BRAFV600E 突變與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及對放射性碘治療后s-Tg 的影響

張小燕 王森 丁穎 李文亮 楊光 陳鴻彪 賈 建敏 楊輝

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 450008

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）起源于濾泡上皮細(xì)胞，是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的80%～85%[1]。PTC 是相對惰性的惡性腫瘤，經(jīng)過規(guī)范化的初始治療如手術(shù)、放射性碘（radioactive iodine，RAI）治療和TSH抑制后，患者的5 年生存期可高達(dá)97%[2]。BRAFV600E基因是PTC 中最常見的突變基因，人群中發(fā)生率為27.3%～90.2%[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E突變與PTC 的臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，并可獨立預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)率和病死率[2,4]。然而，也有相關(guān)文獻(xiàn)報道BRAFV600E突變與PTC 的臨床病理特征沒有關(guān)聯(lián)[5]。本研究通過分析BRAFV600E突變與PTC 臨床病理特征之間的關(guān)系，檢測甲狀腺全切或近全切術(shù)后接受2 次RAI 治療患者的刺激性甲狀腺球蛋白（stimulated thyroglobulin，s-Tg）水平及其變化趨勢，以此來評價BRAFV600E突變對RAI 治療的臨床參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年1 月至2018 年12 月于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行甲狀腺全切或近全切手術(shù)、病理證實為PTC 且行BRAFV600E基因檢測的患者2647例，其中男性599 例、女性2048 例，年齡8～84（45.00±11.70）歲。根據(jù)PTC 原發(fā)灶BRAFV600E基因突變與否，將患者分為突變組（2230 例）和野生組（417 例），回顧性分析2 組患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤長徑等臨床資料。腫瘤按長徑分為＞1 cm 組和≤1 cm 組。將長徑≤1 cm 的腫瘤定義為微小PTC。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整，包括患者基本信息、術(shù)前檢查、病理結(jié)果、RAI 治療信息及血清學(xué)信息；（2）第1 次行甲狀腺切除術(shù)；（3）行甲狀腺全切或近全切及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)，側(cè)頸淋巴結(jié)術(shù)前確診或可疑轉(zhuǎn)移者，行加側(cè)頸淋巴結(jié)清掃術(shù)；（4）均行BRAFV600E基因檢測；（5）術(shù)后病理結(jié)果證實為PTC。排除標(biāo)準(zhǔn)：與納入標(biāo)準(zhǔn)相反。

在所有PTC 患者中，選取接受過2 次RAI 治療的患者86 例，其中男性28 例、女性58 例，年齡13～77（42.72±15.69）歲，同樣分為突變組（57 例）和野生組（29 例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：2 次RAI 治療前均TSH＞30 IU/mL；停服左甲狀腺素鈉片并嚴(yán)格遵守低碘飲食3～4 周。排除標(biāo)準(zhǔn)：s-Tg 水平超過檢測范圍者；甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平超過正常范圍者。

1.2 BRAFV600E 基因突變和血清s-Tg 水平的檢測

從所有PTC 患者術(shù)前細(xì)針穿刺洗脫液或術(shù)后石蠟包埋腫瘤切片中分離出基因組DNA，按照DNA 分離試劑盒（德國Qiagen 公司）步驟進(jìn)行DNA提取，采用北京雅康博生物科技有限公司生產(chǎn)的人BRAF 基因突變檢測試劑盒[國食藥監(jiān)（準(zhǔn)）字2014第3401045 號]進(jìn)行PCR 擴增，然后使用反轉(zhuǎn)錄PCR 儀（美國安捷倫公司Stratagene Mx3000P 型）將含有特異性擴增片段的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行基因突變檢測。

86 例PTC 患者在給予3.7×109～7.4×109Bq（100～200 mCi）的131I 口服液治療前1 天均采用微粒子發(fā)光免疫分析法（美國貝克曼庫爾特有限公司，DIX800）測定s-Tg 和甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平，其正常范圍分別為1.15～130.77 ng/mL 和<4 IU/mL；檢測范圍分別為0～482 ng/mL 和0.9～2500 IU/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料用±s 表示，方差齊的數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本t 檢驗；不符合正態(tài)分布的資料采用Mann-Whitney U 秩和檢驗。采用配對t 檢驗評價s-Tg 水平與BRAFV600E突變之間的關(guān)系。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組PTC 患者臨床資料的比較

