法儀器安裝、使用簡單，對提取凈化液無需進(jìn)行額外的化學(xué)處理即可上機(jī)檢測，分析快速簡捷，在實(shí)際生產(chǎn)中得到越來越廣泛的應(yīng)用[14-17]。為了提高檢測靈敏度，減少雜質(zhì)干擾，通常需要對黃曲霉毒素提取液進(jìn)行凈化。免疫親和柱(immunoaffinity chromatography，IAC)是專用于黃曲霉毒素凈化分離的固相萃取主要方法之一，使用抗體-抗原的特異性吸附原理，能選擇性吸附黃曲霉毒素，具有準(zhǔn)確性高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)[18]。

本研究利用免疫親和凈化結(jié)合光化學(xué)柱后衍生液相色譜方法，對油脂類、堅(jiān)果類及菌株培養(yǎng)物3種類型物質(zhì)中的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測，探索該方法在不同物質(zhì)，特別是菌株培養(yǎng)物中黃曲霉毒素檢測的適用性，以期為深入了解黃曲霉菌株的產(chǎn)毒情況及毒素積累規(guī)律提供重要的檢測技術(shù)，為農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，配熒光檢測器G1321A；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；PriboFast?KRC光化學(xué)衍生反應(yīng)裝置(Pribolab)；黃曲霉毒素總量免疫親和柱(PriboFast?IAC-011-3)。

色譜純甲醇、乙腈(美國Fisher)；黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品[Pribolab, AFTB1(1.00±0.05) ug·mL-1、AFTB2(0.29±0.04) μg·mL-1、AFTG1(1.00±0.03) ug·mL-1、AFTG2(0.29±0.01) μg·mL-1]；待測樣品：花生油3份、花生仁5份，黃曲霉菌株5個(gè)。

1.2 方法適用性分析

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，其中AFTB1和AFTG1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng·mL-1；AFTB2和AFTG2系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為0.03 、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12.0 ng·mL-1。對系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜檢測，記錄峰面積。

1.2.2精確性、重復(fù)性及穩(wěn)定性分析 將黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍，分別在不進(jìn)行光化學(xué)衍生與經(jīng)過光化學(xué)衍生反應(yīng)裝置2種條件下進(jìn)行色譜分析，分析光化學(xué)衍生裝置對黃曲霉毒素衍生的適用性。

對同一個(gè)稀釋樣品進(jìn)行6次進(jìn)樣檢測，記錄峰面積并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，分析檢測方法的精確性及穩(wěn)定性；同時(shí)，間隔30 min、2 h、24 h、52 h記錄峰面積并計(jì)算RSD，分析檢測方法的穩(wěn)定性。

1.3 樣品提取

1.3.1油脂類樣品 稱取3份花生油樣品(編號分別為Y1～Y3)各5 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80∶20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.3.2花生仁樣品 將待測的5份花生仁樣品(編號分別為K1～K5)用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，并用勻漿機(jī)混勻。隨后稱取5份花生仁粉碎樣品各5 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80：20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.3.3真菌培養(yǎng)物 在PDA平板培養(yǎng)基上接種5個(gè)黃曲霉菌株(編號分別為H1～H5)，28 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。將長滿皿的菌株連同培養(yǎng)基進(jìn)行勻漿處理，取5 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80∶20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.4 樣品凈化

取4 mL上清液于黃曲霉毒素免疫親和柱中，按照說明書收集黃曲霉毒素，最后用2 mL甲醇溶液將吸附在免疫親和柱中的黃曲霉毒素進(jìn)行洗脫，用0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中待用。

1.5 色譜條件

以水為流動(dòng)相A，甲醇-乙腈(50:50)為流動(dòng)相C，按照70%水-30%甲醇-乙腈(50:50)進(jìn)行等度洗脫。流速為1 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量50 μL，檢測波長：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent Technologies ChemStation (Rev. B. 03.02) 軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用Excel計(jì)算峰面積平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度及峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 光化學(xué)衍生對黃曲霉毒素的衍生效果

圖1顯示,在不使用光化學(xué)衍生裝置進(jìn)行衍生的情況下，AFTB2與AFTG2可以被檢測到峰，而AFTB1、AFTG1幾乎檢測不到峰；經(jīng)過光化學(xué)衍生反應(yīng)裝置后，提高了AFTB1、AFTG1的檢測靈敏度，檢測峰面積大大提高，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1的保留時(shí)間分別是11.8、15.4、17.1、22.7 min。

圖1 光化學(xué)衍生對黃曲霉毒素的衍生效果Fig.1 Derivative effect of photochemical dervatization on AFT

2.2 光化學(xué)衍生的精確性、重復(fù)性與穩(wěn)定性評價(jià)

光化學(xué)衍生的精確性、重復(fù)性分析結(jié)果見表1。對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于2%，表明光化學(xué)衍生對黃曲霉毒素檢測具有良好的精確性。對6次重復(fù)稀釋樣品進(jìn)行檢測，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于3%，表明光化學(xué)衍生對黃曲霉毒素檢測具有良好的重復(fù)性。對同一個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不同時(shí)間段的檢測，結(jié)果顯示，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于2%，表明光化學(xué)衍生檢測黃曲霉毒素的方法在52 h內(nèi)具有穩(wěn)定性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的確定

