針刺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠磷酸化P38絲裂原活化蛋白酶的影響

宋方亞，辛祺亮，趙東杰，李 琪，王玉華，董 莎，辛隨成＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院 廊坊 065001）

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫性疾病，其主要病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘，主要累及白質(zhì)區(qū)域，其發(fā)病可能與免疫反應(yīng)、病毒感染、環(huán)境及遺傳等多種因素有關(guān)，世界范圍內(nèi)大約有250 萬MS 患者[1]，患者可見感覺異常、肢體癱瘓、視力減退及共濟失調(diào)等癥狀，具有較高的發(fā)病率和致殘率。急性發(fā)作期MS 常用大量甲潑尼龍進行沖擊治療，復(fù)發(fā)型MS 常用干擾素或其他免疫抑制劑控制疾病發(fā)展。針刺可改善MS 神經(jīng)功能損傷，降低MS 復(fù)發(fā)率，提高MS 患者生活質(zhì)量，可作為MS 的補充治療手段[2]。

p38MAPK 信號通路參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡，也參與炎癥反應(yīng)的過程。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK 對CD4+T 細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞均有調(diào)節(jié)作用，影響炎性因子的產(chǎn)生以及神經(jīng)細胞修復(fù)過程，進而參與MS 的發(fā)病過程[3-4]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）與MS 具有相似的臨床癥狀與生理病理變化，目前通常通過干預(yù)EAE 模型對MS 進行研究。本實驗通過觀察針刺針刺對EAE 小鼠體重及神經(jīng)功能損傷的影響，對EAE 小鼠腦干內(nèi)p-p38MAPK 含量的影響，驗證針刺對EAE 小鼠的治療作用，探究針刺治療MS 的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡雌性C57BL/6 小鼠40 只，體重18～20 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物批號SCXK（京）20160006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，室溫20℃～24℃，相對濕度30%～50%，12 小時周期明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑

MOG35－55 多肽（北京百諾威生物有限公司，批號NJP30376），完全弗氏佐劑（結(jié)核桿菌H37Ra 終濃度為4 mg/mL 北京華菁科技有限公司，批號170597），百日咳毒素（北京百諾威生物有限公司，批號181236A1），5 mg/片醋酸潑尼松（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號017171002），0.25 mm × 25 mm 針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），磷酸化p38MAPK抗體（英國abcam公司，批號ab47363）。

1.3 動物分組

將40 只C57BL/6 小鼠稱重編號，用隨機數(shù)字表分成空白組、模型組、針刺組、激素組，每組10 只?？瞻捉M小鼠不做處理，其余組小鼠均制備成EAE小鼠。

1.4 動物模型制備

將抗原MOG35－55 用生理鹽水稀釋至濃度為10 mg/mL，并與完全弗氏佐劑按等體積混合，用注射器反復(fù)推拉，混合均勻，制備成油包水的乳劑，制成完全抗原。取模型組、針刺組、激素組小鼠，先將小鼠進行乙醚麻醉及充分固定，每只小鼠脊柱兩側(cè)分4 點皮下注射0.1 mL 抗原。在注射抗原后即刻以及注射抗原后第48小時，每只小鼠分別予500 ng百日咳毒素進行皮下注射，制備EAE 小鼠。空白組注射等體積生理鹽水。

1.5 模型評價

造模及干預(yù)過程中各組小鼠無死亡。免疫后各組小鼠均出現(xiàn)體重減輕、食欲減退、精神萎靡、動作笨拙，發(fā)病率為100%（30/30）。

每日記錄神經(jīng)功能評分，參考國際通用的5 分評分制[5]：0分：無癥狀；1分：尾張力消失，輕度步態(tài)笨拙；2 分：一側(cè)后肢無力，被動翻身后恢復(fù)；3 分：雙后肢癱瘓，刺激后可挪動；4 分：雙后肢癱瘓伴有前肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。其中，癥狀在兩者之間者，以±0.5分計算。隔日測量記錄小鼠體重。

圖1 各組小鼠免疫第0天至第28天體重變化

1.6 干預(yù)方法

造模后第14 天起，各組連續(xù)干預(yù)15 天?？瞻捉M和模型組每天進行抓取、固定，給予0.1 mL/10 g 生理鹽水灌胃。針刺組使用0.25× 25 mm 毫針，針刺小鼠“大椎”（背部正中第7 頸椎與第1 胸椎之間），直刺2～3 mm；雙側(cè)“腎俞”（第2 腰椎下兩旁），向脊柱斜刺2～3 mm；雙側(cè)“足三里”（膝關(guān)節(jié)下外側(cè)腓骨小頭下3.5 mm），直刺2～3 mm，每次留針15min。激素組進行醋酸潑尼松藥液（0.6 mg/mL，）灌胃，0.1 mL/10 g/天。

