低溫貯藏對美味獼猴桃布魯諾果實(shí)主要揮發(fā)性物質(zhì)和脂肪酸代謝的影響

陶淑華 陳 麗 蔣鎮(zhèn)燁 宋倩倩 宋亦超 姜天甲 鄭小林

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310018)

果實(shí)風(fēng)味是評價(jià)采后果實(shí)品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[1],主要由酯類、醛類、醇類、內(nèi)酯類、萜類、羰基化合物及一些含硫化合物等多種揮發(fā)性物質(zhì)通過累加、協(xié)同或抑制作用形成。果實(shí)風(fēng)味具有種或品種差異,且采后果實(shí)風(fēng)味會(huì)隨貯藏進(jìn)程發(fā)生變化。因此,采后果實(shí)的風(fēng)味變化及其調(diào)控引起了研究者的廣泛關(guān)注。已有研究表明,果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的生成存在多種合成途徑,根據(jù)前體物質(zhì)的不同可分為脂肪酸途徑、氨基酸途徑、單糖途徑和萜類合成途徑等,其中脂肪酸代謝途徑又分為脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)代謝途徑和β-氧化途徑[2-3]。

獼猴桃屬于典型的呼吸躍變型果實(shí),在后熟過程中會(huì)伴隨揮發(fā)性物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化,形成果實(shí)獨(dú)特的風(fēng)味。目前,已從中華獼猴桃、美味獼猴桃、毛花獼猴桃果實(shí)中鑒定出300 多種揮發(fā)性物質(zhì),主要包括酯類、醛酮類、醇類以及雜環(huán)化合物等[4]。研究表明,不同品種獼猴桃果實(shí)的揮發(fā)性成分和含量在成熟過程中發(fā)生變化,導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味變化,其中,LOX 代謝途徑在獼猴桃果實(shí)的成熟過程中起重要作用,并對果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)尤其是酯類、醛酮類的合成至關(guān)重要[5]。低溫能夠降低采后果蔬的生理代謝活性,控制病原微生物生長,從而延緩果蔬的成熟衰老,降低果蔬的腐爛,保持產(chǎn)品的品質(zhì),因此,低溫貯藏是采后果蔬貯藏保鮮最通用有效的方法[6]。同樣,低溫貯藏也是獼猴桃果實(shí)最常用的保鮮方法,但低溫貯藏往往影響獼猴桃果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的形成,從而影響果品質(zhì)量和商品性[7-8]。

美味獼猴桃布魯諾(Actinidia deliciosa.cv.Bruno)是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所從新西蘭引進(jìn)的優(yōu)良栽培品種,其果實(shí)呈長圓柱形,外觀好,大小適中,果肉呈翠綠色,糖度高,風(fēng)味濃[9]。浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院鄭小林課題組前期研究了常溫和低溫貯藏對美味獼猴桃布魯諾果實(shí)乙醇代謝和揮發(fā)性成分的影響,發(fā)現(xiàn)低溫貯藏有助于保持果實(shí)品質(zhì),因其可有效抑制果實(shí)后熟過程中乙醇的代謝活性,從而避免果實(shí)完熟后產(chǎn)生過重“酒精味”;但低溫貯藏減弱了果實(shí)后續(xù)的乙醇酯化反應(yīng),導(dǎo)致完熟果實(shí)的酯類物質(zhì)種類及含量降低[8]。為此,本試驗(yàn)以美味獼猴桃布魯諾果實(shí)為材料,比較分析常溫和低溫貯藏下獼猴桃果實(shí)脂肪酸合成途徑關(guān)鍵酶活性及其基因相對表達(dá)量的變化,進(jìn)一步探討低溫貯藏對獼猴桃果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)合成代謝的影響,以期為調(diào)控獼猴桃采后果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

