基于NLRP3/caspase-1通路研究丹參提取物對(duì)系膜增生性腎小球腎炎大鼠的保護(hù)作用

邱鵬 倪曉娜

271100 濟(jì)南，濟(jì)南市人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是臨床上一種最常見的原發(fā)性腎小球疾病，約占所有原發(fā)性腎小球腎炎病理類型的50%，多見于青壯年，其高發(fā)年齡為20～39歲[1]。MsPGN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床難以治愈，是引起腎小球硬化的主要原因之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎衰竭，給患者帶來(lái)很大的心理壓力及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

中醫(yī)認(rèn)為臟腑虛損為本虛，濕熱毒疲為標(biāo)實(shí)是MsPGN的基本病機(jī)，治療關(guān)鍵是活血化瘀、清熱解毒、補(bǔ)益脾腎[3]。丹參具有清熱化瘀、消炎抗菌、抗氧化等藥理作用，在臨床中較為廣泛地用于治療腎臟疾病[4]，可治療早期糖尿病腎病，改善患者的臨床癥狀[5]。丹參注射液可降低MsPGN患兒血清中腫瘤壞死因子-α、Ⅳ型膠原水平，對(duì)治療小兒MsPGN具有較好的療效[6]，但其作用機(jī)制目前還不完全清楚。

核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域受體3[nucleotide-binding oligomerization domain(Nod)-like receptor 3，NLRP3]炎性小體參與介導(dǎo)機(jī)體多種炎癥反應(yīng)，當(dāng)其激活時(shí)，可使半胱天冬蛋白酶-1前體(pro-caspase-1)裂解為半胱天冬蛋白酶-1(caspase-1)，在腎臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，下調(diào)NLRP3/caspase-1通路，可抑制炎癥引起的細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎組織[7-8]。曹瀾瀾等[9]在對(duì)短暫性腦缺血大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸可通過(guò)抑制NLRP3/caspase-1通路減輕大鼠腦組織炎癥，降低腦損傷，表明NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是丹參治療MsPGN的作用機(jī)制。本文通過(guò)使用NLRP3炎性小體抑制劑處理MsPGN大鼠，探討丹參提取物對(duì)MsPGN大鼠腎臟的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠(SPF級(jí))購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004，質(zhì)量合格證號(hào)：41003100003162。在清潔安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)大鼠，自然光照，自由飲食、飲水，溫度為25 ℃左右，相對(duì)濕度為50%左右，噪音小于80分貝，保持飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，定時(shí)更換墊料及清理、消毒鼠籠。

2.主要試劑與儀器 丹參飲片購(gòu)自北京同仁堂(貨號(hào)：A29400170363)；VX-765(NLRP3炎性小體抑制劑)購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司(貨號(hào)：S2228)；GAPDH、NLRP3、caspase-1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自美國(guó)simga公司(貨號(hào)分別為：9007-81-2、738328)；尿蛋白定量試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒、血肌酐(Scr)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(貨號(hào)分別為：20090512、20090619、20090618)；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18及IL-1β ELISA試劑盒、兔源GAPDH、NLRP3、caspase-1一抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)分別為：ab213909、ab100768、ab181602、ab232401、ab179515、ab150077)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、TBST緩沖液購(gòu)自北京索萊寶公司(貨號(hào)分別為：P1200、T1081、L8880)；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司(貨號(hào)分別為：9108、RR037Q/A/B、639519)；RIPA裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司(貨號(hào)分別為：P0013K、P0011、C0105)。

酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司(型號(hào)：Elx800)；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司(型號(hào)分別為：1659001、Trans-Blot SD、CFX96 Touch Deep Well)；高通量DNA合成儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(型號(hào)：3900)；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司(型號(hào)：Centrifuge 5424R)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、包埋機(jī)、烤片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司(型號(hào)分別為：RM2035、EG1160、HI1220)；生物顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司(型號(hào)：YS-100)；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司(型號(hào)：2500)。