1.7 檢測指標(biāo)

免疫后第28 天，每組隨機選取3只小鼠，多聚甲醛緩沖液進行心臟灌注，沿大腦冠狀面在視交叉水平向后取3～4 mm 組織塊，制備石蠟切片，進行LFB 髓鞘染色，每只小鼠取3張切片進行p-p38MAPK 免疫組化檢測。剩余7 只小鼠處死后取腦干組織，進行pp38MAPK的WB檢測。

1.8 統(tǒng)計方法

采用sas 8.2 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊采用LSD 檢驗，方差不齊時用Welch檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組小鼠體重比較

本次實驗共40 只小鼠，實驗過程中無小鼠死亡，且30 只小鼠全部造模成功。由圖1 可以看出，空白組小鼠免疫第0 天（即模型制備當(dāng)天）至免疫第28 天體重持續(xù)增加。模型組、針刺組、激素組小鼠免疫第0天至第12天左右體重持續(xù)增加，且與空白組變化趨勢相似；免疫第12 天至第24 天，三組小鼠體重均下降，模型組小鼠體重下降最明顯，針刺組次之，激素組體重下降最少；免疫第24 天至第28 天，三組小鼠體重逐漸增加，但在實驗結(jié)束時并未超過各組第12天時的體重最高值。

表1 各組小鼠平均體重比較（±s，g）

表1 各組小鼠平均體重比較（±s，g）

注：與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與激素組相比，cP<0.05

28 d 21.79±0.47 18.30±0.44a 19.11±0.46abc 19.51±0.42ab組別空白組模型組針刺組激素組n 10 10 10 10 0 d 19.44±0.47 19.39±0.47 19.59±0.51 19.32±0.51 4 d 19.72±0.43 19.43±0.51 19.32±0.51 19.32±0.47 10 d 20.39±0.37 20.00±0.44a 19.98±0.37a 20.01±0.45a 16 d 21.09±0.43 19.74±0.41a 19.99±0.36a 20.10±0.44a 22 d 21.56±0.41 18.10±0.30a 19.01±0.40abc 19.64±0.41ab

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較（±s）

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較（±s）

注：與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與激素組相比，cP<0.05

28 d 0 2.45±0.50a 1.80±0.42abc 1.35±0.34ab空白組模型組針刺組激素組10 10 10 10 0 d 4 d 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.25±0.26a 0.20±0.26a 0.15±0.24a 0 2.30±0.26a 1.95±0.37ab 1.90±0.39ab 0 3.20±0.35a 2.65±0.34abc 2.15±0.24ab組別n d 16 d 22 d

圖2 各組小鼠免疫第0天至第28天神經(jīng)功能評分變化

由表1 可以看出，實驗開始時四組小鼠體重?zé)o差異（P>0.05）；免疫第10天，空白組小鼠體重大于模型組、針刺組、激素組（P < 0.05），模型組、針刺組、激素組三組小鼠體重?zé)o差別（P>0.05）；免疫第22天以后，模型組小鼠體重小于針刺組、激素組（P<0.05），且激素組小鼠體重大于針刺組（P<0.05）。

2.2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較

模型組、針刺組、激素組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、尾張力減弱、肢體活動不利甚至癱瘓等癥狀。由圖2可以看出，空白組小鼠由于未造模，神經(jīng)功能無損傷，整個實驗過程中神經(jīng)功能評分為0；免疫第0 天至第10 天模型組、針刺組、激素組小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀，評分為0；免疫第10天后模型組、針刺組、激素組小鼠開始出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀，神經(jīng)功能評分開始持續(xù)升高；免疫第20 天，激素組小鼠的評分開始持續(xù)下降；免疫第22 天，模型組和針刺組小鼠評分開始持續(xù)下降；免疫第28天實驗結(jié)束時模型組、針刺組、激素組小鼠評分較各組最高峰時評分均下降，但并未降至0。

由表2 可以看出，免疫第10 天，模型組、針刺組、激素組的神經(jīng)功能評分無差異（P > 0.05）；免疫第16天，針刺組和激素組神經(jīng)功能評分低于模型組（P <0.05），針刺組和激素組神經(jīng)功能評分未出現(xiàn)差異（P>0.05）；免疫第22 天以后，針刺組神經(jīng)功能評分高于激素組（P<0.05）。

2.3 各組小鼠LFB髓鞘染色結(jié)果

空白組腦組織形態(tài)正常，髓鞘致密，排列整齊，無空泡樣改變，未見脫髓鞘。模型組髓鞘排列不整齊，有大片脫髓鞘區(qū)域，空泡樣改變明顯，針刺組和激素組可見髓鞘排列不整齊，部分區(qū)域可見脫髓鞘及空泡樣改變，脫髓鞘情況較模型組輕，空泡樣改變較模型組少，見圖3。