美味獼猴桃布魯諾果實(shí)于2016 年10 月26 日采自浙江省溫州市泰順縣尚進(jìn)農(nóng)業(yè)合作社獼猴桃種植基地。選取大小均勻、成熟度一致、無病蟲害、無機(jī)械傷的果實(shí),于室溫下放置過夜,以去除果實(shí)殘留田間熱。次日將獼猴桃果實(shí)隨機(jī)分為2 組,分別置于常溫(20±0.5℃,相對濕度80%～90%)和低溫(1±0.5℃,相對濕度80%～90%)恒溫恒濕箱中貯藏。常溫和低溫貯藏組分別每隔3 d 和15 d 取樣。每次分別從各組隨機(jī)選取20 個(gè)果實(shí),去除果皮和果心后,將果肉切碎混勻,液氮處理后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)、VF-WAXms色譜柱、SPME 手動(dòng)進(jìn)樣器,美國安捷倫科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭,美國Supelco公司;HH-4 數(shù)顯水浴鍋,常州澳華儀器有限公司;SIGMA3-30K 高速離心機(jī),德國SIGMA 公司;UV-1800 紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司;ORION STAR SERIES PH 計(jì),美國THERMO 公司;CFX384 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀,美國Bio-Rad 公司;AB135-S電子天平,瑞士METTLER TOLEDO 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)測定 參考李盼盼等[8]的方法,稍作改動(dòng)。取5 g 果肉,加入6 mL 飽和氯化鈉溶液,冰浴研磨勻漿轉(zhuǎn)入20 mL 頂空樣品瓶中,用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空樣品瓶置于50℃水浴鍋平衡30 min,然后將萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm 處,50℃吸附30 min,取出后插入GC 進(jìn)樣口,250℃解析3 min,進(jìn)行GC-MS 分析,重復(fù)3 次。

色譜條件:色譜柱:VF-WAXms,30 m×0.25 mm ×0.25 μm(柱長× 內(nèi)徑× 膜厚);進(jìn)樣口溫度250℃,分流比1∶1,載氣為氦氣,恒流模式,柱流速1 mL·min-1,柱溫:35℃保持3 min,以2℃·min-1升至120℃,然后以4℃·min-1升至180℃,再以10℃·min-1升至240℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:離子源:EI,離子源溫度:230℃,四級桿溫度:150℃,質(zhì)量數(shù)掃描范圍:33～400 amu。

1.3.2 揮發(fā)性成分定性和定量分析 定性方法:利用計(jì)算機(jī)檢索NIST/WILLEY 標(biāo)準(zhǔn)譜庫及資料分析對離子譜圖進(jìn)行匹配分析。

定量方法:揮發(fā)性成分相對百分含量用峰面積歸一法計(jì)算。

1.3.3 果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)分析 參照黃梅麗等[10]的方法,對相對含量大于1%且閾值相對較小的揮發(fā)性成分進(jìn)行香氣活性值分析,即香氣活性值(odor activity value,OAV)=香味物質(zhì)的濃度/香氣閾值。

香氣閾值參考文獻(xiàn)[11-12]。當(dāng)OAV 小于1 時(shí),表示該成分對香味沒有貢獻(xiàn);當(dāng)OAV 大于1 時(shí),其值越大則該成分對香味的貢獻(xiàn)越大,也表明該成分是構(gòu)成果實(shí)風(fēng)味的特征風(fēng)味之一。

1.3.4 亞油酸和亞麻酸含量測定 將果肉組織真空冷凍干燥36 h,取2 g 果肉組織干樣于索氏提取器,燒瓶中加入100 mL 石油醚,于70℃水浴回流5 h,減壓旋蒸除去石油醚,得到淡黃色或黃色透明提取液。取0.5 mL 樣品提取液,加入4 mL 0.5 mol·L-1KOHCH3OH 溶液,置恒溫水浴鍋內(nèi)70℃回流1 h,放置至室溫后,加入3 mL 正己烷充分振蕩,3 000 r·min-1離心20 min。將上層清液用適量的無水硫酸鈉干燥后,過0.22 μm 有機(jī)膜,進(jìn)行GC-MS 分析,重復(fù)3 次。

