轉(zhuǎn)基因玉米T25數(shù)字PCR方法的建立與驗(yàn)證

李夏瑩, 武玉花, 李俊, 肖曉琳, 張飛燕,梁晉剛, 王顥潛, 張旭冬, 張秀杰*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心, 北京 100176; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所, 武漢 430062)

隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已進(jìn)入食物鏈，并擺上了餐桌，但其安全問題一直受到各國政府和廣大消費(fèi)者的關(guān)注，并引發(fā)了一系列的爭議[1]。為了保障生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，各國政府均對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識管理[2-3]。實(shí)施轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識，一方面要建立轉(zhuǎn)基因檢測方法，另一方面要研制轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是指與被測樣品具有相同或相近基體的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，是給被測物質(zhì)賦值的最有效的一類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。應(yīng)用可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可有效提高轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果的可比性、有效性和溯源性，是得到高質(zhì)量分析測定數(shù)據(jù)的保證[4-5]。但現(xiàn)階段，我國轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制已經(jīng)嚴(yán)重滯后于轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作的實(shí)際需求。為了對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行有效的安全監(jiān)管，原則上，每種批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)化體都必須研制對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測、監(jiān)測和溯源。

轉(zhuǎn)基因玉米T25為拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)，通過聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法將PAT基因表達(dá)盒P35S-PAT-T-35S導(dǎo)入非轉(zhuǎn)基因玉米中培育而成，是一種耐除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米品種。PAT基因來源于桿菌Bacillusamyloliquefaciens草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，它能使草丁膦中游離氨基乙?；Щ頪6]。PAT與已知的120多種人體蛋白無同源性[7]。目前，T25已經(jīng)在中國、美國、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國家被批準(zhǔn)進(jìn)口用作加工原料。目前，我國沒有轉(zhuǎn)基因玉米T25的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也沒有建立T25精確定量的檢測方法，故本研究研制的轉(zhuǎn)基因玉米T25標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于對轉(zhuǎn)基因玉米T25及其加工產(chǎn)品的定性和定量檢測，有效加強(qiáng)我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識制度。

本研究參照農(nóng)業(yè)部(現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部)1782號公告-8-2012《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備技術(shù)規(guī)范》的要求，研制了T25純品基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參考?xì)W盟網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室2013年發(fā)布方法[8]，自主建立了數(shù)字PCR方法(轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性定量PCR)，采用多家單位協(xié)同定值方式對研制的T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，為轉(zhuǎn)基因成分定量檢測提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1轉(zhuǎn)基因玉米T25及其受體材料 轉(zhuǎn)基因玉米T25及其受體材料由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供；轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制。

1.1.2特異性引物和探針 序列參考?xì)W盟聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室公開發(fā)布的轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性方法驗(yàn)證報(bào)告[8-10]進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物探針均由上海生工生物工程有限公司合成，其中探針5′端采用熒光標(biāo)記基團(tuán)FAM進(jìn)行標(biāo)記，3′端采用熒光淬滅基團(tuán)TAMRA進(jìn)行標(biāo)記。序列信息見表1。

表1 數(shù)字PCR引物和探針序列信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品DNA的提取 采用植物基因組提取試劑盒(德國Qiagen公司)對樣品的基因組DNA進(jìn)行提取，操作過程見試劑盒說明書。

1.2.2紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度 采用Q5000紫外分光光度計(jì)(美國Quawell)用超純水做空白，測定提取DNA溶液的A260、A280和A320紫外吸收值，計(jì)算DNA濃度。

1.2.3數(shù)字PCR擴(kuò)增 以提取的植物基因組DNA為模板，用微滴數(shù)字PCR試劑盒(美國伯樂公司)進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)4次。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×ddPCR Master Mix、10 μmol·L-1正向引物和反向引物各0.8 μL、探針0.4 μL、DNA模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性10 min；95 ℃變性15 s，57.7 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，將96 孔板置入Bio-Rad QX200微滴讀取儀中讀取信號，并使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0 分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得絕對定量結(jié)果。

1.2.4數(shù)字PCR的特異性測試 為了考察T25/Adh1二重?cái)?shù)字PCR的擴(kuò)增特異性，分別以轉(zhuǎn)基因玉米T25、MON863、MON810、NK603、MIR604、TC1507、非轉(zhuǎn)基因玉米NTC(陰性對照)的基因組DNA和ddH2O(空白對照)為模板，參照1.2.3進(jìn)行二重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增。

1.2.5數(shù)字PCR方法動力學(xué)范圍的確定 為了測試二重?cái)?shù)字PCR系統(tǒng)的動力學(xué)范圍，使用去離子水將T25基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，將DNA濃度分別稀釋至1.8×105、3.6×104、7.2×103、1.44×103、2.8×102、5.7×101和11.52 拷貝數(shù)·μL-1，之后參照1.2.3方法進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增。

