拮抗菌誘導(dǎo)番茄根系分泌物鑒定及作用研究

游 薇，戰(zhàn)鴻彬, 金朝霞

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，大連 116033)

土傳病害在我國農(nóng)業(yè)歷史上已經(jīng)存在上千年。我國專家也對其產(chǎn)生的機(jī)理展開了多方面的研究分析，并且取得了顯著的進(jìn)展。據(jù)大量研究結(jié)果表明：造成土傳病害的原因有很多，其中土壤微生物區(qū)系失衡是導(dǎo)致土傳病害高發(fā)的根本原因[1]。然而根系分泌物的微小變化就會導(dǎo)致土壤微生物區(qū)的嚴(yán)重變化。根系分泌物是作為植物和土壤微生物之間的重要媒介[2]。根系分泌物是植物根系分泌出來的低分子物質(zhì)的總稱，主要含有氨基酸、有機(jī)酸、糖類等物質(zhì)，對根際微生物的選擇性促進(jìn)起著重要作用[3]。還有一些植物分泌雜環(huán)化合物、酯類、烴類、醇醚類等物質(zhì)。

灰霉病是露地、保護(hù)地作物常見且比較難防治的一種真菌性病害，屬于低溫高濕型病害，病原菌生長溫度為20 ℃～30 ℃、濕度持續(xù)90%以上時為病害高發(fā)期?；颐共∮苫移咸焰呔秩舅拢瑢僬婢『?，花、果、葉、莖均可發(fā)病。在農(nóng)業(yè)上灰霉病傳染性極強(qiáng)，使產(chǎn)量大大減少。傳統(tǒng)防病方法主要為農(nóng)藥，而農(nóng)藥的大量使用對于人類而言利弊并存，為興利除弊，一些專家提出“生態(tài)農(nóng)業(yè)”，漸漸實現(xiàn)了少使用甚至不使用化學(xué)試劑。其中主要方法是根系分泌物對病害的影響，雖然也有一些關(guān)于植物土傳病害與根系分泌物關(guān)系方面的研究報道[4-6]，但微生物防治番茄灰霉病與根系分泌物的關(guān)系研究至今仍很少見。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 營養(yǎng)土由江蘇淮安蘇淮提供；蛭石由淮安淮農(nóng)科技科技開發(fā)有限公司提供。

1.1.2 供試作物 番茄為中蔬四號，由酒泉昌豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

1.1.3 病原菌 灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由大連工業(yè)大學(xué)實驗室提供。

1.1.4 拮抗菌 綠針假單胞桿菌(Pseudomonascholoeaphtis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)由大連工業(yè)大學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物生長培養(yǎng)條件

番茄種子在28 ℃無菌培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)48 h后，移至28 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至四葉期，移至高溫滅菌的土壤中，繼續(xù)培養(yǎng)一周時間，直至番茄植株高度在7 cm左右。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)處理方法

1)細(xì)菌培養(yǎng)。采用Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，將兩種拮抗菌在130 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 h左右，在OD600條件下測定菌體濃度為0.6左右。

2)誘導(dǎo)處理方法。量取發(fā)酵液40 mL置于離心管中，在10 000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，棄去上清液，將沉淀菌體溶于100 mL超純水中，搖晃均勻。采用灌根法，將處理好的綠針假單胞桿菌處理液和短小芽孢桿菌處理液沿番茄植株根部緩緩灌入綠針假單胞桿菌處理組和短小芽孢桿菌處理組的番茄植株根部土壤當(dāng)中，每個處理設(shè)置30個重復(fù)，共計180株。處理后的番茄植株繼續(xù)培養(yǎng)3周時間。

3)灰霉病孢子懸浮液的制備。將灰霉菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)10～14 d，在無菌條件下將培養(yǎng)基切下放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩10 h，4層紗布過濾，顯微鏡檢測調(diào)整孢子懸浮濃度為1×105cfu/mL。

