金花茶對低溫脅迫的生理響應及耐寒性分析

張武君 劉保財 趙云青 黃穎楨 陳菁瑛

(福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所/福建省農業(yè)科學院藥用植物研究中心,福建 福州 350003)

金花茶(Camellia nitidissimaChi)為山茶科山茶屬金花茶組灌木或小喬木[1],花色金黃,形美香雅,被譽為“植物界的大熊貓”、“茶族皇后”等,是世界珍稀瀕危植物,屬國家一級保護植物,不僅具有極高的觀賞價值,同時也是廣西壯族自治區(qū)的傳統(tǒng)藥用植物,具有清熱解毒、利尿消腫的作用[2]。2010 年,金花茶被國家衛(wèi)生部列入新資源食品,2015 年被國家林業(yè)局列入林藥植物進行重點發(fā)展。金花茶主要分布于廣西西南部北回歸線以南的北熱帶雨林,廣西的防城、南寧、隆安、扶綏等縣(市)以及越南北部。金花茶喜暖畏寒,屬熱帶性樹種[3],其耐寒性不及茶梅、華東山茶[4],在原產地可忍耐-3℃的短暫低溫[5],最低溫為-4℃時未加任何措施雖未被凍死,但生長發(fā)育受限制[6]。金花茶各生育期對溫度要求不同,植株萌動要求溫度在10℃以上,營養(yǎng)生長期適宜溫度18 ～23℃,開花期適宜溫度13～24℃[5]。目前,關于金花茶的研究主要集中在種苗繁育、栽培管理、化學成分、藥理作用等方面[7-8],而其耐寒性及生理特性的研究鮮見報道。李吉濤等[9-10]比較了8 種金花茶的耐寒性及部分生理指標,發(fā)現(xiàn)其耐寒性依次為金花茶＞龍州金花茶＞毛籽金花茶＞檸檬黃金花茶＞凹脈金花茶＞直脈金花茶＞東興金花茶＞平果金花茶。為進一步了解金花茶的耐寒性及其在不同低溫脅迫的生理變化情況,本研究利用人工氣候箱模擬不同溫度低溫脅迫環(huán)境,探討金花茶幼苗響應低溫脅迫的生理特性,以期為金花茶的引種栽培、抗寒育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

供試材料:防城普通種金花茶(經黃連冬高級工程師鑒定)2 a 生營養(yǎng)袋苗,長勢基本一致,由福建世紀金花科技有限公司提供。試驗前置于室外樹陰下按常規(guī)管理,低溫脅迫處理于2018 年1 月在福建省農業(yè)科學院果樹所進行。

GXZ-0288 光照培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;UV-1780 紫外-可見分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司;BS 110S 萬分之一天平,德國賽多利斯公司;2W 阿貝折射儀,上海光學儀器五廠;FE30 電導率儀,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗設計

將營養(yǎng)袋苗移入光照培養(yǎng)箱內進行低溫暗培養(yǎng)處理,設置6、3、0、-3、-6、-9℃6 個溫度梯度,每個溫度持續(xù)時間以每延長3 h 為一個梯度,即設置3、6、9、12 h 4 個時間梯度,共計24 個處理,每個處理4 株植株,共計96 株金花茶苗。待培養(yǎng)箱達到設定溫度后,將金花茶苗放入培養(yǎng)箱中,到設定時間后取出,剪取當年生秋梢上的成熟葉進行相關指標的測定。將葉片洗凈、擦干,除去主脈和葉緣后分為兩部份,一部份立即用于細胞傷害率(cell injury rate,CIR)和束縛水(bound water,BW)與自由水(free water,FW)含量的測定,其中CIR 測定樣品均勻剪成0.50 cm2,BW、FW 測定樣品均勻剪成0.20 cm2;另一部分剪成0.50 cm2后按每包0.50 g 用硫酸紙包好,液氮凍存后置于-80℃保存,用于丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等指標的測定。

1.3 試驗項目與方法

CIR 測定參考陳愛葵等[11]、王學奎[12]的方法,并略做改進。準確稱取待測葉片0.50 g 于試管中,加入20 mL 去離子水,靜置21 h 后測定浸提液電導率(R,μs·cm-1),然后于沸水浴加熱30 min,冷卻至室溫后搖勻,再次測定浸提液電導率(R0,μs·cm-1),以未脅迫處理的金花茶葉片的電導率為對照(control,CK)。按照公式計算CIR:

