10種中藥材和大蒜提取液對菊果膠桿菌的抑菌效果

周 勇， 代小瑩， 劉 昔， 龔明福， 劉 忠， 曾建威

(1.樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000； 2.峨眉山生物多樣性保護與利用研究所，四川樂山 614000；3.眉山職業(yè)技術(shù)學院，四川眉山 620010； 4.四川省樂山市經(jīng)濟作物站，四川樂山 614000)

菊果膠桿菌(Pectobacteriumchrysanthemi)屬軟腐果膠桿菌屬(Pectobacterium)，是魔芋軟腐病主要致病菌之一[1]。與菊歐文氏菌(Dickeyadadantii)和菊歐文氏桿菌(Erwiniachrysanthemi)相比，菊果膠桿菌對魔芋軟腐病的致病性更強[2]。目前，魔芋軟腐病主要采用化學方法進行防治，鐘艷紅等研究了農(nóng)用殺菌劑對魔芋軟腐病的防治效果，發(fā)現(xiàn)用農(nóng)用鏈霉素、噻菌銅、葉枯唑、噻唑鋅等殺菌劑對種芋進行處理或在發(fā)病初期噴施對防治魔芋軟腐病有顯著效果，其中農(nóng)用鏈霉素防治法被普遍認為是魔芋軟腐病防治的主要方法[3-7]。生防菌對魔芋軟腐病致病菌也具有顯著的抑制作用，如枯草芽孢桿菌的30%硫酸銨鹽析蛋白對胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌具有較強的抗菌活性[8]；密旋鏈霉菌與肉質(zhì)鏈霉菌及其制劑對菊果膠桿菌、菊歐文氏菌和菊歐文氏桿菌具有明顯的抑菌效果，在混合接種情況下相對防效最高可達100%[9]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥材提取液對某些植物病害致病菌也具有抑菌作用，如烏梅-五倍子混合液對蝴蝶蘭軟腐病病原菌有顯著的抗菌作用[10]，白花蛇舌草、金錢草、丹參和甘草配伍對細菌和霉菌抑菌效果最好[11]，五倍子對芒果炭疽菌和蒂腐菌抑菌活性最高[12]，大蒜的乙酸乙酯提取物對番茄早疫菌具有較好的抑菌活性[13]，但未見利用中藥材對魔芋軟腐病致病菌進行抑菌研究的報道。本試驗選取10種具有抗菌殺毒作用的中藥材和大蒜，制備提取液對魔芋軟腐病主要致病菌菊果膠桿菌進行抑菌效果研究，旨在探討中藥材對魔芋軟腐病的抑菌效果及機制，探索魔芋軟腐病的生物防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為由樂山師范學院微生物研究室分離鑒定的魔芋軟腐病致病菌菊果膠桿菌(P.chrysanthemi)。

供試藥材為黃連、黃芩、烏梅、百部、五倍子等10種中藥材及大蒜(表1)。

表1 供試藥材特性與來源

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥材及大蒜提取液的制備

取經(jīng)粉碎的中藥材10 g，加80%乙醇50 mL，35 ℃、150 r/min 恒溫振蕩提取48 h后，室溫下 4 000 r/min 離心 6 min，提取母液，并編號，5 ℃暗處儲存?zhèn)溆?。鮮蒜在室溫粉碎后，放入28 ℃培養(yǎng)箱酶解30～60 min，然后加入乙酸乙酯在28 ℃、130 r/min 振蕩提取12 h，提取母液，標記后于5 ℃暗處儲存?zhèn)溆谩?/p>

提取效率(mL/g)=提取母液量/稱取中藥材的量。

1.2.2 病原菌菌懸液的制備 將活化的菊果膠桿菌斜面在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)18 h，用無菌水將菌苔洗下，稀釋為濃度107～108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3 提取液抑菌效果測驗

1.3.1 母液抑菌效果測定 吸取制備的0.1 mL菌懸液加入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板(直徑9 cm)中央，均勻涂布，室溫下干燥5 min，取直徑1 cm的無菌濾紙片，分別浸入6 mL藥液中40 min后，移入已涂布病菌的平板中，每個平板均勻放置4張濾紙片，30 ℃ 培養(yǎng)24 h，用直尺測定抑菌圈直徑(包含濾紙片直徑)，計算每個平板的抑菌圈平均直徑，以抑菌圈的大小表示抑菌能力的強弱，并用80%乙醇搖床24 h處理作為空白對照(CK)，每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同濃度提取液抑菌效果測定 選取“1.3.1”節(jié)中抑菌效果最好的3種提取液，按二倍稀釋法進行稀釋，稀釋成5個梯度，按“1.3.1”節(jié)的方法進行抑菌效果測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)資料整理在Excel 2010軟件中進行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在DPS 7.05統(tǒng)計分析軟件中進行，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法(SSR法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液抑菌效果