由表1 可知，2647 例PTC 患者BRAFV600E基因突變率為84.2%（2230/2647）；BRAFV600E基因突變與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，突變組的平均年齡的比例高于野生組（P=0.022）；突變組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例高于野生組（48.39%對41.97%，P=0.016）。但是，BRAFV600E突變組與野生組的性別、PTC 病灶長徑間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 RAI 治療后PTC 患者s-Tg 的水平及變化趨勢

由表2 可知，在接受2 次RAI 治療的86 例PTC患者中，第1 次RAI 治療前，2 組間s-Tg 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第2 次RAI 治療前，BRAFV600E突變組的s-Tg 水平明顯高于野生組（P=0.003）。與突變組相比，野生組2 次RAI 治療后s-Tg 水平的差值（Δs-Tg）明顯下降（P=0.006）。

3 討論

BRAFV600E突變最常見的是發(fā)生在外顯子15 上第1799 位核苷酸（T1799A）胸腺嘧啶和腺嘌呤的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致位于第600 位氨基酸上纈氨酸與谷氨酸發(fā)生置換。BRAFV600E突變主要發(fā)生在PTC 和PTC衍生的未分化甲狀腺癌中，不發(fā)生在甲狀腺的正常組織及其他類型病理組織中，BRAFV600E基因可升高絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性，激活PTC 中絲裂原活化蛋白激酶信號（mitogen-activated protein kinase signaling，MAPK）通路，從而刺激腫瘤的發(fā)生[3]。有研究結(jié)果表明，發(fā)生BRAFV600E突變的PTC患者復(fù)發(fā)率較高，可預(yù)測有較差的臨床預(yù)后[4,6]。2015 年BRAFV600E突變第1 次被納入美國甲狀腺協(xié)會（ATA）指南，用于評估患者風(fēng)險分層和初始治療后的復(fù)發(fā)風(fēng)險[7]。本研究的BRAFV600E突變率達(dá)84.2%，高于國外一些研究結(jié)果[5-6]，與國內(nèi)王維娜等[8]報道的84.54%的突變率基本一致，差異可能與高碘飲食、地域及種族有關(guān)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，BRAFV600E突變組PTC 患者的年齡高于野生組，Huang 等[1]的相關(guān)研究同樣證實了BRAFV600E突變更容易發(fā)生在老年患者中，Trovisco 等[5]的研究結(jié)果表明，突變組患者的平均年齡高于野生組，證實較年長的患者更容易發(fā)生BRAFV600E突變，從而刺激甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生或是BRAFV600E突變本身進(jìn)展較慢。

表1 2 組甲狀腺乳頭狀癌患者臨床資料的比較Table 1 Comparison of papillary thyroid cancer patients' clinical data between two groups

表2 2 組PTC 患者在首次RAI 治療后s-Tg 水平及變化趨勢的比較Table 2 Comparison of s-Tg level and change trend of papillary thyroid cancer patients after first radioactive iodine therapy between two groups

PTC 病灶殘留和復(fù)發(fā)的主要原因是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示，BRAFV600E突變組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于野生組，這表明BRAFV600E突變的PTC 患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，我們重點分析BRAFV600E突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。MAPK（RET/PTC→Ras→Raf→MEK→ERK）通路在PTC細(xì)胞的生長、增殖和血管生成等方面起關(guān)鍵作用，MAPK 通路的生理激活是由大量激素及細(xì)胞因子通過細(xì)胞上的受體觸發(fā)的，而BRAFV600E突變可改變細(xì)胞的生物活性，最終刺激腫瘤發(fā)生[4]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB ，NF-κB）是可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及影響PTC 細(xì)胞的抗凋亡、侵襲特性的轉(zhuǎn)錄因子，因此NF-κB 通路的激活可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E激活NF-κB通路可能是直接發(fā)出信號的，具體可能的機制是BRAFV600E突變不僅能激活MAPK 通路還可激活NF-κB 信號通路，激活的NF-κB 可誘導(dǎo)PTC 中的抑癌基因金屬蛋白酶（metalloproteinase，TIMP）在甲狀腺細(xì)胞中的甲基化，破壞基底膜來促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12-14]。近年來有文獻(xiàn)報道，BRAFV600E突變與miRNAs 的過表達(dá)相關(guān)[4]，且在發(fā)生BRAFV600E突變的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者中發(fā)現(xiàn)miR-221過表達(dá)[15]，miR-221 可通過抑制TIMP 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。NF-κB 通路中的一種重要蛋白組成P65 亞單位，通過與miR-221 基因的遠(yuǎn)端增強子區(qū)域結(jié)合，可促進(jìn)miR-221 的過表達(dá)[17]。因此，我們考慮BRAFV600E突變可能通過激活NF-κB通路中的P65 入核使miRNA 的表達(dá)失調(diào)，從而抑制TIMP 的表達(dá)、破壞基底膜，促進(jìn)PTC 的臨近侵襲，進(jìn)而出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

