一種改良型檢測群體感應信號分子的TLC方法

王 艷, 張士春, 周 進

(1. 深圳職業(yè)技術學院，深圳 518055; 2. 深圳市水產行業(yè)協會，深圳 518055; 3. 清華大學 深圳研究生院, 深圳 518055)

群體感應(Quorum sensing，QS)是細菌間的密度調節(jié)信號，被視為細菌的通訊語言。根據細菌分類、信號分子和感應機制的不同，QS系統(tǒng)主要分為3類：LuxR/AI-I系統(tǒng)(主要是革蘭氏陰性菌)，LuxS/AI-2寡肽類系統(tǒng)(革蘭氏陽性菌為主、陰性菌為輔)，以及適應于種間交流的AI-3系統(tǒng)[1]。至今已確認多種AI-1和AI-2信號，如?；呓z氨酸內酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，寡肽類化合物、芳香醇類化合物、二酮哌嗪類化合物(Di-keto-piperazines, DKP)，2-庚基-3-羥基-4-喹啉 (2-Heptyl-3-hydroxy-4-quinolone)以及呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)等[2]。這些信號的存在可調節(jié)細菌的群體行為以應對環(huán)境的變化，包括生物熒光的產生、生物被膜(biofilm)的形成、毒力基因的表達以及環(huán)境條件的適應等[3]。

目前，以AHL分子為代表的AI-1類信號物是研究最為廣泛的一種，大量應用于醫(yī)學領域，如開發(fā)抗生素替代藥品，合成AHL降解酶或阻斷劑降低細菌的感染能力以及封閉有害菌的毒素分泌開關等[4]。此外，在醫(yī)藥中應用AHL系統(tǒng)的另一個典型例子是抑制微生物被膜的產生。微生物被膜的形成與病原菌的耐藥性息息相關[5]，而AHL對細菌膜的形成、發(fā)展與成熟具有直接的調節(jié)作用[5]。因此，通過調控AHL系統(tǒng)來干擾病原菌生物被膜的形成是控制細菌性疾病的有效手段。近10年來，隨著AHL認識的深入和學科交叉的發(fā)展，AHL的應用領域得到進一步延伸，已擴展到污水治理、海洋防污、生態(tài)修復以及健康養(yǎng)殖等領域[6]。

為了在微生物領域更多地挖掘和開發(fā)AHL菌株或AHL產物，針對AHL分子的有效檢測成為人們關心的議題。目前用于檢測AHL信號的方法主要包括生物檢測和理化檢測。前者主要是利用報告基因(如luxAB、lacZ及gfp等)構建生物感應器或報告菌株，如紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136和KYC55等，通過顯色反應來判斷信號的存在[7]。后者一般使用色譜技術，如液相色譜(HPLC)，該方法不僅能定量、定性分析信號分子的性質，同時還可以連接質譜、核磁共振來鑒定化合物的結構[8]。然而，HPLC操作復雜、費用昂貴、人員專業(yè)背景要求高，限制了其推廣的步伐；另一種相對簡單的色譜技術為薄層色譜(Thin Layer chromatograph，TLC)，它在精確性上雖不如HPLC靈敏，但是操作簡單、使用靈活、無需昂貴儀器，在成本上具有顯著優(yōu)勢，因而備受定性檢測的青睞[9]。傳統(tǒng)的TLC檢測法，即采用報告菌株、水解顯色劑X-gal以及半固體培養(yǎng)基三者混合后平鋪于TLC板上，通過生物顯色反應來進行AHL物質的判斷。但該檢測方法存在一些不足，包括顯色不均勻、藍色斑點有浸潤、顯色圈過大及視覺效果有偏差等問題。因此有必要進行優(yōu)化與改進，建立一種更為有效、分辨率更高的檢測技術。因此我們開發(fā)了一種基于制膠板的TLC方法，以期改觀傳統(tǒng)方法在操作程序和檢測結果上的不足。