色譜條件:色譜柱:DB-WAX,60 m × 0.25 mm ×0.5 μm(柱長× 內(nèi)徑× 膜厚)。進(jìn)樣口溫度:240℃,進(jìn)樣量:2.5 μL,不分流進(jìn)樣,恒流模式。柱流速:2 mL·min-1,柱溫:50℃保持3 min,以20℃·min-1升至200℃,然后以3℃·min-1升至240℃,保持10 min。

質(zhì)譜條件:離子源:EI,離子源溫度:230℃,四級桿溫度:150℃,質(zhì)量數(shù)掃描范圍:33～500 amu。

用正己烷配制不同濃度的亞油酸和亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,確定出峰時(shí)間,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵酶活性測定 脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)測定:參考陳昆松等[13]的方法,略有改動(dòng)。取2 g 果肉,加入10 mL 0.1 mol·L-1磷酸提取緩沖液(含4%聚乙烯聚吡咯烷酮crosslinking polyvingypyrrolidone PVPP,pH 值6.8),冰浴研磨勻漿,4℃、10 000×g離心20 min,上清液即為粗酶液,0℃冰浴保存?zhèn)溆谩?/p>

脂氧合酶活性反應(yīng)體系:2.75 mL 0.1 mol·L-1乙酸緩沖液(pH 值5.5),50 μL 5 mmol·L-1亞油酸鈉,200 μL 粗酶液。于234 nm 波長處測定吸光度,加酶液15 s 開始計(jì)時(shí),記錄1 min 內(nèi)吸光度值變化,結(jié)果用U·g-1FW 表示。

氫過氧化物裂解酶(hydroperoxidase,HPL)活性測定:參考Vick[14]的方法,略有改動(dòng)。取2 g 果肉,加入4 mL 0.15 mol·L-1HEPES-KOH 提取緩沖液[含10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1Ethylene Diamine Tetraactetic Acid(EDTA)、250 mmol·L-1山梨醇、0.1 mmol·L-1Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF),4%PVPP、1%甘油,pH 值8.0],冰浴研磨勻漿,4℃、10 000×g離心20 min,上清液即為酶液,冰浴保存?zhèn)溆?。酶活性測定參照HPL 試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)的方法。

乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase,ADH)活性測定:參考Longhurst 等[15]的方法,略有改動(dòng)。取2 g 果肉,加入5 mL 0.1 mol·L-1MES-Tris 提取緩沖液[含2 mmol·L-1二硫蘇糖醇DL-Dithiothreitol(DTT)、4%PVPP,pH 值6.5],冰浴研磨勻漿,4℃、12 000×g離心20 min,上清液即為酶液,冰浴保存?zhèn)溆谩Ｃ富钚詼y定參照ADH 試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)的方法。

醇酰基轉(zhuǎn)移酶(alcohol acyltransferase,AAT)活性測定:參考Salas[16]的方法,略有改動(dòng)。取2 g 果肉,加入4 mL 0.1 mol·L-1磷酸提取緩沖液(含1 mmol·L-1DTT、1% PVPP、0.1% Triton X-100,pH 值8.0),冰浴研磨勻漿,4℃、12 000×g離心20 min,上清液即為酶液,冰浴保存?zhèn)溆?。酶活性測定參照AAT 試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)的方法。

上述酶活性測定均重復(fù)3 次。

1.3.6 脂肪酸代謝途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的測定 獼猴桃果肉總RNA 提取參考Zhu 等[17]的方法,采用SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。Real-Time PCR 檢測:利用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列及條件見表1。其中,AAT1、AAT17 編碼基因引物序列及條件查詢Günther 等[18]的結(jié)果。PCR 反應(yīng)體系為20 μL,包括8.0 μL SDW、10.0 μL Power SYBR? Green Master Mix、0.5 μL(10 μmol·L-1)Forward Primer、0.5 μL(10 μmol·L-1)Reverse Primer,1.0 μL cDNA。PCR 反應(yīng)程序采用二步法:95℃預(yù)變性1 min,95℃變性15 s,63℃退火25 s,40 個(gè)循環(huán),在PCR 反應(yīng)的第二步采集熒光信號。各基因的相對表達(dá)水平以2(Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 Real-Time PCR 引物序列及條件Table 1 Real-Time PCR primers and conditions