1.2.3 體外拮抗菌對灰霉菌菌體生長的影響

將無菌水、綠針假單胞桿菌發(fā)酵液和短小芽孢桿菌發(fā)酵液分別均勻涂抹在3組PDA平板培養(yǎng)基表面上，再將灰霉菌接種到培養(yǎng)基正中心，封口膜封口，一組5個重復(fù)，共15組實驗平面皿，分別記作CK、PA和BP。在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 番茄植株病情指數(shù)測定

接種5 d后調(diào)查發(fā)病情況?；颐共“l(fā)病程度分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉面積5%以下；3級，病斑面積占葉面積5%～15%；5級，病斑面積占葉面積15%～25%；7級，病斑面積占葉面積25% ～50%；9級，病斑面積占葉面積50%以上。采用分級計數(shù)法計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)(%)=∑(各級病葉數(shù)×各級代表值)調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高一級代表值×100%。[7]

1.2.5 番茄植株葉片抗氧化酶活性測定

葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用NBT光氧化還原法，以抑制NBT光氧化還原50%的酶量為一個酶活性單位[8]；過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法,以每分鐘吸光度OD240減少0.01為一個酶活力單位；過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法,將每分鐘吸光度OD470增加1時為一個酶活力單位[9]。

1.2.6 根系分泌物收集方法

采用土培方法收集根系分泌物，因為此方法得到的根系分泌物可以相對真實地反映根系分泌物的實際情況[10]。實驗對照組分為兩組，分別為蒸餾水空白對照和單獨接種灰霉菌對照組；實驗處理組分為兩組，分別為綠針假單胞桿菌處理組和短小芽孢桿菌處理組。采用灌根法分別用綠針假單胞桿菌和短小芽孢桿菌對番茄幼苗進(jìn)行處理，每個處理設(shè)置30個重復(fù)，共計180株。

實驗組處理完成48 h后，將無菌水均勻地噴施到空白對照組植株的葉片、莖和根部,將灰霉菌的懸浮孢子液均勻地噴施到單獨接種灰霉菌對照組、綠針假單胞桿菌處理組和短小芽孢桿菌處理組植株的葉片、莖和根部，量取其植株高度并做好記錄。

等待48 h后將各組植株根部及根際土壤全部取出，用蒸餾水淋洗根際土壤，收集淋洗的蒸餾水150 mL,加入500 mL 75%甲醇在頻率為160 次/min，溫度 25 ℃條件下震蕩2 h,在 3500 r/min，25 ℃條件下離心20 min，得到上清液，棄掉沉淀。將上清液濃縮到大約100 mL。用濃硫酸將濃縮液pH值調(diào)至3.0，用30 mL乙酸乙酯萃取根系分泌物中酸性和中性組分，重復(fù)3次，得到水相1，乙酸乙酯相1。用NaOH將水相pH值調(diào)至10,用100 mL乙酸乙酯萃取根系分泌物中堿性組分，重復(fù)3次，得到水相2，乙酸乙酯相2，乙酸乙酯相2即為堿性組分。用 100 mL pH 10 的 8%NaOH萃取乙酸乙酯相1，重復(fù)3次，得到水相3，乙酸乙酯相3。用濃硫酸將水相3的pH值調(diào)至3.0，用100 mL乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，得到水相4，乙酸乙酯相4，乙酸乙酯相4即為酸性組分。將得到的酸性組分和堿性組分混合并濃縮至100 mL,用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.7 根系分泌物化學(xué)組分GC-MS分析

1)根系分泌物衍生化。取適量的根系分泌物濃縮液，繼續(xù)濃縮至干后，加入300 μL硅烷化試劑,即BSTFA∶吡啶=5∶1，封閉好放入70 ℃～80 ℃水浴2 h，拿出準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS分析。

2)GC-MS分析條件方法的建立。使用HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm膠片)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：柱溫50 ℃(2 min)，以6 ℃/min程序升溫至250 ℃(保持15 min)；載氣是氦氣，恒定流率為1 mL/min。

