低氧激活HIF-1α對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

龐靜雯 吳亞霖 徐 婷 莊秀妹

低氧激活HIF-1α對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

龐靜雯 吳亞霖 徐 婷 莊秀妹

目的：初步探討低氧環(huán)境對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)增殖與凋亡的影響，以及低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,H IF-1α)在該過程中的作用。方法：體外常氧條件和低氧(1%O2)條件下培養(yǎng)PDLCs，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)前后PDLCs生長速度的差異；流式細(xì)胞術(shù)比較PDLCs凋亡水平的變化。W estern免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)H IF-1α的表達(dá)水平。通過小干擾RNA(H IF1α-Si)轉(zhuǎn)染PDLCs，檢測(cè)低氧誘導(dǎo)下H IF-1α水平、細(xì)胞活性以及細(xì)胞凋亡水平的變化。結(jié)果：人PDLCs在低氧環(huán)境中培養(yǎng)48h后細(xì)胞活性顯著抑制，凋亡水平增高，H IF-1α在蛋白和mRNA水平均顯著升高。小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染PDLCs并于低氧下培養(yǎng)后HIF-1α表達(dá)明顯降低，同時(shí)細(xì)胞活性增加、細(xì)胞凋亡顯著下降。結(jié)論：低氧能通過上調(diào)H IF-1α表達(dá)抑制PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡。

人牙周膜成纖維細(xì)胞；低氧；增殖與凋亡；低氧誘導(dǎo)因子-1α

慢性牙周炎是人類常見的口腔疾病，可造成牙松動(dòng)、移位，最終導(dǎo)致牙喪失。牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周韌帶中的主要功能細(xì)胞，參與合成基質(zhì)、膠原、彈力纖維和糖蛋白，并通過吸收膠原吞噬異物控制牙周膜的體內(nèi)平衡及完整結(jié)構(gòu)，使牙周膜功能狀態(tài)良好[1]。PDLCs數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)破壞均可導(dǎo)致牙周支持組織損傷，誘導(dǎo)或加重牙周組織疾病[2]。

近年來許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，厭氧菌、咬合創(chuàng)傷、吸煙以及炎癥本身均能造成牙周微環(huán)境的局部缺血與低氧狀態(tài)[3]。氯化鈷化學(xué)模擬的低氧可抑制人PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡[2]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypox ia inducible factor-1α，H IF-1α)作為最主要的低氧應(yīng)答調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中具有關(guān)鍵作用[4]。牙周炎患者的牙周組織中H IF-1α表達(dá)水平相較于正常人顯著升高[5]。目前，低氧是否通過H IF-1α調(diào)控PDLCs的增殖與凋亡尚不明確。因此，本研究利用低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)的方法比較常氧環(huán)境和低氧(1%O2)環(huán)境對(duì)PDLCs細(xì)胞增殖及凋亡的影響，通過小干擾RNA敲低技術(shù)探討H IF-1α在該過程中的作用。

1.材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胰酶、FBS、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)。小鼠抗人H IF-1α、GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(Proteintech公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，日本)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma-A ldrich公司，美國)；細(xì)胞凋亡試劑盒(聯(lián)科生物，中國)；其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。常氧組CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2) (Thermo，美國)，低氧組CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、1%O2)為英國New Brunsw ick生產(chǎn)的GALAXY 48R型號(hào)CO2培養(yǎng)箱。