1 研究方法

1.1 菌株及試劑

實驗中所用AHL檢測菌株為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136 (pCF218)，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基(包含壯觀霉素Sp 50 μg/mL 和四環(huán)素Tc 4.5 μg/mL)。另一種菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAO1，它具有產C4-AHL和3-oxo-C12-AHL的能力，在本次實驗中作為AHL模式菌株。

壯觀霉素Sp、四環(huán)素Tc、X-gal(5-溴4-氯3-吲哚β-半乳糖苷)、AHL標準品C6-(貨號10940-25MG)，3-O-C8-(貨號17247-25MG)，C9-(貨號17650-25MG)，C11-(貨號10937-25MG)和C14-AHL(貨號09139-25MG)購自Sigma公司，RP-C18 F254s 反相薄層板(TLC板)購自德國Merck公司。

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基的制備，準確稱取蛋白胨(Typtone) 1.0 g，酵母提取物(Yeast Extract) 0.5 g，氯化鈉(NaCl) 1.0 g，加雙蒸水(ddH2O) 至100 mL，充分混勻溶解，高壓蒸汽滅菌(121℃)15 min。LB半固體培養(yǎng)基(軟培養(yǎng)基)的制備采用在上述LB液體成分中加入1%的瓊脂粉后滅菌制得。

其他化學試劑包括二甲基亞楓DMSO、乙酸乙酯、甲醇、乙醇以及醋酸等，均為分析純，購置于上海國藥試劑公司。

1.2 銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAO1 AHL化合物的抽提

將單克隆PAO1菌株接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)得到一級種子，將一級種子加入到含有500 mL LB液體培養(yǎng)基于30 ℃、220 r/min條件下擴大培養(yǎng)24 h。收集發(fā)酵液，4 ℃離心20 min(6000 r/min)，用0.22 μm的濾膜對離心的上清進行過濾除雜。收集到的上清液與乙酸乙酯1∶1混合，裝于1L分液漏斗中充分混合，萃取30 min。獲得有機相在旋轉蒸發(fā)儀上進行蒸餾(45 ℃)，風干的抽提物用1 mL甲醇溶解，用1.0 μm的有機相濾膜進行過濾，得到AHL分子提取物。

1.3 制膠板的設計

根據待鋪TLC薄層板的大小(20.0 cm×20.0 cm)，設計了一個外部尺寸為20.5 cm×20.5 cm的制膠板，其中內部使用面積20.2 cm×20.2 cm，四周帶有凹槽(配有4根插條，插條高度0.5 cm)，用于制作半固體培養(yǎng)基的基座，具體如圖1所示。制膠板的制作材料為有機玻璃(亞克力，型號PMMV-0A1，深圳)。

A：顯示主板平面圖和4根插條，主板四周設計有凹槽；B：顯示安裝好插條的平面圖；C：示裝好插條的側方圖

圖1用于制備半固體培養(yǎng)基的制膠板

Figure 1 The preparing-gel plate for making the semi-solid medium

1.4 改良型TLC法的操作步驟

傳統(tǒng)TLC法：將AHL標準品2～3 μL點樣于C18反相薄層板上，以甲醇/水(60∶40，V/V)作為流動相充分展開后，揮干溶劑，按文獻[7]的方法制備上層半固體培養(yǎng)基鋪于TLC板上。簡要操作方法如下：配置50 mL半固體LB培養(yǎng)基，滅菌后待冷卻到45 ℃左右(避免瓊脂凝結成塊)，無菌操作將過夜培養(yǎng)的3 mL 根癌農桿菌A136菌液接入半固體培養(yǎng)基搖勻，再添加50 μL(60 μg/μL)的X-gal，輕搖后鋪于TLC板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱48 h后觀察結果。此過程中根癌農桿菌A136作為報告菌株檢測AHL信號，陽性為藍色，陰性為無色。