二、方法

1.動(dòng)物模型的建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[10]的方法制備大鼠模型：SD大鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，消毒后切除左側(cè)腎臟后縫合，1周后將3 mg BSA與0.1 mL CFA混勻后足墊皮下注射，每周1次，持續(xù)3周；第3周末，每只大鼠連續(xù)4次腹腔注射BSA，劑量分別為0.5、1.0、1.5、3.0 mg，次日早晨重新注射一次，劑量為0.5 mg/只。之后每日腹腔注射BSA，劑量從0.5 mg開始，每日增加0.5 mg至5 mg，以5 mg/只的劑量每日腹腔注射1周后，以6 mg/只的劑量每日再腹腔注射1周，依此每周增加1 mg至10 mg。共造模48只，分為模型組、丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物+VX-765組，每組12只。另取12只大鼠作為假手術(shù)組，只暴露左腎不摘除，并以相同方法經(jīng)足墊皮下、腹腔注射相應(yīng)量的生理鹽水。

10倍質(zhì)量75%乙醇浸泡丹參飲片1 h，利用回流裝置加熱回流30 min，過(guò)濾后收集溶液，重復(fù)3次。將3次溶液合并后減壓干燥，得到的丹參提取物浸膏純化水洗滌5次，然后噴霧干燥即可得固態(tài)丹參提取物，以高效液相色譜法檢測(cè)丹參酮ⅡA含量為2.396%[11]，參照文獻(xiàn)進(jìn)行劑量換算，加生理鹽水配制成濃度為0.15 g/mL的丹參提取物溶液。VX-765溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中制成溶液。丹參提取物+VX-765組每日給予丹參提取物(10 mL/kg)灌胃，并給予VX-765(50 mg/kg)腹腔注射[12-13]；丹參提取物組每日給予丹參提取物(10 mL/kg)灌胃，并腹腔注射等劑量DMSO；VX-765組每日給予VX-765(50 mg/kg)腹腔注射，并灌胃等劑量生理鹽水；模型組和假手術(shù)組每日腹腔注射等劑量DMSO并灌胃等劑量生理鹽水，各組均持續(xù)給藥28 d。

2.標(biāo)本采集及大鼠腎組織損傷情況檢測(cè) 末次給藥結(jié)束24 h后，各組大鼠單獨(dú)置于代謝籠中，分別收集24 h尿液儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中備用；分別經(jīng)尾靜脈取血1.5 mL，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清(血清)儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中備用。各組大鼠麻醉后處死，解剖取出腎組織，剪取約1 g儲(chǔ)存于-80 ℃中備用，其余腎組織以生理鹽水漂洗干凈，以4%多聚甲醛固定、從低濃度至高濃度的梯度酒精脫水、二甲苯透明后，浸蠟進(jìn)行石蠟包埋，以切片機(jī)做病理切片，將可用的切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精(從高到低)處理后，浸泡在純化水中，按照說(shuō)明書的步驟，以蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒進(jìn)行染色，然后再次脫水、透明，最后以中性樹膠封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理改變情況并任選5個(gè)視野拍照，根據(jù)腎小球系膜細(xì)胞增殖程度、腎小管-間質(zhì)病變程度進(jìn)行評(píng)分。

腎小球系膜細(xì)胞增殖程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]：無(wú)增殖(每系膜區(qū)系膜細(xì)胞<3個(gè))記為0分；局灶節(jié)段輕度增殖(<50%腎小球，每系膜區(qū)系膜細(xì)胞3～5個(gè))記為1分；彌漫輕度增殖(>50%腎小球，每系膜區(qū)系膜細(xì)胞3～5個(gè))記為2分；彌漫輕度增殖的基礎(chǔ)上出現(xiàn)局灶節(jié)段顯著增殖(>50%腎小球，每系膜區(qū)系膜細(xì)胞>5個(gè))記為3分；彌漫顯著增殖(>50%腎小球，每系膜區(qū)系膜細(xì)胞>5個(gè))記為4分。腎小管-間質(zhì)病變程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]：無(wú)病變記為0分；輕度局灶變性記為1分；中度局灶或輕度彌漫變性記為2分；彌漫中度以上變性記為3分。