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 和SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫、低溫貯藏期間果實(shí)主要揮發(fā)性成分相對含量的變化

對檢測鑒定出的獼猴桃果實(shí)揮發(fā)性成分按酯類、醛酮類和醇類進(jìn)行歸類分析。由表2 可知,常溫貯藏下,果實(shí)酯類物質(zhì)相對含量持續(xù)升高,貯藏7 ～10 d 期間相對含量顯著升高(P＜0.05),10 d 時(shí)其含量為7 d 的10 倍;低溫貯藏下,果實(shí)酯類物質(zhì)含量呈波動(dòng)式下降,總體變化幅度平緩。表明低溫貯藏降低了獼猴桃果實(shí)酯類的相對含量,從而改變了果實(shí)特有風(fēng)味。

常溫貯藏下,果實(shí)醛酮類物質(zhì)在整個(gè)貯藏期間呈先增大后減小的趨勢,在貯藏4 d 時(shí)其相對含量達(dá)到最高(80.57%),隨后下降,在貯藏10 d 時(shí)顯著下降(P＜0.05),此時(shí)其相對含量為貯藏7 d 的三分之一;低溫貯藏下,果實(shí)醛酮類物質(zhì)相對含量較穩(wěn)定,在77.29%～82.30%范圍內(nèi)變化。

常溫貯藏下,果實(shí)醇類物質(zhì)相對含量呈先增加后減小的趨勢,在貯藏7 d 時(shí)達(dá)到峰值(14.12%);低溫貯藏下,果實(shí)醇類物質(zhì)相對含量總體呈波動(dòng)上升趨勢,在貯藏后期達(dá)到最大值(14.04%)。雖然常溫和低溫貯藏下果實(shí)的醇類揮發(fā)性組分在最大相對含量差異不顯著(P＞0.05),但常溫貯藏7 d 時(shí),其含量達(dá)到高峰值,而后顯著降低;而低溫貯藏在61 d 時(shí)才出現(xiàn)高峰值。

表2 常溫和低溫貯藏期間果實(shí)主要揮發(fā)性成分相對含量的變化Table 2 Changes in relative contents of the main volatile components in kiwifruit during storage at room and lower temperature /%

2.2 常溫、低溫貯藏期間果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)分析

由表3 可知,常溫貯藏下,果實(shí)的特征風(fēng)味物質(zhì)成分在整個(gè)過程中變化較大,在貯藏1 ～4 d 時(shí)有4 種特征風(fēng)味物質(zhì),按香氣活性值的大小依次為2-己烯醛、己醛、2-己烯醇和丁酸丁酯;貯藏7 ～13 d 時(shí)有9 種特征風(fēng)味物質(zhì),按香氣活性值的大小依次為丁酸乙酯、2-己烯醛、己醛、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸甲酯、乙醇、2-己烯醇和丁酸丁酯。低溫貯藏下,果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)在整個(gè)過程相對穩(wěn)定,包括2-己烯醛、己醛和2-己烯醇。表明獼猴桃采后果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)主要是丁酸乙酯、己酸乙酯、2-己烯醛、乙酸乙酯、己醛、丁酸甲酯、乙醇、2-己烯醇和丁酸丁酯等。

在OAV 的基礎(chǔ)上對常溫和低溫貯藏下果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析,由表4 可知,有2 個(gè)主成分特征值大于1,第一主成分(PCA1)特征值為7.402,貢獻(xiàn)率為82.239%,第二主成分(PCA2)特征值為1.073,貢獻(xiàn)率為11.923%,2 種主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)94.162%,基本可以代表樣品的全部信息特征。

