煙草葉形突變體的形態(tài)特征與關鍵基因表達差異研究

周蕾, 張彥, 張娟, 吳曉穎, 馬興華

(1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，農業(yè)農村部煙草生物學與加工重點實驗室,山東 青島 266101; 2.中國農業(yè)科學院研究生院, 北京 100081)

葉片發(fā)育遵循著一個基本的模式，葉原基(shoot apical meristem,SAM)從植物地上部分的頂端分生組織周圍區(qū)起始發(fā)育，經過一系列細胞分裂和分化的程序最終發(fā)育為成熟的葉片[1]。葉原基最初進行細胞分裂，產生大小一致且體積較小的新細胞。隨后，細胞分裂逐漸減弱至停止，葉片的繼續(xù)發(fā)育主要靠個體細胞的增大，最終形成完整的葉片。葉片大小的突變通過影響細胞分裂與擴展這兩個過程，進而影響到細胞的數目與體積的大小。龍海馨[2]通過對水稻窄葉突變體進行細胞學觀察，發(fā)現窄葉突變體的細胞大小變化不明顯，細胞數目顯著減少，從而確定葉片變窄主要是由于細胞數量減少造成的。Yang等[3]研究發(fā)現，擬南芥atcsp3突變株植株整體較小，蓮座葉發(fā)育不全呈圓形且葉片卷曲，柵欄組織葉肉細胞在突變體葉片中體積較小。在an3或ant突變體中，細胞數量的減少與細胞大小的增加有關，但葉面積最終還是會呈現減小的趨勢[4-5]。除此之外，AtGRF1和AtGRF2的過表達導致葉片和子葉變大，AtGRF1-AtGRF3的三插入缺失突變體葉片和子葉較小[6]。DELLA蛋白降低了細胞增殖速率，減慢細胞的擴展速度，抑制植物的生長發(fā)育[7]。AtRPT2a突變體表現出一種因細胞體積增加而導致葉片增大的特殊表型[1,8]。

煙草是我國的重要經濟作物，以收獲葉片為目的，葉片的大小與煙葉產量和品質密切相關。煙葉的大小受多種農藝措施的調控，付仲毅[9]研究發(fā)現，滴灌更能促進煙葉長和寬的生長；劉繼坤[10]研究發(fā)現，隨著種植密度的降低，煙葉的長、寬增加；秦燚鶴等[11]研究發(fā)現，增施腐熟秸稈處理后，煙葉面積增加；楊興有[12]研究發(fā)現，隨著光強減弱，上部煙葉與中部煙葉的長寬變化呈拋物線變化趨勢。上述研究主要集中于農藝措施對煙葉大小的影響研究，關于煙草葉片大小差異的機理研究尚少。本研究以煙草品種‘紅花大金元’的兩個葉形突變體為試驗材料，通過葉片的形態(tài)指標和解剖學特征比較以及關鍵基因表達量的分析，初步解析煙草葉片大小差異的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為煙草(NicotianatabacumL.)品種‘紅花大金元’及其兩個突變體(突變體1和突變體2)，種子均來自中國農業(yè)科學院煙草研究所中國煙草突變資源生物信息庫和利用平臺。

1.2 試驗方法

1.2.1植株培養(yǎng) 按照煙草托盤育苗法進行育苗操作和管理，育苗基質(泥炭和蛭石比例為1∶1)經120 ℃滅菌20 min后裝盤。將煙草種子均勻播撒于播種盤中，3周后選擇長勢均勻一致的幼苗移栽到花盆中，規(guī)格為10 cm×10 cm(底面直徑×高)，置于溫度為23～28 ℃，相對濕度為60%～70%的溫室中培養(yǎng)120 d。

1.2.2煙葉生長指標測定 取中部全展葉，用卷尺人工測量葉長、葉寬，以葉長/葉寬表示葉形指數(leaf shape index)。葉面積計算參考肖強等[13]的方法。后將煙葉置于烘箱中105 ℃殺青15 min，然后70 ℃下烘干至恒重，稱取干重，計算比葉重(leaf mass per area, LMA)[14]。