3.尿蛋白含量、血清BUN、Scr、IL-1β及IL-18水平測(cè)定 取各組大鼠尿液、血清在4 ℃下解凍，采用各自的試劑盒測(cè)定尿蛋白含量、血清BUN、Scr、IL-1β及IL-18水平，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4.腎組織中NLRP3、caspase-1 mRNA水平的檢測(cè) 取各組大鼠凍存的腎組織約0.5 g剪碎，使用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以熒光定量PCR試劑盒后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，具體操作步驟、反映體系的配制、反應(yīng)條件的設(shè)定按照說(shuō)明書進(jìn)行，使用GADPH作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析處理，qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

5.腎組織中NLRP3、caspase-1蛋白水平的檢測(cè) 取各組大鼠凍存的腎組織約0.5 g剪碎，加入預(yù)冷的蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制劑)，勻漿機(jī)制備為勻漿液，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液(總蛋白)轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的Ep管中，按照說(shuō)明書的步驟，以BCA試劑盒測(cè)定各組樣品總蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果各組分別取含有相同質(zhì)量總蛋白的樣品液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移全部蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，浸泡在5%的脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子量截取蛋白條帶，將其置于小盒中，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后，加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗后，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，以凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像并使用Tanon軟件分析各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中Scr及BUN水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中Scr及BUN水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物組+VX-765組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中Scr及BUN水平均顯著降低(P<0.05)；與丹參提取物組及VX-765組分別比較，丹參提取物+VX-765組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中Scr及BUN水平均顯著降低(P<0.05)。(表2)

表2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中Scr及BUN水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與丹參提取物組比較，cP<0.05；與VX-765組比較，dP<0.05

二、各組大鼠腎組織損傷情況比較

假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰正常。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟呈現(xiàn)腎小球體積變大、內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量增多，系膜細(xì)胞彌漫性增生、細(xì)胞基質(zhì)增多、腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，腎小球系膜細(xì)胞增殖程度評(píng)分、腎小管-間質(zhì)病理評(píng)分顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物組+VX-765組大鼠上述病理?yè)p傷減輕，腎小球系膜細(xì)胞增殖程度評(píng)分、腎小管-間質(zhì)病理評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與丹參提取物組及VX-765組分別比較，丹參提取物+VX-765組大鼠上述病理?yè)p傷進(jìn)一步減輕，腎小球系膜細(xì)胞增殖程度評(píng)分、腎小管-間質(zhì)病理評(píng)分顯著降低(P<0.05)。(圖1、表3)

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化情況(HE，×400) A.假手術(shù)組；B.模型組；C.丹參提取物組；D.VX-765組；E.丹參提取物+VX-765組

表3 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖程度評(píng)分、腎小管-間質(zhì)病理評(píng)分比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與丹參提取物組比較，cP<0.05；與VX-765組比較，dP<0.05

三、各組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物組+VX-765組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)；與丹參提取物組及VX-765組分別比較，丹參提取物+VX-765組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)。(表4)

表4 各組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與丹參提取物組比較，cP<0.05；與VX-765組比較，dP<0.05

四、各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1 mRNA水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物組+VX-765組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1 mRNA水平均顯著降低(P<0.05)；與丹參提取物組及VX-765組分別比較，丹參提取物組+VX-765組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1 mRNA水平均顯著降低(P<0.05)。(表5)

表5 各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與丹參提取物組比較，cP<0.05；與VX-765組比較，dP<0.05

五、各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參提取物組、VX-765組、丹參提取物組+VX-765組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與丹參提取物組及VX-765組分別比較，丹參提取物組+VX-765組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。(圖2、表6)

圖2 各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果 A.假手術(shù)組；B.模型組；C.丹參提取物組；D.VX-765組；E.丹參提取物+VX-765組

表6 各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與丹參提取物組比較，cP<0.05；與VX-765組比較，dP<0.05

討 論

MsPGN是一種以腎小球彌漫性系膜細(xì)胞增生、不同程度的系膜基質(zhì)增多為主要病理形態(tài)學(xué)特征的原發(fā)性腎小球腎炎，會(huì)引起腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿、血尿、腎病綜合征、水腫、腎功能不全等多種臨床癥狀，甚至導(dǎo)致慢性腎衰竭，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[15]，目前臨床上治療MsPGN以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，但二者均療程長(zhǎng)、不良反應(yīng)大[16]，因此尋找更安全有效的藥物是當(dāng)前的臨床研究熱點(diǎn)之一。