由圖1 可知,常溫貯藏下各個(gè)貯藏時(shí)間點(diǎn)分布較為松散,表明在整個(gè)貯藏期間果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)變化較大;而低溫貯藏下各貯藏時(shí)間點(diǎn)分布相對集中,貯藏1 d 和16 d 的點(diǎn)分布于PCA2 正區(qū),而貯藏31 d 之后的點(diǎn)分布較緊密,且處于PCA2 負(fù)區(qū)。表明在整個(gè)低溫貯藏期間,獼猴桃果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生變化的點(diǎn)處于貯藏16 d 左右。

本試驗(yàn)采用系統(tǒng)聚類法,以歐氏距離的平方為度量準(zhǔn)則,通過離差平方和法,以獼猴桃果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)中OAV 最高的8 種物質(zhì)作為變量,對2 種貯藏溫度下5 個(gè)貯藏期獼猴桃果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行聚類分析。由圖2 可知,當(dāng)橫坐標(biāo)距離為5 時(shí),2 種貯藏溫度下各貯藏期的獼猴桃果實(shí)可聚為兩類,常溫貯藏第10、第13 天的果實(shí)聚為一類,其他貯藏期的果實(shí)聚為一類。其中,低溫貯藏第31、第46 天的果實(shí)首先聚為一類,隨后低溫貯藏第1、第16 天的果實(shí)聚為一類。揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析說明,常溫貯藏第10 天獼猴桃果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了較大變化,而低溫貯藏獼猴桃果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)的變化可能發(fā)生在第16 和第46 天。

2.3 常溫、低溫貯藏期間果實(shí)不飽和脂肪酸含量的變化

由圖3-A 可知,常溫貯藏初期,果實(shí)亞麻酸含量急劇降低,至4 d 達(dá)到最低水平,之后隨貯藏時(shí)間延長保持相對穩(wěn)定;低溫貯藏期間,果實(shí)亞麻酸含量在前16 d保持不變,之后急劇增加,在31 d 時(shí)達(dá)到高峰后開始降低。對比發(fā)現(xiàn),低溫貯藏前期亞麻酸的含量幾乎不變,貯藏期果實(shí)亞麻酸含量最大值約為常溫貯藏最大值的2 倍。

表3 常溫和低溫貯藏期間果實(shí)主要揮發(fā)性成分的香氣值Table 3 Odor activity values of main volatile compounds in kiwifruit during storage at room or lower temperature

表4 4 個(gè)主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues of 4 principal components and their contribution and cumulative contribution

由圖3-B 可知,常溫貯藏期間,獼猴桃果實(shí)亞油酸含量在第4 天時(shí)達(dá)到峰值,隨后緩慢下降;低溫貯藏下,果實(shí)亞油酸含量不斷增加,貯藏46 d 時(shí)達(dá)到高峰,隨后急劇降低。低溫貯藏期間果實(shí)亞油酸含量均高于常溫貯藏,且其最高含量約為常溫貯藏期間最高含量的4 倍。

2.4 常溫、低溫貯藏下果實(shí)LOX、HPL、ADH 和AAT 活性的變化

由圖4-A 可知,果實(shí)LOX 活性在常溫貯藏下隨貯藏時(shí)間的延長急劇增加,且在貯藏10 d 達(dá)到峰值,而后下降;低溫貯藏下,果實(shí)LOX 活性逐漸增強(qiáng),貯藏46 d 達(dá)到最大值,而后略微下降。常溫貯藏果實(shí)LOX 活性均高于低溫貯藏。表明低溫緩解了果實(shí)貯藏期間LOX 活性的增加速率,從而降低氫過氧化物在果實(shí)內(nèi)的積累。

