鞘糖脂的人工合成體系研究進展

陳曉輝，張 雪，楊廣宇

(上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海200240)

鞘糖脂(glycosphingolipids,GSLs)作為一類典型的糖脂類化合物，是真核生物細胞膜的重要組成部分；在原核生物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了部分鞘糖脂，如在腸道微生物BacteroidesfragilisNCTC 9343中的α-半乳糖神經(jīng)酰胺α-GalCerBf和GSL-Bf717，赫希氏大腸桿菌溶解病毒株86(EhV86)包膜中的十四酰GSLs[1-2]。它們在細胞識別、細胞免疫、細胞凋亡及病原入侵等多種生理活動中發(fā)揮重要作用，并且與神經(jīng)退行性疾病、溶酶體貯積癥和癌癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。細胞表面GSLs可以與其他細胞表面的GSLs相互作用參與細胞識別，也可以調(diào)節(jié)細胞表面受體蛋白參與信號傳導(dǎo)[4]。此外，GSLs通常是病毒、細菌和原生動物入侵宿主的識別靶標，與傳染性疾病密切相關(guān)。GSLs還參與激發(fā)多種細胞的先天型和適應(yīng)型免疫系統(tǒng)，也和腫瘤細胞的生長、發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。含有唾液酸的酸性GSLs被稱為神經(jīng)節(jié)苷脂類，它們以高濃度存在于大腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)中，在胚胎發(fā)生和嬰兒的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[6]。

多種GSLs具有潛在的藥用價值，神經(jīng)節(jié)苷脂具有治療帕金森病和阿爾茨海默癥的潛力[7-8]。科學家還發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞中存在GSLs的異常表達，因此GSLs可以作為治療性疫苗的靶標，在癌癥治療中具有潛在應(yīng)用，如含有巖藻糖基的鞘糖脂Globo H的衍生物GloboH-KLH-QS21已經(jīng)進入臨床三期用于治療乳腺癌[9]，而Fucosly-GM1a的衍生物Fuc-GM1-KLH-QS21也具有作為疫苗用于治療小細胞肺癌的潛力[10]。在2015年，一種人類-小鼠抗GD2嵌合單克隆抗體獲得批準，用于聯(lián)合治療高風險兒童神經(jīng)母細胞瘤[11]。

然而，GSLs在生物體內(nèi)含量很低，并且具有高度的微觀結(jié)構(gòu)不均一性，導(dǎo)致從動植物組織中進行GSLs的提取效率極低。近年來，基于人工化學酶法合成及人工細胞工廠等人工生物合成研究為解決GSLs的大量獲取問題提供了新的途徑。

1 鞘糖脂類的簡介及天然生物合成途徑

GSLs是典型的雙親性分子，由親水性的寡糖鏈與疏水性的神經(jīng)酰胺以糖苷鍵相連而成，其中神經(jīng)酰胺又可被分為鞘氨醇堿基及脂肪酸，二者以酰胺鍵相連(圖1)。按其寡糖鏈的四糖核心序列結(jié)構(gòu)，GSLs通?？杀环譃?類[12]。脊椎動物的GSLs主要屬于ganglio、globo和neolacto系列；而在無脊椎動物中，mollu和arthro系列GSLs占主導(dǎo)地位[13]。GSLs的鞘氨醇堿基主要分成3種：D-鞘氨醇(D-sphingosine)、二氫鞘氨醇(dihydrosphingosine)和植物鞘氨醇(phytosphingosine)[14]。而GSLs中的脂肪酸種類主要是含有14～36個碳原子的飽和脂肪酸鏈，但也有含有雙鍵或者2-羥基化修飾的脂肪酸鏈的GSLs存在[15]。由于GSLs的寡糖鏈模塊、鞘氨醇堿基模塊及脂肪酶模塊均具有豐富的結(jié)構(gòu)修飾類型，它們互相組合構(gòu)成了數(shù)量極為龐大的鞘糖脂類化合物家族，預(yù)計自然界中存在至少10萬種以上(www.sphingomap.org)。對鞘糖脂類在生物體內(nèi)不同生理和發(fā)育狀態(tài)下的組成、結(jié)構(gòu)和生理功能的研究催生了“鞘糖脂組學”(Glycosphingolipidology)這一新的研究領(lǐng)域。