改良型TLC法：按上述同樣的方法點樣、跑板、揮干后，將后續(xù)的程序分解成兩步。操作方法如圖2所示。首先，用冷卻到45 ℃左右的100 mL半固體培養(yǎng)基與6 mL 根癌農桿菌A136菌株混合，輕輕搖勻后鋪板，制備成厚度約為3～4 mm的薄層培養(yǎng)基，于室溫冷卻凝固。隨后，用除菌硬質膠板托起整張凝固好的薄層培養(yǎng)基，一端輕輕接觸TLC板，緩慢覆蓋，以類似手機貼膜的方式向前平鋪，直至整張培養(yǎng)基完好貼合于TLC板上方，操作過程注意排除氣泡。最后，待貼合過程完成后，使用微生物涂布棒將100 μL濃度為20 μg/μL的X-gal均勻涂步于培養(yǎng)基上方，待X-gal液體吸收后，置于28 ℃培養(yǎng)箱，24～48 h后觀察結果。

不同碳鏈長度的AHLs經薄層層析展開后，在有AHLs存在的區(qū)域會被報告菌株感應，并在X-gal存在的情況下呈現藍色斑點。根據斑點的大小、位置、遷移率和顏色深淺可以定性AHLs的相對含量及其類別。

2 結果與分析

2.1 改良型TLC法顯色斑點質量評價

以5種AHL標準品(C6-，3-o-C8-，C9-，C11-和C14-AHL)為材料，于薄層板上點樣，對比傳統(tǒng)方法和改良方法的差異。從對比結果(如圖3)可以看出，方法優(yōu)化后的斑點強度明顯提高，斑點直徑濃縮了1.4～1.9倍，薄層板遷移速率Rf的線性程度提高了30.5%。

A：準備45 ℃的水域環(huán)境;B: 準備100 mL 半固體LB培養(yǎng)基和5 mL過夜培養(yǎng)的A136菌株;C: 點好樣的TLC板(20.0 cm×20.0 cm，流動相為甲醇∶水=6∶4);D: 插好叉條，制備半固體培養(yǎng)基膠片;E: 待培養(yǎng)基凝固后形成3～4 mm的薄片;F: 拆下插條;G：使用一張硬質塑料片貼于膠面，手托薄片將制膠板反扣，分離出完成的凝固培養(yǎng)基;H：將固體培養(yǎng)基薄片輕輕貼于TLC板上;I: 涂布X-gal

圖2改良型TLC檢測方法

Figure 2 The modified TLC method

A：傳統(tǒng)型顯色斑點，“1、2、3、4和5”為標準品(C6-，C9-，C11-和3-o-C8-，C14-AHL);B：改良型TLC法的顯色斑點，1′、2′、3′、4′和5′所檢測樣品與A圖對應。比較A、B 兩圖斑點直徑，B圖直徑比A圖縮小了1.4～1.9倍，灰度值提高；且線性遷移值Rf更好

圖3改良型TLC法顯色效果與傳統(tǒng)型方法的比較

Figure 3 Comparison of the results between the modified TLC method and the traditional method

2.2 傳統(tǒng)方法與改良方法的顯色效果

比較了3種碳鏈長度(C6-，C9-，C11-)的AHL標準品和5種碳鏈長度的混合物(C6-，3-O-C8-，C9-，C11-和C14-)在兩種方法下的顯色效果。由對比結果(如圖4)可知，單獨點樣時，改良型方法斑點擴散程度小，顯色更清晰(圖4-A)；混合樣品下，改良方法顯色分辨率更高，視覺反襯效果更明顯(圖4-B)。

2.3 以銅綠假單胞菌為例比較傳統(tǒng)型和改良型TLC方法的效果

將銅綠假單胞菌的發(fā)酵液進行抽提，獲得AHL粗提物，將改良型方法和傳統(tǒng)型方法進行了對比，結果顯示改良型方法顯色視覺更美觀，效果更清晰(圖5)。該結果表明改良型方法不僅僅適用于標準品，也適用于天然來源的AHL提取物。