由圖4-B 可知,果實(shí)HPL 活性在常溫貯藏期間呈波動(dòng)變化趨勢,貯藏7 d 時(shí)活性達(dá)到最高;而低溫貯藏期間,果實(shí)HPL 活性前期略有下降而后上升,總體變化趨勢不明顯。常溫貯藏期間果實(shí)HPL 活性高于低溫貯藏,且其最大值是低溫貯藏最大值的2 倍。表明低溫同樣抑制了HPL 活性,阻礙了果實(shí)中醛類物質(zhì)的生成積累。

由圖4-C 可知,果實(shí)ADH 活性在常溫貯藏前7 d緩慢升高,而后急劇增加,至貯藏10 d 達(dá)到峰值隨后迅速降低;低溫貯藏期間,果實(shí)ADH 活性呈緩慢上升趨勢,在貯藏61 d 時(shí)ADH 活性達(dá)到最高。與LOX 和HPL 相比,低溫貯藏對ADH 活性的抑制效果更為明顯,常溫貯藏下ADH 活性最大值約是低溫貯藏最大值的3.4 倍。

由圖4-D 可知,果實(shí)AAT 活性在常溫貯藏期間不斷增加;但低溫貯藏期間其活性不斷下降,貯藏46 d達(dá)到最低值,而后略有增加。常溫貯藏下果實(shí)AAT 在16 d 時(shí)達(dá)到最大值,約為低溫貯藏最大值的2 倍。

圖1 常溫低溫貯藏期間布魯諾獼猴桃果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)的PCA 分析Fig.1 PCA analysis of Bruno characteristic flavor compounds during storage at room or lower temperature

圖2 常溫低溫貯藏期間布魯諾獼猴桃果實(shí)特征風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of Bruno characteristic flavor compounds during storage at room or lower temperature

2.5 常溫、低溫貯藏下果實(shí)LOX、HPL、ADH 和AAT相對表達(dá)量的變化

由圖5-A 可知,果實(shí)LOX相對表達(dá)量在常溫貯藏期間急劇增加;在低溫貯藏前46 d 緩慢增加,而后快速增加。果實(shí)在常溫和低溫貯藏下LOX相對表達(dá)量在初期處于相同水平,隨著貯藏時(shí)間的延長,兩者的表達(dá)量差異逐漸增大。表明低溫有效抑制了LOX的相對表達(dá)。

圖3 常溫和低溫貯藏下果實(shí)亞麻酸和亞油酸含量的變化Fig.3 Changes in contents of linolenic acid and linoleic acid in kiwifruit during storage at room or lower temperature

圖4 常溫和低溫貯藏下果實(shí)LOX、HPL、ADH 和AAT 活性的變化Fig.4 Changes in activities of LOX,HPL,ADH,and AAT in kiwifruit during storage at room or lower temperature

由圖5-B 可知,果實(shí)HPL相對表達(dá)量同樣在常溫貯藏期間急劇增加;而低溫貯藏期間前16 d 保持穩(wěn)定,而后呈波動(dòng)增加趨勢。果實(shí)低溫貯藏雖減緩了HPL表達(dá)量的增加速度,但隨著貯藏時(shí)間的延長,HPL相對表達(dá)量最終與常溫貯藏水平相當(dāng)。說明低溫貯藏可延緩HPL表達(dá)速度。

由圖5-C 可知,果實(shí)ADH相對表達(dá)量在常溫貯藏期間先急劇增加,至貯藏10 d 時(shí)達(dá)到峰值,而后降低;低溫貯藏前46 d 果實(shí)ADH保持相對穩(wěn)定的表達(dá)水平,而后增加。雖然低溫對獼猴桃果實(shí)ADH表達(dá)有抑制作用,但其相對表達(dá)量在2 種貯藏方式后期的水平相當(dāng)。