LMA=葉干重/葉面積

1.2.3葉形態(tài)解剖學特征比較 取中部全展葉，用蒸餾水清洗干凈。在葉片中部，距離葉脈0.5 cm處切取面積1 cm2的組織，參考Tsukaya等[15]的方法，在 FAA 固定液(體積百分比5%醋酸，體積百分比45%乙醇和體積百分比5%福爾馬林)中固定，然后經酒精逐級脫水，將預埋材料切割成2 μm厚的切片，用甲苯胺藍、藏紅花素以及橙色G進行染色，中性樹膠封片，利用光學顯微鏡(NIKON Eclipse Ci，上海衡浩儀器有限公司)觀察海綿層的縱切面以及葉片的橫切面。用鑷子撕取葉片下表皮并制成臨時裝片，用光學顯微鏡(Leica DMC 2900，上海徠卡儀器有限公司)觀察細胞形態(tài)。細胞形態(tài)指標采用Image J 1.52r軟件進行測量，細胞數目估算參考黃淦等[16]方法。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR 為了驗證與葉片大小相關基因在兩個突變體以及野生型葉片中的表達情況，參考已發(fā)表的擬南芥、番茄和馬鈴薯的葉片發(fā)育基因，在茄科基因組數據庫(Sol Genomics Network：http://www.sgn.cornell.edu)以及美國國立生物技術中心(NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中搜索，篩選得到12個與葉片形態(tài)大小有關的基因，用于qRT-PCR分析，這些基因主要通過影響細胞的數量和體積大小進而控制葉片的大小，詳細基因信息見表1。于苗期(七葉期)取新生葉位的葉片，迅速置于液氮，-80 ℃保存，用RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa公司)提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性，利用反轉錄酶Primescript RT reagent Kit(TaKaRa公司)將RNA反轉錄為cDNA，采用Primer Primer 5.0軟件設計引物，以Actin為內參基因[17]，引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，序列見表2。定量體系為 20 μL，其中包含DNA 1 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水8.2 μL，3次重復。采用 2-△△Ct法[18]進行基因相對定量分析。

表1 基因信息Table 1 Gene information

表2 引物信息Table 2 Primer sequences

1.3 數據統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2018和SAS 9.4進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 葉形突變體的生長指標

不同葉形突變體的形態(tài)測量結果(表3)顯示，突變體1的葉長、葉寬顯著低于野生型，突變體2的葉長顯著低于野生型，葉寬與野生型無顯著差異。突變體1與野生型的葉形指數和葉面積均存在顯著差異，突變體1的葉形指數為野生型的2.52倍，葉面積為野生型的10.12%，該突變體最顯著的特征是葉寬生長受到抑制，其葉寬僅為野生型的25.88%。突變體2的葉形指數與野生型無顯著差異，葉面積卻顯著小于野生型，主要是葉長生長受到抑制，突變體2的葉長為野生型的78.82%。此外，突變體與野生型的葉片鮮重和干重也存在差異。突變體1與突變體2的單葉鮮重顯著小于野生型，但突變體2的葉片干重與野生型無顯著差異。突變體1的比葉重為野生型的1.91倍，突變體2的比葉重為野生型的1.35倍，說明突變體1與突變體2葉片較厚。

表3 突變體與野生型葉片形態(tài)指標Table 3 Leaf morphological indexes of wild and mutants of tobacoo plants

2.2 葉形突變體的葉片解剖結構比較

不同材料的葉片解剖結構結果(圖1A-I)可見，突變體1葉片下表皮細胞的褶皺稍弱，細胞形狀整體較規(guī)則；突變體2下表皮細胞的褶皺較強，細胞形狀不規(guī)則。與野生型相比，突變體1的海綿組織細胞排布更為緊湊，而突變體2的海綿組織細胞排布更為疏松。突變體1與野生型的葉片柵欄組織細胞大小基本一致，且排列整齊，突變體2的柵欄組織細胞排布相對雜亂。