每個溫度的處理均設置4 個重復。參照蓋鈞鎰[13]的方法計算半致死溫度(semi-cethal temperature,LT50),對同一脅迫持續(xù)時間下的不同處理溫度及對應的平均CIR 進行Logistic 回歸方程擬合。Logistic 方程為:

式中,y:CIR(%);x:處理溫度(℃);K:CIR 的最大飽和容量;a、b:方程的參數(shù)。因CIR 計算中扣除了本底值,故K 值取100。按照公式計算金花茶葉片的低溫LT50:

參照許允文[14]的方法測定BW/FW;參照王學奎[12]的方法測定MDA、Pro 和SS 含量;參照張志良[15]的方法測定POD 活性;采用試劑盒(南京建成生物研究所)測定SOD、CAT 活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010 進行整理數(shù)據(jù)和作圖;SPSS 19.0 軟件進行多重比較和雙變量相關性分析,采用Duncan’s 法進行差異顯著性檢驗,采用Person’s 相關系數(shù)表示相關性。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對細胞傷害率和半致死溫度的影響

由圖1 可知,隨著脅迫時間的延長,各溫度下的CIR 呈上升趨勢。隨著處理溫度的降低,金花茶葉片CIR 呈慢-快-慢的增長趨勢,與處理溫度間呈“S”型曲線,表現(xiàn)為6～0℃時,CIR 緩慢上升,0 ～-6℃時,CIR急劇上升,-6～-9℃時,CIR 上升減緩。處理溫度為3～-9℃時CIR 均呈上升趨勢,利用Logistic 回歸方程對不同脅迫時間下處理溫度與金花茶葉片CIR 進行擬合,得到低溫LT50為-6.62～-3.94℃(表1),低溫脅迫時間越長,LT50越高,表明細胞傷害程度受處理溫度和脅迫持續(xù)時間的共同影響。

圖1 低溫脅迫對金花茶葉細胞傷害率的影響Fig.1 Effect of low temperature stress on CIR of C.nitidissima leaives

表1 不同脅迫時間下處理溫度與細胞傷害率的Logistic 方程擬合Table 1 Logistic equation fitting of treatment temperatures and CIR under different stress time

2.2 低溫脅迫對金花茶葉片MDA 含量的影響

由圖2 可知,隨著脅迫時間的延長,0℃下金花茶葉片MDA 含量明顯上升;-3℃下MDA 含量呈先上升后下降的趨勢;-6℃下MDA 含量呈下降趨勢;6℃、3℃、-9℃下MDA 含量變化不顯著。隨著處理溫度的降低,MDA 含量總體呈先上升后下降的趨勢,變化較為平緩,表明低溫脅迫下,MDA 含量不能較好地反應金花茶葉片細胞的傷害程度。

圖2 低溫脅迫對金花茶葉片MDA 含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on MDA content of C.nitidissima leaives

2.3 低溫脅迫對金花茶葉片保護酶活性的影響

由圖3-A 可知,隨著脅迫時間的延長,6℃下SOD活性呈先上升后下降的趨勢,其他5 個溫度下SOD 活性均呈不斷下降趨勢。3℃處理3 h 時SOD 活性最高,為27.80 U·g-1;-9℃處理12 h 時SOD 活性最低,為7.91 U·g-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時間為3 h時,SOD 活性呈先上升后下降的趨勢;脅迫時間為6、9、12 h 時,SOD 活性呈下降趨勢。0℃為SOD 活性變化的轉折點,0℃及以下低溫處理的SOD 活性均維持在較低水平。表明金花茶SOD 活性總體隨處理溫度的降低及脅迫時間的延長呈下降趨勢。

由圖3-B 可知,隨著脅迫時間的延長,6℃下POD活性小幅波動,3℃下先下降后上升,其余4 個溫度下POD 活性均呈下降趨勢。-9℃處理3 h 的POD 活性最高,為930.00 U·g-1·min-1,0℃處理12 h 的POD 活性最低,為272.34 U·g-1·min-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時間為3、6 h 時,POD 活性均呈上升趨勢;脅迫時間為9 h 時,POD 活性先降低后升高;脅迫時間為12 h 時,POD 活性呈先上升后下降再上升的趨勢。表明金花茶POD 活性總體隨處理溫度的降低呈上升趨勢,隨脅迫時間延長呈下降趨勢。