配置黃曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2標(biāo)準(zhǔn)工作液并進(jìn)行檢測，以濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)，所對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，做回歸曲線。結(jié)果表明，AFTB1、AFTG1在0.1～40.0 ng·mL-1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，AFTB2、AFTG2在0.03 ～12.0 ng·mL-1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，R2值均達(dá)到0.999(圖2)。

2.4 不同類型樣品中黃曲霉毒素的檢測結(jié)果

由樣品檢測峰形圖(圖3)可以看出，黃曲霉毒素總量免疫親和柱(PriboFast?IAC-011-3)對不同類型樣品的黃曲霉毒素提取液都具有顯著的純化效果，且不存在明顯的干擾峰。對花生油、花生仁、黃曲霉培養(yǎng)物等13份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。3份花生油樣品中，有1份檢測出含AFTB1與AFTB2；5份花生仁樣品中，1份檢測出含AFTB1與AFTB2；而在5份的黃曲霉培養(yǎng)物中，有3份檢測到AFTB1，這3個(gè)菌株可鑒定為產(chǎn)毒菌株，其余2個(gè)菌株可能為不產(chǎn)毒菌株。

表1 精確性、重復(fù)性及穩(wěn)定性分析結(jié)果Table 1 Accuracy, repeatability and stability analysis results

圖2 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2線性范圍Fig.2 Linear ranges of AFTB1, AFTB2, AFTG1, AFTG2

圖3 不同類型樣品的光化學(xué)衍生液相色譜圖Fig.3 Photochemical derivatization-HLPC chromatograms of different types of samples

表2 樣品中黃曲霉毒素含量Table 2 AFT content in different kinds of samples(ug·kg-1)

3 討論

黃曲霉毒素是一類對人類健康危害較大的真菌毒素，黃曲霉毒素污染問題長期受到社會(huì)關(guān)注[19-20]。因此，對黃曲霉毒素的檢測與防控是保障食品安全、維護(hù)人類健康的重要環(huán)節(jié)。由于黃曲霉侵染可發(fā)生在生產(chǎn)、加工、倉儲(chǔ)及運(yùn)輸?shù)热魏我粋€(gè)環(huán)節(jié)，通過有效的檢測技術(shù)對黃曲霉菌株進(jìn)行產(chǎn)毒及毒素積累情況的分析，有利于從源頭上尋找到預(yù)防黃曲霉毒素污染的關(guān)鍵控制點(diǎn)，制定出有效的預(yù)防措施。

本研究探討了黃曲霉毒素免疫親和柱結(jié)合光化學(xué)柱后衍生液相色譜的方法對油脂類、堅(jiān)果類及黃曲霉菌株培養(yǎng)物等不同樣品黃曲霉毒素檢測的可行性。結(jié)果表明，該方法方便快捷，能將AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB14種毒素的峰明顯區(qū)分開，且沒有干擾峰，實(shí)現(xiàn)對黃曲霉毒素的定性定量分析，不僅可用于食品和農(nóng)產(chǎn)品的檢測，還可以用于對黃曲霉菌株產(chǎn)毒情況的分析鑒定，從源頭上探索黃曲霉毒素的積累規(guī)律，為進(jìn)一步制定相應(yīng)的黃曲霉毒素污染防控措施提供重要的參考信息。

雖然黃曲霉是農(nóng)產(chǎn)品和食品中最常見的真菌，然而并非所有的黃曲霉菌株都能產(chǎn)生黃曲霉毒素。據(jù)報(bào)道，自然界中大約10%的菌株能產(chǎn)生毒素[21]。本研究對3份花生油、5份花生仁、5份黃曲霉菌株培養(yǎng)物進(jìn)行了黃曲霉毒素檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試樣品中花生油及花生仁樣品各有1份被黃曲霉毒素污染，毒素類型為AFTB1和AFTB2，且AFTB1含量高于AFTB2含量，檢測結(jié)果與前人研究結(jié)果相吻合[8]；而5份黃曲霉菌株培養(yǎng)物有3份只檢測到AFTB1，這可能跟采樣地點(diǎn)有關(guān)，因?yàn)檫@5份菌株都采集自成都平原地區(qū)的花生種植區(qū)(青白江、新都、簡陽)。在后續(xù)工作中，需要擴(kuò)大菌株樣本的采集范圍，對不同地理環(huán)境下的黃曲霉菌株產(chǎn)毒情況及產(chǎn)毒類型進(jìn)行深入研究，為農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地安全風(fēng)險(xiǎn)評估提供參考信息。由于在菌株培養(yǎng)時(shí)，并沒有嚴(yán)格地進(jìn)行定量培養(yǎng)，因此無法嚴(yán)格比較得出這3株產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒能力。在后續(xù)的工作中，應(yīng)深入對產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒強(qiáng)弱及毒素積累情況進(jìn)行定量比較分析，為探索黃曲霉菌株產(chǎn)毒機(jī)制提供參考信息。