注：A：野生型下表皮縱切面；B：突變體1下表皮縱切面；C：突變體2下表皮縱切面；D：野生型海綿層縱切面；E：突變體1海綿層縱切面；F：突變體2海綿層縱切面；G：野生型葉片橫切面；H：突變體1葉片橫切面；I：突變體2葉片橫切面；J：0.067 5 mm2視野下海綿組織的細胞數目；K：海綿組織的估算細胞總數。柱子上的不同小寫字母表示不同材料間差異在P<0.05水平有統(tǒng)計學意義。Note: A: Paradermal sections of lower epidermis of wild; B: Paradermal sections of lower epidermis of mutant 1; C: Paradermal sections of lower epidermis of mutant 2; D: Paradermal sections of spongy layer of wild; E: Paradermal sections of spongy layer of mutant 1; F: Paradermal sections of spongy layer of mutant 2; G: Cross section of the leaf lamina of wild; H: Cross section of the leaf lamina of mutant 1; I: Cross section of the leaf lamina of mutant 2; J: Cell amount in 0.067 5 mm2 area; K: Estimated cell amount. Different lowercase letters on the top of column indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level.圖1 野生型與突變體葉片解剖結構Fig.1 Leaf anatomy of wild and mutants of tobacco plants

為進一步明確突變體1與突變體2海綿組織細胞出現差異的原因，統(tǒng)計了相同視野大小中海綿組織細胞的數目，結果(圖1J)顯示，相同部位相同面積情況下，突變體2葉片的細胞數目顯著少于野生型，突變體1的細胞數目略高于野生型，但差異不顯著。通常葉片中細胞數目的不同可能會導致葉片大小差異，因此對葉片中同一層海綿組織的細胞總數進行估算，結果(圖1K)顯示，與野生型相比，突變體1與突變體2葉片中的海綿組織細胞總數均顯著減少。

野生型和突變體的不同葉片組織結構統(tǒng)計結果(表4)顯示，突變體1和突變體2的葉片厚度均顯著大于野生型。突變體1的柵欄組織厚度顯著高于野生型，而海綿組織厚度與野生型沒有顯著差異，因此突變體1葉片較厚主要是由于柵欄組織較厚。突變體2的葉片海綿組織厚度顯著高于野生型，而柵欄組織厚度與野生型沒有顯著差異，因此其葉片較野生型厚，主要是因為海綿組織更厚。突變體1、突變體2與野生型的柵欄組織/海綿組織比值均小于1，其中突變體1的柵欄組織/海綿組織比值顯著高于野生型。與野生型相比，突變體1的海綿組織細胞直徑較小，突變體2的海綿組織細胞體積較大。因此，突變體2葉片厚度的增加與海綿組織細胞體積的增加有關。

表4 突變體與野生型葉片組織結構比較Table 4 Leaf structure of WT and mutants of tobacco plants

2.3 葉形突變體的基因表達比較

12個基因在3個材料中的表達量結果見圖2，可見，突變體1中NtARF2-1、NtDA1、NtTOR1、NtARF10-2、NtEBP1、NtGRF8和NtGRF16共7個基因的表達與野生型有較大差異，其中NtEBP1基因表達量上調幅度最大，上調2.22倍；NtGRF8和NtGRF16基因表達量顯著下調，表達量分別為野生型的16.06%和13.07%。突變體2中12個基因的表達量與野生型相比均有較大的差異，其中NtTOR1和NtARF10-1表達量上調幅度較大，分別上調3.17倍和2.51倍，NtARF2-1、NtARF2-2、NtDA1、NtGRF8、NtGRF16顯著下調，其中NtGRF8、NtGRF16的下調幅度最大。在突變體1和突變體2中，NtTOR1、NtARF10-2和NtEBP1的基因表達量均顯著高于野生型，NtGRF8和NtGRF16的基因表達量均顯著低于野生型，表達量分別為野生型的13.43%和21.68%。NtARF2-1在突變體1中的表達量顯著上調，在突變體2中顯著下調。

注：不同小寫字母表示同一基因在不同材料間差異在P<0.05水平有統(tǒng)計學意義。Note: Different lowercase letters of the same gene indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level.圖2 葉發(fā)育關鍵基因的表達特性分析Fig.2 Analysis of expression characteristics of key genes in leaf development