碘化物通過甲狀腺細(xì)胞膜上的鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運體（sodium/iodide symporter，NIS）轉(zhuǎn)運到甲狀腺濾泡中，在濾泡中，碘被甲狀腺過氧化物酶氧化，并與甲狀腺球蛋白（thyroglobulin, Tg）中的酪氨酸殘基結(jié)合形成甲狀腺激素。術(shù)后Tg 是一個可預(yù)測疾病持續(xù)發(fā)展或復(fù)發(fā)的獨立因素，Tg 水平升高，疾病的復(fù)發(fā)風(fēng)險隨之增加[18]。在本研究中，我們從總樣本中又篩選出接受2 次RAI 治療的86 例PTC患者，分析其s-Tg 水平及變化趨勢。結(jié)果表明第2 次RAI 治療前，BRAFV600E突變組的s-Tg 水平（61.61 ng/mL）明顯高于野生組（18.56 ng/mL），且與突變組相比，野生組的Δs-Tg 水平明顯下降。這與楊珂等[19]報道的結(jié)果基本一致：在多次RAI 治療后，突變組大多數(shù)患者（7/9）Tg 水平保持穩(wěn)定，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶不攝碘；而野生組多數(shù)患者（66.7%）轉(zhuǎn)移灶攝碘且Tg 水平下降，顯示BRAFV600E突變的患者在RAI 治療后Tg 水平改善較差，且預(yù)后不良。RAI 治療的有效性主要依賴于位于甲狀腺細(xì)胞膜上的NIS，而在碘代謝過程中，BRAF 基因可以通過MAPK 通路阻斷Tg 和NIS 的表達(dá)，并影響NIS 轉(zhuǎn)錄后膜的定位，且突變組中的Tg、甲狀腺過氧化物酶、NIS 的mRNA 表達(dá)水平明顯要低，導(dǎo)致其攝碘能力下降[20-21]，RAI 治療的效果下降。近年來相關(guān)文獻(xiàn)報道，miR-146 在BRAFV600E突變的PTC 中表達(dá)水平明顯增高，miR-146a-3p 可直接與NIS 結(jié)合并抑制NIS 的表達(dá)，進(jìn)而抑制RAI 的吸收，且miR-146 的表達(dá)與Tg 水平和疾病發(fā)展、預(yù)后不良呈正相關(guān)，且在長期隨訪過程中miR-146表達(dá)水平高的患者總體生存率較低，對PTC 患者的預(yù)后有預(yù)測價值[22-24]，BRAFV600E基因可能通過調(diào)控miRNA的過表達(dá)，破壞NIS 的攝碘能力，降低RAI 治療的效果。這表明BRAFV600E突變的PTC患者攝碘能力較差，對RAI 治療不敏感，臨床預(yù)后較差，更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在臨床工作中可以在進(jìn)行RAI 治療前，對發(fā)生突變的患者進(jìn)行評估，可以加大第1 次的治療劑量或在隨訪過程中密切觀察。

我們在分析BRAFV600E突變與PTC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系中，納入了大量的樣本，因此數(shù)據(jù)具有較高的參考價值。但是，本研究中存在一些局限和不足：（1）有文獻(xiàn)報道BRAFV600E突變除與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，還可能與腺外侵犯、多灶、腫瘤分期等侵襲性臨床病理特征有關(guān)[4]，然而本研究未將這些病理特征納入；（2）Tg 水平變化還可受到手術(shù)方式、術(shù)后殘余甲狀腺體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素的影響，本研究因條件限制未能進(jìn)一步分析，未來有待豐富數(shù)據(jù)后做進(jìn)一步研究；（3）有相關(guān)文獻(xiàn)表明，BRAFV600E突變與淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、RAI 療效及長期患者預(yù)后有關(guān)[1,2,4,19]，待將來擴充樣本量和延長隨訪時間進(jìn)一步觀察。

綜上，本研究結(jié)果顯示BRAFV600E突變易在老年患者中發(fā)生，與PTC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且在初始治療中有較差的臨床預(yù)后。BRAFV600E突變?yōu)樵u估PTC 患者的疾病風(fēng)險分層和預(yù)測RAI 的療效提供了分子水平的參考依據(jù)，在未來，其與miRNAs結(jié)合可在PTC 患者的早期診療、預(yù)后及隨訪中發(fā)揮重要作用。