2.4 各組小鼠腦組織p-p38MAPK免疫組化表達

空白組小鼠腦組織p-p38MAPK 水平較其他三組低（P < 0.05）。針刺組、激素組小鼠腦組織pp38MAPK 水平較模型組低（P<0.05）。針刺組小鼠腦組織p-p38MAPK 水平與激素組差異不明顯（P >0.05）。見表3。

p-p38MAPK 主要存在于EAE 小鼠腦組織胞漿內(nèi)，免疫組化陽性表達為黃色或棕黃色顆粒。空白組小鼠腦細胞形態(tài)規(guī)則，染色為多為藍色，胞漿內(nèi)可見少量黃色顆粒。模型組小鼠腦細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，胞漿呈深黃褐色。針刺組及激素組小鼠腦細胞形態(tài)較規(guī)則，胞漿染色程度較空白組深，較模型組淺。見圖4。

圖3 各組小鼠腦組織LFB染色病理片（LFB×400）

表3 各組小鼠腦組織免疫組化p-p38MAPK平均積分光密度IOD值（±s）

表3 各組小鼠腦組織免疫組化p-p38MAPK平均積分光密度IOD值（±s）

注：與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

p-p38MAPK平均IOD值（10-3）5.48±1.62 14.81±2.43a 11.88±2.74ab 10.71±2.86ab組別空白組模型組針刺組激素組n 3 3 3 3

2.5 各組小鼠腦組織p-p38MAPK蛋白WB檢測

空白組小鼠腦組織p-p38MAPK 水平較其他三組低（P < 0.05）。針刺組、激素組小鼠腦組織pp38MAPK 蛋白水平較模型組低（P<0.05）。針刺組小鼠腦組織p-p38MAPK 蛋白水平與激素組差異不明顯（P>0.05）。見表4、圖5。

3 討論

MS 是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的神經(jīng)脫髄鞘疾病。病理表現(xiàn)為CNS 內(nèi)散在的多區(qū)域白質(zhì)髓鞘脫失，最常累及腦室周圍白質(zhì)、視神經(jīng)、脊髓、腦干等部位的神經(jīng)元細胞及其軸索。由于損傷部位不同，MS 患者臨床癥狀表現(xiàn)多樣，可見多種運動障礙、感覺異常、共濟失調(diào)等[6-8]。臨床可分為原發(fā)進展型（PPMS）、繼發(fā)進展型（SPMS）、進展復(fù)發(fā)型（PRMS）和復(fù)發(fā)緩解型（RRMS）四種類型。其病因病機不明確，目前臨床以激素治療為主，激素療效不理想時可考慮使用血漿置換、靜脈注射免疫球蛋白等方法[9-10]。

表4 各組小鼠腦組織p-p38MAPK蛋白表達水平比較（±s）

表4 各組小鼠腦組織p-p38MAPK蛋白表達水平比較（±s）

注：與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

p-p38MAPK蛋白表達水平0.27±0.07 0.68±0.24a 0.42±0.19ab 0.40±0.14ab組別空白組模型組針刺組激素組n 7 7 7 7

p38MAPK 是大多數(shù)細胞內(nèi)的一類重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，活化后的p38主要以p-p38MAPK 的形式存在。細胞內(nèi)存在MKK3、MKK6等活化p38MAPK的上游激酶，以及T 細胞受體,可激活p38MAPK，使其自身磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，使用p38MAPK 抑制劑SB203580 可抑制EAE 小鼠p38MAPK 磷酸化，降低EAE 小鼠的發(fā)病率、體重損失及神經(jīng)功能損傷程度[11-13]。用蜂毒針干預(yù)EAE 大鼠“足三里”穴，發(fā)現(xiàn)炎細胞數(shù)量及炎性因子表達均減少，p-p38MAPK 的表達也減少[14]。抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)p38MAPK 通路，可減少炎性因子的產(chǎn)生，抑制EAE 的炎癥反應(yīng)[15]。由此可見，p38MAPK 信號通路在MS的發(fā)病中起著重要的作用。