GSLs的天然生物合成首先發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細胞質(zhì)面，絲氨酸和棕櫚酰-輔酶A通過聚合反應(yīng)形成3-酮二氫鞘氨醇，之后經(jīng)過脫氫、?；纫幌盗蟹磻?yīng)生成神經(jīng)酰胺。之后神經(jīng)酰胺被轉(zhuǎn)移到高爾基體中，經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶的催化形成葡萄糖神經(jīng)酰胺或半乳糖神經(jīng)酰胺[13]，作為合成后續(xù)GSLs的重要中間體。其中，葡萄糖神經(jīng)酰胺在乳糖神經(jīng)酰胺合酶的催化下進一步轉(zhuǎn)化為乳糖神經(jīng)酰胺(LacCer)，并通過一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的級聯(lián)催化形成asialo、ganglio、globo/iso-globo和lacto/neo-lacto等系列GSLs。而半乳糖神經(jīng)酰胺經(jīng)過唾液酸酸化后產(chǎn)生GM4神經(jīng)節(jié)苷脂，或硫酸化以產(chǎn)生硫苷脂(圖2)。這些合成后的GSLs通過囊泡運輸?shù)劫|(zhì)膜，形成脂質(zhì)微區(qū)域發(fā)揮其各自的生理功能[3]。

圖1 一種典型的GSLs(神經(jīng)節(jié)苷脂GT1a)的化學結(jié)構(gòu)[4]Fig.1 A typical GSL (ganglioside GT1a) structure[4]

圖2 人體內(nèi)的GSLs天然合成途徑[3]Fig.2 Natural synthesis pathway of glycosphingolipids in human[3]

2 鞘糖脂的化學酶法合成

GSLs的化學全合成已經(jīng)有較多報道[16-17]。但化學合成GSLs需要極為繁瑣的保護/去保護步驟來保證其結(jié)構(gòu)中嚴謹?shù)膮^(qū)域選擇性與立體選擇性，存在耗時費力、產(chǎn)率低及污染重等缺陷。近年來，科學家開始嘗試利用微生物酶良好的特異性與高效的催化能力構(gòu)建GSLs合成的化學酶法及細胞工廠合成體系，為鞘糖脂類的研究提供了新的機遇。對GSLs的生物合成大體可以分為3個步驟：寡糖鏈模塊的合成、鞘氨醇模塊與寡糖鏈模塊的拼接以及脂肪鏈模塊組裝，下面分別就這三部分的進展進行介紹。

2.1 糖鏈模塊的合成

GSLs的寡糖鏈合成以乳糖為核心起始，在一系列具有高度特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶催化下形成各類寡糖(圖3)[4]。由于糖基轉(zhuǎn)移酶需要昂貴的糖核苷酸作為供體底物，因此人們也開發(fā)了可以高效產(chǎn)生糖核苷酸的酶促合成體系，大大降低了寡糖合成的成本[18-20]。

Blixt等[21]利用一系列糖基轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)了GD3、GT3、GM2、GD2、GT2和GM1等GSLs寡糖的合成，可以達到克級產(chǎn)量。他們使用的初始底物乳糖以2-疊氮乙基修飾，這種衍生物可以用于競爭性抑制反應(yīng)中，并有利于與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等進行連接[21]。Tsai等[22]通過體外酶法合成Globo五糖(Gb5)、階段特異性胚胎抗原4(SSEA4)等GSLs，產(chǎn)量也達到了克級，可用于后續(xù)的癌癥疫苗及治療的評價和開發(fā)。

陳希課題組的Yu等[18]對合成路徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶進行了整合應(yīng)用，系統(tǒng)開發(fā)了用于完整神經(jīng)節(jié)苷脂及寡糖鏈合成的一鍋多酶合成體系(one-pot multienzyme systems，OPME)，在該合成體系中，把合成糖核苷酸供體的相關(guān)酶與糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，可以用簡單的單糖為底物實現(xiàn)復(fù)雜糖鏈的模塊化合成，并且產(chǎn)率都在90%以上。該課題組還利用OPME合成了神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖GM3、GM2、GM1、GD3和GD2等，并以化學合成的乳糖苷鞘氨醇(LacβSph)為底物，利用OPME糖基化反應(yīng)完成糖鏈的延伸，最終再用化學法進行?；铣赏暾纳窠?jīng)節(jié)苷脂，實現(xiàn)了GD2、GD3及巖藻糖基化GM1的全合成[19-20]。