A:單獨點樣下兩種方法的比較;B:混合點樣下兩種方法的比較。箭頭所示為不同C鏈長度的標準物

圖4兩種方法的顯色效果比較

Figure 4 Comparison of the difference of between using the two methods

左邊示傳統(tǒng)方法，右邊是改良型方法。數字1～4為PAO1潛在的AHL分泌物，包括C4和3-O-C12

圖5以PAO1抽提物為材料的兩種方法比較

Figure 5 Comparison of the effects with the two methods taken PAO1 extract as the material

2.4 X-gal的用量對比

選用根癌農桿菌A136作為報告菌株進行X-gal用量的對比實驗。傳統(tǒng)的方法是將X-gal添加到半固體培養(yǎng)基中，使用劑量為：在50 mL軟培養(yǎng)基中加入50 μL濃度為60 μg/μL的X-gal,按此劑量需要使用X-gal為3 mg(50 μL×60 μg/μL=3000 μg，即3 mg)。改良的方法是待培養(yǎng)基凝固后涂布，使用100 μL 濃度為20 μg/mL的X-gal，最終用量為2 mg。相比之下用量節(jié)省了三分之一，成本節(jié)省了33.3%(圖6)。

圖6 傳統(tǒng)方法和改良型方法在X-gal用量消耗和薄層板上的遷移效果的比較

3 討論

N-?；呓z氨酸內酯類(AHL)化合物是革蘭氏陰性菌中最重要的一類群體感應信號分子，調控多種生理基因的表達，參與菌群的多種生態(tài)功能?？焖佟⒑啽?、有效地檢測AHL信號分子成為深入研究和了解細菌通訊機制的重要手段[10]。一些新的檢測方法逐步開發(fā)，包括AI-1型和AI-2型[13-16]。目前利用報告菌株[如紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CVO26、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136]和TLC方法進行偶聯是檢測 AHL 的有效手段，這主要得益于該方法簡單、快捷和易得，不需要昂貴的設備[11]。然而傳統(tǒng)的TLC方法在檢測限和視覺分辨率上仍存在些許不足，未能充分發(fā)揮其作用，限制了檢測范圍的延生。前期的使用中也有作者指出分辨率有進一步提升的可能[12]。本實驗在前人研究的基礎上，改進了TLC方法的操作程序，通過設計制膠板將軟培養(yǎng)基的制作與顯色劑X-gal的涂布分成兩步進行，有效避免了瓊脂培養(yǎng)基在凝固的過程中對薄層板表面的浸潤，使得藍色斑點更為集中，減少了顯色區(qū)域的彌散和拖尾，視覺分辨率更高。以AHL標準品為材料，將傳統(tǒng)方法與改良方法進行Rf值和斑點形狀的比較，發(fā)現斑點直徑縮小了1.4～1.9倍，遷移率相關系數更接近于1。在實際的生物樣品中(銅綠假單胞菌AHL產物)，進一步驗證了改良法的敏感性和可行性，且證實該方法在檢測混合樣品中同樣具有適應性。此外，對X-gal的用量減少了33.3%，有效地節(jié)省了實驗成本。

本次優(yōu)化的步驟中，體現了以下幾點優(yōu)勢：首先，制膠板的設計保證了膠的質量，能輕松做到培養(yǎng)基無滲漏、無破損、無氣泡，而且厚度均一，膠面平整；其次，待培養(yǎng)基凝固后再進行鋪板，能有效減少凝固過程中水分在TLC薄層板上產生的張力，減少對待檢AHL信號的稀釋和擴散，保證局部的AHL物質維持原有濃度，致使顯色點不分散，檢測分辨率提高，視覺效果更好；最后，顯色劑X-gal沒有與待檢的AHL物質直接接觸，減少了假陽性結果的發(fā)生概率，使得檢測的效果更能保真。綜合來看，該方法在AHL標準品和銅綠假單胞菌PAO1抽提物中均得到了較好的驗證，證實改良型TLC方法除了適用于單一樣品，也適用于天然的混合物樣品，提升了檢測方法的有效性和普適性，具有廣闊的應用前景。