1.2 PDLCs的原代培養(yǎng) 選擇15-22歲患者因正畸需要拔出的前磨牙，拔出時(shí)牙根完整，且無牙周、牙體、牙髓、根尖病變，取得患者知情同意。具體方法如下[6,7]：去除根端血跡，刮取根中1/3牙周膜組織，采用組織塊法以含20%胎牛血清(FBS)、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基原代培養(yǎng)PDLCs。約第6天細(xì)胞生長達(dá)80%，胰酶消化傳代，后繼續(xù)于含10%FBS、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取前5代PDLCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)細(xì)胞活性檢測(cè) 將PDLCs以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組及時(shí)間梯度分別置于常氧或低氧(1%O2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)每孔加入20μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h,去除培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO后置于搖床上低速振蕩10 m in，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)低氧及siRNA處理后PDLCs上清液及細(xì)胞，PBS洗2次，用1× binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106-7個(gè)/m L，取200μL細(xì)胞懸液，加入5μL Annexin V-APC后避光孵育15m in，再加入10μL PI，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 W estern免疫印跡 分別按分組收集經(jīng)低氧及siRNA處理后PDLCs的裂解蛋白進(jìn)行抽提并定量。取等量總蛋白于沸水中煮7 m in，以8% SDS-PAGE電泳分離后，將凝膠上的蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉2h，分別加入一抗4℃孵育過夜，之后轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影掃描。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR 收集的細(xì)胞用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA含量。取1μg RNA合成cDNA，按Takara公司Quant SYBR Green PCR kit試劑操作說明進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用Primer Prem ier 5.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，H IF-1α引物序列為：Forw ard 5’-GTGCCACATCATCACCATA-3’，Reverse 5’-CAAAGCGACAGATAACACG-3’。內(nèi)參GAPDH序列為:Forw ard 5’-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG-3’，Reverse 5’-CTGGACTGGACGGCAGA TCT-3’。按公式計(jì)算求得各樣品基因相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組基因相對(duì)表達(dá)量為1。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 H IF1α-siRNA、NC-siRNA均購自上海吉瑪生物科技公司，H IF1α-Si1靶序列為5’-CTGATGACCAGCAACTTGA-3’，H IF1α-Si2靶序列為：5’-GGAAATGAGAGAAATGCT TAC-3’,NC-siRNA靶序列為：5’-AATTCTC CGAACGTGTCACGT-3’。

根據(jù)說明在六孔板中使用 Lipofectam ine RNA iMAX Transfection Reagent轉(zhuǎn)染PDLCs，并設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA為NC-Si組，終濃度為50nM，培養(yǎng)48h，提取蛋白、RNA并進(jìn)行后續(xù)研究。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以表示。各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS13.0軟件包分析結(jié)果。對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正t檢驗(yàn)，若P<0.05則差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 低氧抑制PDLCs增殖 分別比較常氧和低氧(1%O2)狀態(tài)下PDLCs培養(yǎng)12h、24h、48h和72h后增殖情況，MTT結(jié)果顯示和常氧組相比，PDLCs低氧培養(yǎng)12h與24h后光密度值略有升高，說明短時(shí)間內(nèi)低氧刺激可能促進(jìn)PDLCs增殖，然而結(jié)果不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(12 h組：t＝0.574，P= 0.597；2 4h組：t＝0.479，P=0.657)。于低氧繼續(xù)培養(yǎng)至48h和72h，低氧組PDLCs光密度值較常氧組顯著下降，結(jié)果具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(48h組：t＝2.900，P=0.044；72h組：t＝6.187，P=0.004)，說明較長時(shí)間后低氧抑制PDLCs增殖(圖1)。

圖1 MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)低氧對(duì)人PDLCs細(xì)胞活性的影響(*：P<0.05，與同一時(shí)間點(diǎn)低氧組與常氧組比較)

2.2 低氧促進(jìn)PDLCs凋亡 分別收集常氧和低氧狀態(tài)下培養(yǎng)48 h后PDLCs進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示：相比常氧組，PDLCs經(jīng)低氧培養(yǎng)48h后凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝9.219，P=0.001)，說明低氧促進(jìn)PDLCs凋亡(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)低氧對(duì)人PDLCs細(xì)胞凋亡的影響(*：P<0.05)

2.3 低氧促進(jìn)PDLCs中H IF-1α表達(dá) 進(jìn)一步探討低氧抑制PDLCs增殖及促進(jìn)其凋亡的可能機(jī)制，Western免疫印跡證實(shí)PDLCs在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)48h后較常氧組中H IF-1α表達(dá)顯著上調(diào)(灰度值：常氧組(84.53±8.58)；低氧組(178.33± 10.03)；t＝9.683，P＜0.001)；同時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR也在mRNA水平進(jìn)一步證實(shí)低氧狀態(tài)下PDLCs中H IF-1α表達(dá)上升3.84倍(t=8.488，P＜0.001)，提示H IF-1α可能與低氧抑制PDLCs增殖及促進(jìn)其凋亡相關(guān)(圖3)。

圖3 低氧培養(yǎng)48 h后PDLCs中H IF-1α蛋白和mRNA水平變化(*：P<0.05)