由圖3-C 可知,金花茶葉片CAT 活性較低,重復間誤差相對較大。隨著脅迫時間的延長,各處理溫度下CAT 活性僅小幅波動。-9℃處理3 h 時CAT 活性最高,為0.69 U·g-1;6℃處理6 h 時CAT 活性最低,為0.37 U·g-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時間為3、12 h 時,CAT 活性呈上升趨勢;脅迫時間為6 h,CAT 活性呈先上升后下降再上升的趨勢;脅迫時間為9 h,CAT活性變化不顯著。表明金花茶CAT 活性總體隨處理溫度的降低呈上升趨勢,但隨脅迫時間的延長變化不明顯。

2.4 低溫脅迫對金花茶葉片束縛水與自由水比值的影響

由圖4 可知,隨著脅迫時間的延長,處理溫度為6、3、0℃時,BW/FW 呈小幅上升趨勢;處理溫度為-3℃時,BW/FW 呈先升后降趨勢;處理溫度為-6、-9℃呈下降趨勢。-6℃處理3 h 時BW/FW 最高,為0.42,-9℃處理9 h 時BW/FW 最低,為0.25。隨著處理溫度的降低,BW/FW 在脅迫3、6、12 h 時均呈先上升后下降的趨勢;在脅迫9 h 時呈先維持再下降的趨勢。表明金花茶BW/FW 隨著處理溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢,不同溫度下隨脅迫時間的延長變化不同。

2.5 低溫脅迫對金花茶葉片細胞滲透調節(jié)物質含量的影響

由圖5-A 可知,隨著脅迫時間的延長,處理溫度為6℃和3℃時,Pro 含量呈上升趨勢;處理溫度為0℃和-6℃時無顯著差異;處理溫度為-3℃和-9℃時,Pro含量呈先升高后降低趨勢。0℃處理12 h 時Pro 含量最高,為13.74 μg·g-1,-9℃處理12 h 時Pro 含量最低,為3.13 μg·g-1。隨著脅迫時間的延長,處理溫度為6～0℃時Pro 含量呈上升趨勢,處理溫度為0℃和-3℃時Pro 含量較高,之后維持在較低水平。表明金花茶Pro 含量隨著處理溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢,不同溫度下隨脅迫時間的延長變化不同。

圖3 低溫脅迫對金花茶葉片SOD、CAT、POD 活性的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on SOD,POD,CAT activities of C.nitidissima leaives

圖4 低溫脅迫對金花茶葉片束縛水與自由水比值的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on ratio of bound water to free water(BW/FW)of C.nitidissima leaives

由圖5-B 可知,隨著脅迫時間的延長,處理溫度為6、0、-6℃時,SS 含量無顯著變化;處理溫度為3、-3℃時,SS 含量呈先上升后下降的趨勢;處理溫度為-9℃時SS 含量呈下降趨勢。-9℃處理3 h 時SS 含量最高,為6.40%;6℃處理9 h 時SS 含量最低,為3.87%。隨著處理溫度的降低,SS 在6 ～-6℃不斷上升,-6 ～-9℃保持穩(wěn)定。表明金花茶SS 含量隨著處理溫度的降低總體呈先上升再穩(wěn)定的趨勢,不同溫度下隨脅迫時間的延長變化不顯著或最終下降。

2.6 低溫脅迫中金花茶葉片各項抗寒生理指標的相關性分析

由表2 可知,處理溫度與CIR 始終呈極顯著負相關,表現(xiàn)為隨著處理溫度降低,CIR 顯著上升。CIR 與BW/FW 在低溫脅迫9、12 h 時分別呈極顯著和顯著負相關;與SS 含量在脅迫3、9、12 h 呈顯著正相關;與SOD 活性在脅迫9 h 呈顯著負相關;與POD 活性在脅迫3、6 h 呈極顯著正相關;與CAT 活性在脅迫3 h 和脅迫9 h 分別呈極顯著和顯著正相關;與MDA 和Pro 含量無顯著相關性。表明BW、SS 含量,SOD、POD、CAT 活性在脅迫的不同階段對細胞的損傷進行響應,而MDA含量與Pro 含量對低溫脅迫的響應無明顯規(guī)律。

圖5 低溫脅迫對金花茶葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.5 Effect of low temperature stress on proline and soluble sugar content of C.nitidissima leaives