中醫(yī)理論認(rèn)為，MsPGN的發(fā)病由腎虛濕癖引起，腎虛為本，濕熱、癖血貫穿始終，癖去方能生新，故活血化癖，有利于氣機(jī)條達(dá)，亦有助于腎陰、腎陽(yáng)化生，是對(duì)MsPGN有效的中醫(yī)治療手段。研究發(fā)現(xiàn)丹參具有活血化瘀的功效，其活性成分主要有丹參酮、丹參酸、丹參乙醇等，其中丹參酮具有去纖、抗凝、降血脂及溶栓等作用，能修復(fù)腎組織病理?yè)p傷，可治療MsPGN，改善患者臨床癥狀，恢復(fù)腎功能[6,17]，但其藥理機(jī)制目前尚不清楚。本文通過(guò)建立MsPGN模型對(duì)此進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示模型組大鼠腎組織出現(xiàn)腎小球體積變大、內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量增多，系膜細(xì)胞彌漫性增生、細(xì)胞基質(zhì)增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)等病理?yè)p傷癥狀，表明模型組大鼠腎組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，顯示系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生等典型的MsPGN病理特征。腎臟因炎癥等出現(xiàn)功能損傷時(shí)，尿蛋白含量、血清BUN及Scr水平均會(huì)升高，其含量水平高低已成為判斷腎功能受損程度的指標(biāo)[18]。IL-1β、IL-18為機(jī)體細(xì)胞合成分泌的促炎因子，可與其受體IL-1R及IL-18R相結(jié)合，觸發(fā)下游NF-κB依賴的一系列信號(hào)，導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[19]。本文結(jié)果顯示模型組大鼠尿蛋白含量、血清BUN、Scr、IL-1β及IL-18水平明顯升高，表明MsPGN大鼠血清促炎因子水平升高，引起大鼠炎癥反應(yīng)，腎功能受損，模型建立成功。

有研究表明激活NLRP3/caspase-1信號(hào)可促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-18的合成分泌，并參與調(diào)節(jié)狼瘡腎炎的發(fā)生和發(fā)展，通過(guò)抑制NLRP3/caspase-1信號(hào)，可減輕狼瘡腎炎小鼠的炎癥反應(yīng)，改善其腎功能損傷癥狀[20]。而楊天然等[21]在對(duì)痤瘡患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，丹參酮膠囊可降低患者NLRP3、caspase-1的表達(dá)，改善患者皮損情況，因而推測(cè)下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是丹參提取物治療MsPGN的藥理機(jī)制。本文結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)丹參提取物或VX-765處理的大鼠腎組織病理?yè)p傷癥狀均減輕，24 h尿蛋白含量、血清BUN、Scr、IL-1β、IL-18、腎組織NLRP3及caspase-1表達(dá)均降低，表明下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)，可減輕腎臟炎癥反應(yīng)，修復(fù)腎損傷，改善腎功能，丹參提取物和VX-765處理作用相同，揭示NLRP3/caspase-1信號(hào)是治療MsPGN的一個(gè)作用靶點(diǎn)。聯(lián)合應(yīng)用丹參提取物和VX-765處理大鼠后，大鼠腎組織病理?yè)p傷癥狀均減輕，24 h尿蛋白含量、血清BUN、Scr、IL-1β、IL-18、腎組織NLRP3及caspase-1表達(dá)均降低，表明丹參提取物和VX-765合用具有協(xié)同作用，可抑制NLRP3/caspase-1通路，減輕腎臟炎癥反應(yīng)，修復(fù)腎損傷，改善腎功能，對(duì)MsPGN大鼠的療效更好，揭示下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是丹參提取物治療MsPGN的分子機(jī)制之一。

總之，丹參提取物可減輕腎臟炎癥反應(yīng)，修復(fù)腎損傷，改善腎功能，抑制NLRP3/caspase-1通路可能是其藥理機(jī)制之一。但本文未上調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，證據(jù)不充分，存在不足，還需后續(xù)的進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。