1.2.6多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值 采用微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-rad和QuantStudio 3D Digital PCR System)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。選擇1號：農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物用微生物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所)、2號：農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(武漢)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所)、3號：上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院、4號：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、5號：農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(上海交通大學(xué))、6號：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、7號：上海出入境檢驗(yàn)檢疫局、8號：中國動物疾病預(yù)防控制中心(北京)共8家有資質(zhì)單位進(jìn)行聯(lián)合定值，每個(gè)單位重復(fù)8次。

為了保證數(shù)字PCR定值結(jié)果的準(zhǔn)確，在進(jìn)行正式定值之前，定值組織單位進(jìn)行了如下工作：①參加定值實(shí)驗(yàn)室均配備數(shù)字PCR設(shè)備，有熟練操作數(shù)字PCR設(shè)備的技術(shù)人員，能夠?qū)?shù)字PCR的檢測過程進(jìn)行有效地質(zhì)量控制。②對參加定值實(shí)驗(yàn)室組織數(shù)字PCR定值能力評估，證明定值實(shí)驗(yàn)室具備利用數(shù)字PCR進(jìn)行測量的能力。③對定值方法進(jìn)行了確認(rèn)，采用熒光定量PCR方法，考察了T25轉(zhuǎn)化體特異性方法和Adh1內(nèi)標(biāo)基因檢測方法的擴(kuò)增效率，保證二者的擴(kuò)增效率相近。④考察數(shù)字PCR系統(tǒng)的適用性，在數(shù)字PCR平臺上用確認(rèn)的定量方法檢測純品DNA 樣品的拷貝數(shù)比值，測量結(jié)果均接近理論值。⑤充分測定了數(shù)字PCR的有效動力學(xué)范圍[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原有標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證

參照農(nóng)業(yè)部869號公告-14-2007《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 耐除草劑玉米T25及其衍生品種定性PCR方法》[13]進(jìn)行PCR檢測。PCR結(jié)果(圖1)顯示，陰性對照和空白對照的T25基因檢測結(jié)果均為陰性；5～10號樣品的T25基因檢測結(jié)果為陽性，含有T25轉(zhuǎn)化體，但是無法滿足定量檢測的需求，故本研究擬建立數(shù)字PCR方法，以期解決轉(zhuǎn)基因含量絕對定量的問題。

注：M—分子標(biāo)記；1、2—空白對照；3、4—陰性對照；5～10—T25。

2.2 方法確認(rèn)

2.2.1數(shù)字PCR的特異性測試 不同玉米品種的T25/Adh1二重?cái)?shù)字PCR檢測結(jié)果(圖2)顯示，Adh1基因在空白對照中無陽性微滴，但在轉(zhuǎn)基因玉米MON863、MON810、NK603、MIR604、TC1507和非轉(zhuǎn)基因玉米NTC中均擴(kuò)增正常。在Adh1基因擴(kuò)增正常的情況下，T25基因只有在轉(zhuǎn)基因玉米T25中才有陽性微滴，而其他轉(zhuǎn)基因玉米品種(MON863、MON810、NK603、MIR604、TC1507)和非轉(zhuǎn)基因玉米(NTC)中，均無陽性微滴或陽性微滴數(shù)小于3，擴(kuò)增結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，T25/Adh1二重?cái)?shù)字PCR系統(tǒng)具有良好的擴(kuò)增特異性。

圖2 T25和Adh1二重?cái)?shù)字PCR特異性擴(kuò)增熱圖

2.2.2數(shù)字PCR的動力學(xué)范圍 微滴式數(shù)字PCR的理論有效線性范圍是1～120 000個(gè)拷貝，但20 μL反應(yīng)液在微滴生成器中只能產(chǎn)生12 000～16 000個(gè)有效微滴，微滴數(shù)大于10 000為有效反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA模板量為1.8×105拷貝時(shí)，所有微滴均呈陽性，超出數(shù)字PCR的動力學(xué)范圍。其他濃度微滴數(shù)字PCR的測量值分別為34 400、6 852、1 396、264、50和18拷貝。分析預(yù)期值和測量值的相關(guān)性結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板量在50～36 000拷貝之間時(shí)，通過微滴數(shù)字PCR獲得的測量值與預(yù)期拷貝數(shù)間具有良好的相關(guān)性，決定系數(shù)R2值等于1.0；而模板拷貝數(shù)低至11個(gè)拷貝時(shí)，測量值偏離預(yù)期值。當(dāng)測試樣品的濃度處于動力學(xué)范圍的中間位置時(shí)，定量結(jié)果最準(zhǔn)確。因此，推薦在配置數(shù)字PCR反應(yīng)體系前，將基因組DNA稀釋到100～10 000拷貝·μL-1之間，加2 μL DNA溶液到數(shù)字 PCR反應(yīng)體系中，使初始模板量在200～20 000拷貝，可獲得穩(wěn)定、可靠的檢測結(jié)果。