由表2、圖1可知，在供試的10種中藥材和大蒜提取液中，有6種中藥材對菊果膠桿菌具有明顯的抑菌作用，不同的中藥材提取液對菊果膠桿菌抑菌效果差異較大。其中黃連、大蒜提取液抑菌效果最好，平均抑菌圈直徑分別為2.27、2.19 cm，極顯著優(yōu)于其他藥材及對照；黃芩提取液抑菌效果次之，平均抑菌圈直徑為1.68 cm，顯著優(yōu)于百部、金銀花，極顯著優(yōu)于對照，烏梅、柴胡也極顯著優(yōu)于對照；白芷平均抑菌圈直徑與對照存在顯著差異，具有一定的抑菌效果；而百部、金銀花、板藍根、金櫻子、五倍子對菊果膠桿菌無明顯抑制作用。從提取效率看，抑菌效果較好的黃連、大蒜和黃岑具有較高的提取效率，1 g可以提取2.23～3.40 mL，經(jīng)濟性較好。

2.2 提取液稀釋后抑菌效果

選取對菊果膠桿菌抑菌效果較好的黃連、黃芩和大蒜提取液分別按二倍稀釋法稀釋成5個梯度濃度進行抑菌效果測定，結(jié)果(表3)表明，抑菌效果在不同稀釋倍數(shù)間、 不同藥材間差異均較大。稀釋后的提取液抑菌效果均顯著或極顯著下降，黃連和大蒜提取液稀釋后抑菌效果極顯著下降，黃芩在稀釋2～8倍時，抑菌效果顯著下降，稀釋16倍及以上時抑菌效果極顯著下降。

表2 10種中藥材和大蒜提取液對菊果膠桿菌的抑菌效果比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平差異顯著。下表同。

由表4可知，稀釋后黃連2倍稀釋液抑菌效果最好，極顯著優(yōu)于其他藥材稀釋液，其平均抑菌圈直徑為1.83 cm；黃芩2倍、4倍稀釋液和黃連4倍稀釋液仍然具有明顯的抑菌作用，抑菌效果顯著優(yōu)于對照；當黃連、黃芩稀釋倍數(shù)達到8倍及以上時，抑菌效果與對照無顯著差異。抑菌效果由大到小依次為黃連2倍稀釋液>黃芩2倍稀釋液>黃芩4倍稀釋液>黃連4倍稀釋液。大蒜提取液母液抑菌效果較好，且優(yōu)于除黃連母液外的其他中藥材，但是一旦稀釋后使用，基本喪失對菊果膠桿菌的抑菌作用。

表3 不同稀釋倍數(shù)對3種中藥材提取液抑菌效果的影響

3 討論與結(jié)論

細菌性病害是植物病害中較為頑固的一類病害，其防治一直是生產(chǎn)上的難點，尋找有效防治藥物是細菌性病害防治的關(guān)鍵措施[14]。魔芋軟腐病是由菊果膠桿菌、菊歐文氏菌、菊歐文氏桿菌等感染的一類細菌性病害，對魔芋生產(chǎn)構(gòu)成了極大威脅[2]。目前，生產(chǎn)上對魔芋軟腐病的防治常采用鏈霉素等抗生素和噻菌銅等化學農(nóng)藥，抗生素的長期使用必然會造成細菌耐藥性的產(chǎn)生，化學農(nóng)藥的大量使用不僅使病菌逐漸產(chǎn)生抗藥性，還會增加環(huán)境中的農(nóng)藥殘留[15]。因此，開發(fā)環(huán)境友好、防效顯著的防治藥物是目前魔芋軟腐病防治的研究熱點。中藥材作為天然的抑菌藥物，其抗菌、低毒、無副作用、不會產(chǎn)生殘留等特點和優(yōu)勢，在現(xiàn)代預(yù)防和控制細菌感染方面發(fā)揮了積極作用。由于中藥的特殊性，細菌較少對中藥產(chǎn)生耐藥性[11]?，F(xiàn)有研究表明，中藥材對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌、蝴蝶蘭軟腐病病原菌具有較好的抑菌作用[10-12，16]。黃連小檗堿、黃連堿及藥根堿已被證實對白色念珠菌[17]、放線菌門和厚壁菌門細菌[18]、大腸桿菌[19]具有較強的抑菌作用；黃芩有效成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等均有抑菌活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥材黃連、黃芩的醇提取液對菊果膠桿菌具有極顯著的抑菌作用，且具有較高的提取效率(2.23～2.87 mL/g)，可作為制備防治魔芋軟腐病的生物農(nóng)藥的材料，為魔芋軟腐病防治提供一條新的途徑，為中藥材的進一步開發(fā)利用提供參考。

表4 3種中藥材提取液在不同的稀釋倍數(shù)下抑菌效果比較