離子源電壓為70 eV，質(zhì)量范圍從30～600 m/z掃描，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度：200 ℃。四級桿溫度150 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.8 根系分泌物對灰霉菌菌體生長的影響

分別取各組根系分泌物濃縮液 200 μL 涂布在 PDA 平板培養(yǎng)基上，靜置 2 min，再將灰霉菌接種到培養(yǎng)皿正中央。每個處理5次重復(fù)。在28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中48 h。

1.2.9 采用Microsoft Excel 2003軟件處理原始數(shù)據(jù)和繪圖，采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及最小顯著差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外拮抗菌和番茄根系分泌物對灰霉菌菌體生長的影響

根據(jù)圖1所示，兩組拮抗菌(PA、BP)相對于空白對照(CK)組比較，對灰霉菌菌體直徑抑制作用比較明顯； CE與CK相比較，CE具有一定的抑制作用，但效果不明顯；將PE、BE與CK組相比較發(fā)現(xiàn)顯著性明顯，甚至比PA組和BP組的抑制效果更明顯。說明兩種拮抗菌不僅自身有抗灰霉病的功能，它們更能通過影響番茄根系分泌物來強(qiáng)化植物抗病性。

CK：蒸餾水；CE：蒸餾水處理番茄植株后提取的根系分泌物；PA：綠針假單胞桿菌；PE：綠針假單胞桿菌處理番茄植株后提取的根系分泌物；BP：短小芽孢桿菌；BE：短小芽孢桿菌處理番茄植株后提取的根系分泌物。*和**分別代表P<0.05和P<0.01；下同

圖1拮抗菌和番茄根系分泌物對灰霉菌菌體直徑的影響

Figure 1 Effects of antagonistic bacteria and tomato root exudates on the diameter ofBotrytiscinerea

2.2 不同處理對番茄植株生長高度以及病情指數(shù)的影響

2.2.1 不同處理對番茄植株生長高度的影響

由圖2可知：將兩種拮抗菌作用到患灰霉病的番茄植株上，經(jīng)過一段時間相同條件培養(yǎng)后，生長狀態(tài)有明顯差異，就植株高度來說，與空白對照組相比較，PA和BP處理組生長高度差差異較小，但單獨接種灰霉菌對照組植株生長高度差比空白對照組要小很多。說明綠針假單胞桿菌和短小芽孢桿菌作用到植物體上抗病很顯著。與此同時還能觀察到單獨接種灰霉菌對照組植株的葉片和莖部分出現(xiàn)明顯的病變情況，PA組和BP組病變情況不明顯。

BC:單獨接種灰霉菌的番茄植株；PA：綠針芽孢桿菌誘抗+灰霉菌處理的番茄植株；BP：短小芽孢桿菌誘抗+灰霉菌處理的番茄植株；CK：蒸餾水處理的植株。下同

圖2不同處理下植株生長高度差比較

Figure 2 Comparison of plant height difference under different treatments

2.2.2 不同處理對番茄植株病情指數(shù)的影響

由圖3可以看出：在植株葉片上可以明顯看出病變面積對比，PA實驗處理組平均病情指數(shù)在38.8%左右，BP實驗處理組的平均病情指數(shù)在48.1%左右，而單獨接種灰霉菌對照組的平均病情指數(shù)高達(dá)76.6%，PA實驗處理組和BP實驗處理組的病情指數(shù)明顯低于單獨接種灰霉菌對照組的病情指數(shù)。

圖3 對照組和處理組番茄植株灰霉病病情指數(shù)對比圖

2.3 不同處理對番茄植株葉片內(nèi)抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性測定(如圖4)結(jié)果顯示，在接種灰霉菌的情況下，兩組拮抗菌實驗組植株的抗氧化酶活性雖然比未接種灰霉菌的蒸餾水對照組植株的抗氧化酶活性略低，但始終比單獨接種灰霉菌的對照組植株的抗氧化酶活性要高很多，說明兩種拮抗菌對番茄植株的誘抗對植株抗氧化酶活性的保護(hù)作用雖然沒有達(dá)到使其完全不受灰霉菌影響，但已經(jīng)將影響程度降低了60%～90%。