2.4 敲低H IF-1α后可逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)PDLCs增殖的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用 為了進(jìn)一步證實(shí)H IF-1α在低氧抑制PDLCs增殖及促進(jìn)其凋亡中的重要作用，通過小干擾 RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染H IF1α-siRNA到PDLCs中敲低H IF-1α表達(dá)。W estern免疫印跡證實(shí)PDLCs中H IF1α-Si轉(zhuǎn)染組相比于陰性對(duì)照NC-Si組H IF-1α表達(dá)顯著下降；實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步也在mRNA水平證實(shí)H IF1α-Si1、Si2組較NC-Si組H IF-1α表達(dá)分別下降 65.67%(t=8.662，P=0.002)與 66.67%(t= 7.357，P=0.002)(圖4)。

圖4 敲低H IF1α后低氧下PDLCs中H IF-1α蛋白和m RNA水平變化(*：P<0.05，與NC-Si組比較)

將各組細(xì)胞繼續(xù)在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H IF1α-Si1、Si2組中PDLCs光密度值較NC-Si組分別升高2.52倍(t=8.757，P= 0.001)與2.49倍(t=8.228，P＜0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明敲低H IF-1α后可逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)PDLCs增殖的抑制作用(圖5)。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，相比NC-Si組，H IF1α-Si1、Si2組中PDLCs經(jīng)低氧培養(yǎng)48 h后凋亡細(xì)胞數(shù)目分別減少46.43%(t=5.224，P=0.006)與 41.53%(t=5.434，P=0.006)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明敲低H IF-1α后可逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)PDLCs凋亡的促進(jìn)作用(圖6)。

圖5 敲低H IF1α后低氧對(duì)PDLCs細(xì)胞活性的影響(*：P<0.05，與NC-Si組比較)

圖6 敲低H IF1α后低氧對(duì)PDLCs細(xì)胞凋亡的影響(*：P<0.05，與NC-Si組比較)

3.討論

PDLCs是牙周結(jié)締組織的主要間質(zhì)細(xì)胞，在牙周組織的形成、再生以及維持牙周膜組織的完整中起著關(guān)鍵作用。PDLCs增殖、凋亡和分裂是牙周組織破壞和重建的重要病理生理過程[8]。牙周疾病治療的理想目標(biāo)是牙周組織再生，組織再生的基礎(chǔ)包括牙周膜細(xì)胞數(shù)量的增加和活力、分化能力的增強(qiáng)[9]。因此，探討影響PDLCs增殖與凋亡的因素以及有效的干預(yù)方法對(duì)于慢性牙周炎的防治具有重要意義。

慢性牙周炎患者的牙周組織毒物質(zhì)堆積、毛細(xì)血管供血不足等因素易造成牙周微環(huán)境的局部低氧[10]。低氧及炎癥可誘導(dǎo)局部細(xì)胞和組織通過血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增高、無氧代謝等途徑增加局部氧供給和減少氧消耗，使之產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)[10,11]。然而，慢性牙周炎患者長時(shí)間的低氧牙周微環(huán)境導(dǎo)致PDLCs數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)破壞，引起牙周支持組織損傷，誘導(dǎo)或加重牙周組織疾病[12]。本研究中PDLCs在低氧(1%O2)條件下培養(yǎng)12h、24h后較常氧組并未減少，甚至稍有增加；然而繼續(xù)培養(yǎng)至48h、72h時(shí)發(fā)現(xiàn)顯著抑制了細(xì)胞增殖，活力下降、凋亡增加。說明低氧時(shí)間越長導(dǎo)致細(xì)胞存活率逐漸降低，據(jù)此我們推測(cè)長時(shí)間低氧環(huán)境是導(dǎo)致慢性牙周炎進(jìn)展的重要原因。

目前實(shí)驗(yàn)性低氧方法主要包括低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞、加入鐵螯合劑的化學(xué)方法兩種[13]。Song等[2]通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入鐵的螯合劑氯化鈷阻斷氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，模擬低氧信號(hào)傳給細(xì)胞，并證實(shí)氯化鈷化學(xué)模擬的低氧可抑制人PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究利用低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)PDLCs，低氧培養(yǎng)箱相對(duì)于普通培養(yǎng)箱單一的CO2注入通道多了一個(gè)外接空氣通道，通過軟件程序設(shè)定所需O2濃度，結(jié)合這一個(gè)外接通道持續(xù)注入N2以排除多余O2，培養(yǎng)箱內(nèi)O2濃度可達(dá)到精度±0.1%。因此，該實(shí)驗(yàn)因素更單一、更可控，同樣證實(shí)了低氧對(duì)人PDLCs增殖的抑制作用與凋亡的促進(jìn)作用，同時(shí)低氧促進(jìn)H IF-1α高表達(dá)。此外，該方法更有利于小干擾RNA(H IF1α-Si)轉(zhuǎn)染后對(duì)PDLCs細(xì)胞活性及凋亡水平變化的檢測(cè)。