圖4 各組小鼠腦組織p-p38MAPK免疫組化病理片（×400）

圖5 各組小鼠腦組織p-p38MAPK蛋白表達電泳條帶圖

中醫(yī)無“多發(fā)性硬化”病名，根據(jù)癥狀可診斷為“青盲”“風(fēng)痱”“痿證”“痹癥”，現(xiàn)多以“痿證”命名[16]。其病因包括外感和內(nèi)傷兩大類。外感溫?zé)嵝岸尽嬍硠诰?、先天不足、?nèi)傷情志、跌撲損傷等均可消耗人體氣血，疾病長期遷延致使臟腑受損，肌肉筋脈失去滋養(yǎng)，最終導(dǎo)致“痿證”。其病變部位在肌肉筋脈，但根本原因在于臟腑受損，氣血精津虧損?！杜R證醫(yī)案指南》認為“痿證”為“肝腎肺胃四經(jīng)之病”?！案文I”為先天之本，“肺胃”為后天之養(yǎng)，治療MS 多以此入手。實驗選取“大椎”穴為“陽脈之?！倍矫}上的要穴，是手足陽經(jīng)的交會穴，統(tǒng)領(lǐng)一身陽氣，既可以在MS 發(fā)病之初發(fā)散郁熱，又可以在恢復(fù)期促進氣血運行?！澳I俞”為腎的背俞穴，腎藏精，主骨生髓，腎精不足則筋骨失養(yǎng)，可見運動障礙，腎司二便，腎氣失司則見二便失調(diào)，“腎俞”穴可培補先天腎氣，濡養(yǎng)筋骨?！白闳铩睘殛柮鹘?jīng)之合穴，胃之下合穴，胃是氣血之海，氣血生化之源，為生命活動提供能量，同時脾胃主四肢肌肉，《素問·痿論》提出“治痿獨取陽明”的原則，“足三里”既能促進氣血的生成，又能條暢人體氣機。

目前，MS 以激素治療為主，但激素治療也帶來失眠、焦慮、高血壓、高血糖、胃腸功能紊亂、骨質(zhì)疏松等副作用[17]。針刺作為一種替代療法，能夠改善神經(jīng)功能殘疾、疼痛，改善疲勞狀態(tài)，提高患者生活質(zhì)量[18]。Fatemeh Shadman針刺太溪、水道、復(fù)溜、血海、關(guān)元、氣海、曲骨、中極、肓俞、命門、水分、腎俞等穴位，結(jié)果顯示針刺組前列腺癥狀評分（I-PSS）和尿路癥狀導(dǎo)致的生活質(zhì)量評分（QOLU）均低于非針刺組[19]。王春琛等[20]通過金針王樂亭經(jīng)驗方“老十針”“督脈十三針”“手足十二針”及隨癥加減穴位針刺治療，可使緩解期的復(fù)發(fā)緩解型MS 患者神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，降低年復(fù)發(fā)率。目前，關(guān)于研究p38MAPK 在MS 發(fā)病過程中的作用，以藥物治療為主，針刺干預(yù)較為少見。實驗研究發(fā)現(xiàn)針刺可以干預(yù)多種疾病的p38MAPK 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如針刺“百會”透“曲鬢”可以降低腦內(nèi)p38MAPK的表達，對大鼠腦出血后繼發(fā)性腦損傷的神經(jīng)細胞凋亡有抑制作用，起到了腦保護作用[21-22]。心肌缺血再灌注模型大鼠p38MAPK 表達上調(diào)，電針“內(nèi)關(guān)”可以明顯抑制p38MAPK 的蛋白表達，發(fā)揮其抗心肌缺血的作用[23]。因此，推測針刺可能通過對p38MAPK 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，作用于EAE。

本實驗研究結(jié)果顯示，EAE 小鼠在模型制備后體重先持續(xù)增長，在制備模型后第12 天開始，隨著小鼠中樞神經(jīng)脫髓鞘程度的增加，小鼠各項生理功能出現(xiàn)障礙，體重開始下降，針刺組體重較模型組重，表明針刺可減少EAE 小鼠的體重損失。神經(jīng)功能評分是小鼠神經(jīng)功能損傷的量化，針刺組小鼠神經(jīng)功能評分較模型組低，表明針刺可減輕EAE 小鼠的神經(jīng)損傷程度。LFB 髓鞘染色可觀察髓鞘脫失的程度，電鏡下可觀察到針刺組小鼠的神經(jīng)細胞排列較模型組致密，髓鞘脫失程度低，表明針刺可改善EAE 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失。免疫組化結(jié)果顯示在EAE 小鼠中樞神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有大量p-p38MAPK 表達，WB 檢測顯示各組小鼠的體重損失、神經(jīng)功能評分以及髓鞘脫失情況與中樞神經(jīng)細胞內(nèi)p-p38MAPK 含量有關(guān)，針刺組p-p38MAPK 表達較模型組低，表明針刺可影響EAE小鼠的中樞神經(jīng)細胞中p-p38MAPK的表達。

綜上所述，本研究通過針刺干預(yù)EAE 小鼠，驗證針刺可以改善EAE小鼠體重損失，降低EAE小鼠神經(jīng)功能損傷程度，改善EAE 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失，其作用機制可能是抑制腦內(nèi)p38MAPK 的蛋白表達，但具體作用通路還有待于進一步研究。