圖4 不同處理對番茄植株葉片中SOD酶、CAT酶、POD酶活性影響

表1 根系分泌物GC-MS分析結(jié)果

CK：蒸餾水處理的植株的根系分泌物;BC:單獨接種灰霉菌的番茄植株的根系分泌物；PA：綠針芽孢桿菌誘抗+灰霉菌處理的番茄植株的根系分泌物；BP：短小芽孢桿菌誘抗+灰霉菌處理的番茄植株的根系分泌物

2.4 拮抗菌作用番茄植株中根系分泌物鑒定

由表1可以看出在實驗組和對照組的根系分泌物中均鑒別出酸類、胺類、酯類和醇類等成分；空白對照組(CK)檢測出酸類10種、酯類6種、胺類3種及醇類3種；單獨接種灰霉菌對照組(BC)檢測出酸類12種、酯類6種、胺類4種及醇類3種；實驗處理組(PA)檢測出酸類13種、酯類6種、胺類4種及醇類3種；實驗處理組(BP)檢測出酸類13種、酯類6種、胺類4種及醇類3種。實驗處理組的成分種類會比空白對照組復(fù)雜，并且其中幾種成分相對含量相比有所升高，如2-酮基-D-葡萄糖酸、2-羥基丙酸、蘋果酸、十八酸、亞油酸、十二酸、對苯二甲酸、正十六酸、鄰苯二甲酸二異辛酯等。據(jù)文獻(xiàn)報道，正十六酸可能調(diào)節(jié)植物溫度以便其適應(yīng)環(huán)境，提高生存能力[11]。2-羥基丙酸熱穩(wěn)定性好，可以抵抗外部環(huán)境的突然變化，對植物本身起到穩(wěn)定作用。蘋果酸可以促進(jìn)正常代謝分解，使生命體的新陳代謝加強(qiáng)，代謝掉體內(nèi)有毒有害物質(zhì)以保護(hù)自身系統(tǒng)的正常運作。

此實驗對比后的結(jié)果表明，綠針假單胞桿菌和短小芽孢桿菌不僅本身可以直接抑制灰霉菌菌體的生長，當(dāng)作用到番茄植物上同樣有抑制灰霉病發(fā)病的作用，并且可以通過參加植株自身代謝，以及保護(hù)植株本身抗氧化酶活性改變植物次生代謝產(chǎn)物的種類和含量來達(dá)到抗病的效果，有效減輕體內(nèi)氧化損傷。

3 討論

本實驗各組根系分泌物成分檢測統(tǒng)計結(jié)果中發(fā)現(xiàn)2-酮基-D-葡萄糖酸、2-羥基丙酸、蘋果酸、十八酸、亞油酸、十二酸、對苯二甲酸、十六酸甲酯和鄰苯二甲酸二異辛酯這幾類低分子物質(zhì)的含量在拮抗菌誘導(dǎo)植株中較高，而在灰霉菌對照組植株中含量較低，由此可以推出這些物質(zhì)可能是具有化感作用的組分，但究竟以哪些組分為主要的化感作用還需要進(jìn)一步的試驗確定。

根系分泌物種類受多種因素影響，比如收集方法、測定方法、作物種類等?；凶饔猛ǔＪ怯啥喾N化感物質(zhì)綜合作用所導(dǎo)致。本研究僅對拮抗菌作用后的番茄植株對灰霉病的抗病效果做一系列研究，對于低含量的物質(zhì)及根系分泌物中其他未檢測到的物質(zhì)也可能存在化感作用，而且這些物質(zhì)間的協(xié)同化感作用還有待進(jìn)一步實驗論證。