3 討論

葉片是植物進行光合作用與呼吸作用的主要器官，煙草葉片大小是影響煙草產量與質量的重要指標之一。突變體1與突變體2的葉面積均顯著低于野生型。與野生型相比，突變體1的葉寬顯著減小，突變體2的葉長生長受到抑制。在細胞水平上，葉片的生長受細胞增殖與細胞擴張兩個過程共同調控，細胞體積增加后，細胞數量隨之下降，反之，細胞數量減少，細胞體積增加[24]。大量研究表明[15,25-26]，細胞數量與葉片大小之間存在直接的相關性，葉片大小生長受到的抑制往往與細胞數目的減少有關。本研究中，通過對葉片形態(tài)解剖學特征比較發(fā)現，突變體1與突變體2葉片細胞總數與野生型相比顯著降低，這與以往的研究結果[18]相似。突變體1同一層海綿組織細胞總數僅為野生型的10.93%，細胞體積也顯著低于野生型；突變體2的同一層海綿組織細胞總數為野生型的48.12%，細胞體積顯著高于野生型。因此，與細胞體積相比，細胞總數的減少與突變體1和突變體2的葉形變化關系更密切。在相同大小視野下，突變體1的細胞體積顯著低于野生型，細胞數目略高于野生型；突變體2的細胞數目顯著低于野生型，細胞體積顯著高于野生型。這種現象與Tsukaya[27]提出的經典細胞決定理論相同。這一理論強調了細胞狀態(tài)和行為之間相互影響，即葉片細胞數量和體積相互補償。本研究中，即使細胞數量與大小之間出現了相互補償作用，葉片的最終大小仍然受到抑制，并且在突變體1中，這種抑制作用首先體現在中-邊軸，突變體2中這種抑制作用首先體現在莖-頂軸。細胞數量與體積的補償作用是否會對葉極性發(fā)育產生影響，有待進一步探討。

目前，許多葉發(fā)育相關的關鍵基因、小分子 RNA 和生長素等調控因子被相繼發(fā)現，它們之間復雜的相互作用也得到初步地闡述。Kim等[6]研究指出，過表達AtGRF2能夠通過促進細胞體積的增加，進而促進葉面積的擴大。本研究發(fā)現，突變體1的細胞總數和體積顯著低于野生型，而且NtGRF8和NtGRF16基因的表達量顯著低于野生型，說明NtGRF8和NtGRF16基因的表達量與細胞體積密切相關，同時也可能控制細胞的數量。Li等[20]研究表明，AtDA1能夠通過限制細胞的增殖，進而抑制葉片面積的增加。本研究中，NtDA1基因的表達量顯著高于野生型，突變體1的細胞總數減少，這與Li等[20]研究結果相似。Deprost等[21]研究表明，隨著AtTOR表達量的增加，擬南芥的蓮坐葉葉面積逐漸增加，細胞大小也相應增加。本研究結果顯示，突變體2的細胞體積顯著大于野生型，并且NtTOR1和NtTOR2基因的表達量分別上調3.17和1.71倍，說明NtTOR1和NtTOR2基因的表達量與突變體2細胞體積的增加有關。Hendelman等[22]通過葉形態(tài)解剖學研究發(fā)現，過表達SlARF10后，細胞體積變小，葉片中細胞總數減少，進而抑制葉面積的增加。本研究中，突變體2的細胞總數顯著低于野生型，NtARF10-1和NtARF10-2基因的表達量顯著高于野生型，說明突變體2細胞總數的減少與NtARF10-1和NtARF10-2表達量的上調密切相關。Horváth等[23]研究指出，StEBP1表達量降低導致細胞體積增加，而過表達StEBP1則導致幼葉發(fā)育過程中細胞體積減小。本研究中，突變體1和突變體2幼葉中的NtEBP1的表達量顯著高于野生型，突變體1中的細胞體積顯著低于野生型，這與以往的研究結果相似，而突變體2中的細胞體積顯著高于野生型，結合突變體2中NtTOR1、NtTOR2和NtARF10-2的表達情況，初步推測NtTOR1和NtTOR2的高表達能夠恢復NtARF10-1、NtARF10-2和NtEBP1高表達所造成的細胞體積減小。因此，NtGRF8和NtGRF16表達量的下調與NtEBP1表達量的上調，可能是突變體1細胞體積小于野生型的原因，NtTOR1和NtTOR2表達量的上調可能是突變體2細胞體積大于野生型的原因，突變體1與突變體2中NtTOR1和NtTOR2的差異表達，可能是突變體1與突變體2細胞體積不同的原因。