H IF-1α是一個(gè)廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的低氧應(yīng)答調(diào)控因子，可通過調(diào)節(jié)氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)維持低氧下細(xì)胞存活和組織中的氧穩(wěn)態(tài)[14]。除了保護(hù)性反應(yīng)，H IF-1α在不同細(xì)胞與不同實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出抗凋亡或凋亡作用，特別在嚴(yán)重或長時(shí)間低氧時(shí)，H IF-1α可誘導(dǎo)促凋亡基因的表達(dá)[3,15]。本研究中低氧抑制PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡時(shí)伴隨H IF-1α表達(dá)上升，小干擾RNA(H IF1α-Si)敲低H IF-1α表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)PDLCs增殖的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用，從正反兩個(gè)方面說明了低氧狀態(tài)下H IF-1α對(duì)PDLCs的促凋亡作用。有研究發(fā)現(xiàn)H IF-1α和Caspase3表達(dá)之間存在相關(guān)性，牙周炎的組織破壞以Caspases介導(dǎo)的凋亡為特征[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)低氧可以通過H IF-1α介導(dǎo)的BNIP蛋白和m TOR促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自吞噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。因此，H IF-1α介導(dǎo)低氧促PDLCs凋亡與牙周炎進(jìn)展的具體信號(hào)通路及機(jī)制需進(jìn)一步探討。

綜上，本研究在PDLCs中證實(shí)低氧能抑制PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡，敲低H IF-1α表達(dá)是逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)PDLCs增殖抑制及凋亡促進(jìn)的關(guān)鍵。牙周低氧微環(huán)境促進(jìn)牙周炎進(jìn)展，H IF-1α是低氧影響牙周組織的重要調(diào)控因子，如何克服牙周局部低氧環(huán)境以及靶向降低細(xì)胞H IF-1α表達(dá)藥物的研制應(yīng)用將是今后研究的重點(diǎn)。

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Effect of hypoxic condition on proliferation and apoptosis of human periodontal ligament cells via hypoxia inducible factor-1α

PANG Jing-wen,WUYa-lin,XU Ting,ZHUANGXiu-mei
(Guangzhou Haizhu DistrictHospitalofStomatology,Guangzhou 510220,China)

Objective:To investigate the effect of hypoxia on proliferation and apoptosis in human periodontal ligament cells(PDLCs),and the role of HIF-1α in this process.M ethods:PDLCs were cultured under hypoxia(1%O2)or normoxia. MTT was used to detect cell viability of PDLCs treat w ith or w ithout hypoxia.Effect of hypoxia on apoptosis of PDLCs was detected by Annexin V-APC on a flow cytometer.Western blot and qRT-PCR were used to detect expression of HIF-1α at protein and mRNA level respectively.HIF-1(HIF1)was transfected into PDLCs by small interfering RNA.HIF-1α,cell viability,as well as apoptosis,were furthered detected in PDLCs.Results:In the hypoxic environment,the activity of PDLCs was significantly inhibited after 48 h of culture.The level of apoptosis was increased,and the levels of HIF-1 protein and mRNA were significantly increased A fter knocking down of HIF-1α w ith siRNA,HIF-1α was significantly downregulated in PDLCs under hypoxia,as well as increased cell viability but decreased apoptosis.Conclusion:Hypoxia inhibits proliferation and promotes apoptosis of PDLCs via upregulated HIF-1α.

Periodontal ligament cells;Hypoxia;Proliferation and apoptosis;Hypoxia inducible factor-1α

R781.4

A

1672-2973(2017)03-0170-05

2016-12-21)

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：81600899)

龐靜雯 廣州市海珠區(qū)口腔醫(yī)院 碩士生 主治醫(yī)師廣東 510220

吳亞霖 廣州市海珠區(qū)口腔醫(yī)院 碩士生 醫(yī)師 廣東510220

徐 婷 廣州市海珠區(qū)口腔醫(yī)院 碩士生 主治醫(yī)師廣東 510220

莊秀妹 通訊作者 中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔科碩士生 主治醫(yī)師 廣東 510220