圖3 數(shù)字PCR的動力學(xué)范圍測試

2.2.3數(shù)字PCR的穩(wěn)定性檢測結(jié)果 以梯度稀釋的T25基因組DNA為模板進(jìn)行二重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)4個(gè)重復(fù)間測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果(表2)表明，在數(shù)字PCR的動力學(xué)范圍內(nèi)，隨著拷貝數(shù)的降低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差升高，但低于25%。說明測試樣品的穩(wěn)定性良好。

表2 T25/Adh1二重?cái)?shù)字PCR測量結(jié)果穩(wěn)定性分析

2.3 多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值結(jié)果

8家單位協(xié)同定值結(jié)果顯示，測定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析(表3)表明，T25轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因比值為1.001 2, 數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值較小為0.16%。對所有數(shù)據(jù)計(jì)算總平均值和總標(biāo)準(zhǔn)差，將總平均值作為轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因比值的標(biāo)準(zhǔn)值，將總標(biāo)準(zhǔn)差作為聯(lián)合定值的不確定度?？偲骄禐?.001 2，定值過程引入的不確定度(s)為0.001 6，即相對不確定度[14-17]為0.001 6，最終確定本研究的轉(zhuǎn)基因玉米T25標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為1.001 2±0.0016。通過多試驗(yàn)室協(xié)同定值說明T25/Adh1二重?cái)?shù)字PCR方法準(zhǔn)確、可靠。

表3 T25/Adh1聯(lián)合定值數(shù)據(jù)

3 討論

為保證轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識制度的順利實(shí)施，各國政府十分重視轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)體系的研究和標(biāo)準(zhǔn)化。歐盟、美國、日本、中國均展開了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的形態(tài)特征，將其分為基體(含種子顆粒和種子粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))、基因組DNA和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3種類型。研發(fā)機(jī)構(gòu)主要有歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements,IRMM)和美國石油化學(xué)家學(xué)會(American Oil Chemists’ Society, AOCS)。

歐盟為了實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識法規(guī)，位于比利時(shí)的IRMM專門成立了工作小組，建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方法和工藝流程。到2017年，歐盟IRMM針對在歐盟商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)研發(fā)了127種轉(zhuǎn)基因檢測基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、356043、305423，轉(zhuǎn)基因玉米 MON863、MON810、TC1507、Bt11和Bt176等品系，涵蓋6大作物的30個(gè)轉(zhuǎn)基因品種，每個(gè)品種有2～6個(gè)濃度梯度；IRMM還研發(fā)了4種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括轉(zhuǎn)基因玉米MON810、98140、NK603，和轉(zhuǎn)基因大豆356043。美國的轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由AOCS負(fù)責(zé)研制，主要生產(chǎn)植物基因組DNA和種子粉末這兩種形態(tài)的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其生產(chǎn)的基體粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有35種、純品基因組DNA有19種，涉及的轉(zhuǎn)化體也幾乎覆蓋目前已在國際市場上商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物。日本以及一些生物公司如SIGMA公司也制備了質(zhì)粒形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但研制的數(shù)量比較有限。另外，國外研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目前都是使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行定值，沒有實(shí)現(xiàn)絕對定量。本研究根據(jù)歐盟聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室發(fā)布的T25實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法提供的相關(guān)信息，建立并優(yōu)化了T25的微滴數(shù)字PCR方法。推薦微滴數(shù)字PCR 體系為20 μL，包含10 μL 2×ddPCR Master Mix、10 μmol·L-1正向引物和反向引物各0.8 μL、探針0.4 μL、DNA模板2 μL。微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 變性10 min; 95 ℃變性15 s，57.7 ℃退火延伸1 min(40 個(gè)循環(huán))；98 ℃變性10 min；4 ℃保存。每20 μL反應(yīng)體系的起始模板數(shù)在200～20 000拷貝。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該數(shù)字PCR方法具有良好的重復(fù)性，重復(fù)間測量結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可以滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值要求。通過8家有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室對轉(zhuǎn)基因玉米T25的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合定值得出，轉(zhuǎn)基因玉米T25粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因DNA與總DNA拷貝數(shù)比值為1.001 2，相對不確定度為0.001 6。