3 討論

LT50是判斷植物抗寒能力的重要生理指標之一,以LT50確定生態(tài)分布的最低溫度,能快速鑒定植物的抗寒能力[16],可避免引種和推廣工作中的盲目性。目前,該方法已被用于廣西油茶[17]、香花油茶[18]、滇山茶[19]等山茶科植物抗寒能力的鑒定。本研究中,金花茶幼苗葉片在低溫脅迫3 h 的LT50為-6.62℃。這與郭亞男等[20]測得的-6.16℃ 相近,但高于李吉濤等[10]測得的-14.58℃。這可能與本試驗浸提時間更長,電解質外滲更充分等有關。

MDA 是細胞膜脂過氧化產物,其含量常作為膜系統(tǒng)損傷程度的指標。研究表明,MDA 含量隨著脅迫溫度的降低均有不同程度的上升[21-22]。而本研究中,MDA 含量隨著處理溫度的降低及脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢。這與李吉濤等[9]的研究結果相似,但其測得的MDA 含量達到峰值的溫度低于LT50,與本研究不同,推測可能是由于本試驗降溫較快,導致細胞受低溫傷害在較短的時間內死亡,MDA含量保持在一個較低水平,具體原因有待進一步研究。

SOD、POD、CAT 是抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧的主要酶[23-24]。本試驗中,金花茶葉片SOD 活性隨處理溫度的降低而降低,POD、CAT 活性雖有波動,但總體呈上升趨勢。前人研究表明,茶樹SOD 同工酶活性及譜帶數(shù)隨處理溫度的降低和脅迫時間的延長均呈不同程度的降低或減少[25],冬季低溫導致茶樹葉片的CAT、POD 活性提高,而POD 同工酶譜帶增加[26]。這與本研究結果類似。

植物體內束縛水含量的增加有利于提高抗寒性。研究發(fā)現(xiàn)隨著脅迫溫度的降低,植物BW/FW 一般呈現(xiàn)持續(xù)上升[27]或先上升再下降[28-30]兩種變化趨勢。本研究中,金花茶葉片的BW/FW 總體呈先上升后下降的趨勢,可能因為在一定的脅迫溫度和時間內,金花茶植株能通過提高BW/FW 來降低代謝活性,減輕低溫傷害,但當脅迫溫度和時間超過其忍受范圍后,細胞結構和代謝受到嚴重破壞,BW/FW 反而下降。

Pro 和SS 是細胞內重要的滲透調節(jié)物質,其中Pro 具有增強細胞抗脫水能力、穩(wěn)定細胞蛋白質結構的作用[31],SS 可以通過提高細胞液濃度來降低冰點,其含量與植物的抗寒性相關[32-33]。田野等[34]研究發(fā)現(xiàn)SS、Pro 都是茶樹抗寒物質,且SS 含量與溫度的相關性大于Pro 含量與溫度的相關性。本研究中,金花茶葉片Pro 含量隨著處理溫度的下降呈先上升后下降的趨勢。這與李吉濤等[10]的研究結果相似,但Pro 含量達到最大值的溫度不同;SS 含量隨著處理溫度的降低呈上升趨勢,但隨著脅迫時間的延長維持穩(wěn)定或最終下降,可能原因是細胞受到低溫脅迫后,水解能力增強,淀粉等大分子化合物降解成SS 等物質,隨著脅迫時間的延長,糖類大分子化合物持續(xù)減少,使得產物SS 的含量保持穩(wěn)定或下降。

表2 不同低溫脅迫下金花茶葉片各項指標的相關性分析Table 2 Correlations among the tested parameters of C.nitidissima leaives under low temperature stress

4 結論

本研究結果表明,金花茶幼苗引種地的極端低溫不宜低于-6℃,建議如果引種地最低氣溫低于-6℃,應做好防寒保護措施或采用設施栽培。金花茶葉片的CIR 隨著處理溫度的降低呈顯著上升的趨勢,相關性分析表明BW、SS、SOD、POD、CAT 在脅迫的不同階段與CIR 顯著相關,因此可以將CIR 作為金花茶抗寒性鑒定的主要指標,將BW/FW、SS、SOD、POD、CAT 作為抗寒性鑒定的輔助指標。本研究為進一步探討金花茶品種抗寒性及栽培區(qū)域選擇提供了科學依據(jù)。

致謝:福建省農業(yè)科學院果樹研究所為本研究提供了實驗場地和實驗儀器,謹此致謝!