Geert課題組的Li等[23]開發(fā)了一種GSLs的磺酸鹽標簽，能實現(xiàn)合成中間產(chǎn)物的高效固相萃取和分離，并建立了一種化學酶法合成寡糖的全自動化平臺，可以自動進行多達15個合成反應(yīng)循環(huán)，合成不同種類的復(fù)雜聚糖，包括聚n-乙酰氨基內(nèi)酯衍生物、人乳寡糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和n-聚糖等。

曹鴻志課題組的Lu等[24]開發(fā)了一個氧化還原體系控制的新底物工程策略，該策略是在寡糖的酶法模塊化組裝中加入對不需要唾液酸酸化位點進行選擇性氧化的步驟，從而實現(xiàn)了在未氧化位點上的位點專一性唾液酸酸化，再通過對氧化部位進行還原得到目標產(chǎn)物。2019年，該課題組的Ye等[25]進一步拓展了該底物工程策略，利用唾液酸酸化和巖藻糖糖基化的競爭反應(yīng)來精準控制巖藻糖基化的修飾位點，最終合成了22個結(jié)構(gòu)均一的Lewis系列具有抗原活性的復(fù)雜糖鏈。

圖3 神經(jīng)節(jié)苷脂類鞘糖脂、globo-/isoglobo-類鞘糖脂和lacto-/neolacto-類鞘糖脂的合成[4]Fig.3 Synthesis of ganglio glycosphingolipids,globo-/isoglobo-sphingolipids and lacto-/neolacto-sphingolipids[4]

圖4 在大腸桿菌中構(gòu)建的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1寡糖鏈的人工生物合成途徑[26]Fig.4 Metabolically engineered pathway of GM1 oligosaccharide biosynthesis in E.coli[26]

體外酶法合成需要對所用到的酶蛋白分別進行表達、提取和純化，操作步驟較為繁瑣，而利用代謝工程手段將相關(guān)酶基因組成代謝途徑，一并在宿主中進行表達構(gòu)建細胞工廠，可以更為高效地實現(xiàn)目標產(chǎn)物的合成。2003年，Antoine等[26]首先將糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶等酶的基因?qū)氪竽c桿菌，構(gòu)建了一株可以合成GM1寡糖鏈模塊的大腸桿菌菌株(圖4)；在添加唾液酸和乳糖受體的情況下，每升大腸桿菌發(fā)酵液可產(chǎn)生0.89 g的GM1寡糖鏈和1.25 g的GM2寡糖。2005年，該小組的Antoine等[27]對該系統(tǒng)進行進一步改造，從而能生產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3寡糖鏈，產(chǎn)量達到0.83 g/L，顯示了該系統(tǒng)在合成寡糖類化合物方面具有良好的可塑性。2009年，Randriantsoa等[28]進一步利用來自于Helicobacterpylori的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FutC)實現(xiàn)了六糖Globo H寡糖鏈的合成。2019年，筆者所在課題組的劉新平等[29]在大腸桿菌JM107中構(gòu)建了以氟化乳糖和唾液酸為底物的GM3、GM2和GM1這3種α位氟化寡糖的生物合成途徑，實現(xiàn)了氟化神經(jīng)節(jié)苷脂類寡糖在大腸桿菌中的人工生物合成途徑，為后續(xù)神經(jīng)節(jié)苷脂類的全合成打下基礎(chǔ)。

2.2 鞘氨醇模塊的組裝

鞘糖脂內(nèi)切糖苷酶可以特異性水解GSLs中連接寡糖鏈和神經(jīng)酰胺之間的糖苷鍵。1998年，Mackenzie等[30]首次提出，將糖苷酶活性中心的親核殘基突變?yōu)椴痪邆溆H核功能的氨基酸，可以去除其天然水解活性；與此同時，利用具有自我奪電子能力的氟化糖作為糖基供體，則可以使糖苷水解酶變成糖苷合成酶，有效催化糖苷鍵的合成(圖5)。Caines等[31]通過對來自于馬紅球菌Rhodococcussp.M- 777的天然水解神經(jīng)節(jié)苷脂的鞘糖脂內(nèi)切酶EGCase Ⅱ進行了分子改造，將其轉(zhuǎn)化為GSLs的糖苷合成酶，相應(yīng)產(chǎn)率達到了95%；之后他們對EGCase Ⅱ再次進行了改造，將其催化糖苷鍵合成的活性提升了3倍，并對非天然底物植物鞘氨醇產(chǎn)生了明顯的催化活性[32]。在此之后，筆者所在課題組的李卓等[33]對該酶做進一步改造，將其催化糖苷鍵合成的活性又提升了2倍。

圖5 糖苷合成酶EGCase合成lyso-GM1的反應(yīng)機制Fig.5 Mechanism of EGC glycosynthase-catalyzed synthesis of lyso-GM1

鞘氨醇是GSLs合成中的關(guān)鍵中間體。2012年，德國的Schorsch等[34]利用代謝工程的方法，優(yōu)化了Pichiaciferrii中四乙?；参锴拾贝?TAPS)的合成代謝途徑并過量表達合成途徑中的關(guān)鍵酶，使得該菌生產(chǎn)四乙?；参锴拾贝嫉漠a(chǎn)量達到199 mg/g。隨后德國贏創(chuàng)公司的Schaffer Steffen研究小組對Pichiaciferrii菌株進行改造，獲得了1株能夠大量產(chǎn)生三乙?；拾贝嫉墓こ叹?，在搖瓶中三乙酰基鞘氨醇的產(chǎn)量為240 mg/L，實驗室規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)量達到890 mg/kg，而三乙?；拾贝荚俳?jīng)過兩步化學催化即可獲得D-鞘氨醇[35]。

2.3 脂肪鏈模塊的組裝

鞘糖脂N-去?；?sphingolipid ceramideN-deacylase，SCDase)是一種雙功能酶，同時能夠催化鞘糖脂中脂肪酸鏈和鞘氨醇鏈之間酰胺鍵水解或合成，可以應(yīng)用于溶血GSLs(lyso-GSL)的制備和GSLs脂肪鏈的組裝。1988年，Hirabayashi等[36]首次在Nocardiasp. 中發(fā)現(xiàn)具有這種活性的酶。1995年，Ito課題組的B?rgel等[35]在Pseudomonassp.TK4也發(fā)現(xiàn)這種活性的酶，首次命名為SCDase。迄今為止，已有4個具有SCDase活性的酶被報道，分別來自于Nocardiasp.[34]、Pseudomonassp.[37]、Streptomycessp.[38]和ShewanellaalgaG8[39]。筆者所在課題組的Han等[40]對來源于ShewanellaalgaG8中的SCDase進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)其催化活性可以與EGCase實現(xiàn)耦聯(lián)，不需中間純化步驟即可合成完整的神經(jīng)節(jié)苷脂，并首次成功建立了鞘糖脂模塊的體外酶法組裝體系。他們利用反應(yīng)工程策略，通過調(diào)控反應(yīng)體系實現(xiàn)了SCDase水解活性與合成活性的拆分，產(chǎn)率均達到95%以上，并發(fā)展了高效的GM1脂肪酸模塊酶法替換體系，制備了一系列含不飽和脂肪酸的GM1衍生物[41]。

3 總結(jié)與展望

目前GSLs的化學酶法合成取得了很多成績，一鍋多酶法(OPME)、代謝工程等新技術(shù)的發(fā)展也進一步完善了其生物合成體系。然而，目前許多GSLs合成的關(guān)鍵酶還存在活性低、底物譜窄等缺陷，而相關(guān)細胞工廠構(gòu)建也僅處于初始階段。在未來，對關(guān)鍵酶進行新基因挖掘、分子改造與定向進化以及利用合成生物學技術(shù)提升細胞工廠的系統(tǒng)整合能力，將有助于拓展人類合成此類關(guān)鍵化合物能力。相信隨著GSLs人工合成研究的進一步發(fā)展，加強對GSLs結(jié)構(gòu)與功能的認識，可以促進對其生理功能、作用機制及相關(guān)藥物開發(fā)的研究。