由圖5-D 可知,果實(shí)AAT1 相對表達(dá)量在常溫貯藏期間急劇增加;低溫貯藏期間其活性值不斷增加至31 d 后降低,并在46 d 后再急劇增加。常溫和低溫貯藏下AAT1 的相對表達(dá)量存在差異,低溫抑制了AAT1在貯藏中期的表達(dá),后期抑制作用降低。

圖5 常溫和低溫貯藏下果實(shí)LOX、HPL、ADH、AAT1 和AAT17 相對表達(dá)量的變化Fig.5 Changes in relative expressive level of LOX, HPL, ADH, AAT1,and AAT17 in kiwifruit during storage at room or lower temperature

由圖5-E 可知,果實(shí)AAT17 相對表達(dá)量在常溫貯藏期間先急劇增加至貯藏10 d 達(dá)到峰值,而后急劇下降;低溫貯藏前16 d 略有下降,而后不斷增加,貯藏46 d 時(shí)達(dá)到高峰,隨后下降。與常溫貯藏相比,低溫貯藏后期其相對表達(dá)量也同樣達(dá)到了相當(dāng)水平。

3 討論

揮發(fā)性物質(zhì)的構(gòu)成種類和含量是影響果實(shí)香味的關(guān)鍵因素。揮發(fā)性物質(zhì)屬于次級代謝產(chǎn)物,主要包括酯類、醛類、醇類、酸類和萜類等物質(zhì),但果實(shí)成熟過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是酯類[19-21]。不同的采后保鮮處理、貯藏條件和貯藏時(shí)間常常導(dǎo)致果實(shí)成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量產(chǎn)生變化[22-24],尤其是低溫貯藏影響果實(shí)成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)化[7-8,24]。王貴章等[25]研究表明低溫貯藏抑制桃果實(shí)中19 種揮發(fā)性物質(zhì)的合成。郭麗芳等[26]研究發(fā)現(xiàn)金艷獼猴桃在冷藏下風(fēng)味物質(zhì)的變化主要表現(xiàn)為抑制酯類及烯類物質(zhì)的產(chǎn)生。本研究表明,在常溫和低溫貯藏下,布魯諾獼猴桃果實(shí)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均包括酯類、醛類、酮類、醇類、酸類和烷烴類;其中,常溫下隨著貯藏時(shí)間延長,獼猴桃果實(shí)的酯類持續(xù)增加,醛酮類物質(zhì)在后期大幅度降低;但與常溫貯藏相比,低溫貯藏降低了獼猴桃果實(shí)中酯類物質(zhì)的種類和相對含量,并保持較高醛酮類物質(zhì)種類和相對含量。另外,分析OAV 發(fā)現(xiàn),常溫下獼猴桃果實(shí)的特征風(fēng)味物質(zhì)是2-己烯醛、己醛、2 -己烯醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸甲酯和丁酸丁酯等,而在低溫貯藏下僅有2-己烯醛、己醛和2 -己烯醇等3 種特征風(fēng)味物質(zhì)。說明美味獼猴桃布魯諾采后果實(shí)可能主要通過脂肪酸代謝途徑合成主要揮發(fā)性物質(zhì),而低溫抑制了采后果實(shí)的脂肪酸代謝活性,從而抑制了醛酮類物質(zhì)向酯類物質(zhì)的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)中的直鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)主要來源于脂肪酸氧化[27]。LOX 催化亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化而形成過氧羥基脂肪酸,然后HPL 將其裂解形成醛類或烯醛類化合物;醛類化合物經(jīng)ADH 催化形成相應(yīng)的醇類,AAT 提供?；蓪⑦@些醇類轉(zhuǎn)化形成相應(yīng)的酯類化合物[28]。研究表明LOX、HPL、ADH 和AAT 是薄皮甜瓜[29]、梨[30-31]、杏[32]、菠蘿蜜[33]、番茄[34]等果實(shí)主要揮發(fā)性物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶,LOX 代謝途徑是采后果實(shí)揮發(fā)性化合物形成的主要來源。本研究表明,常溫下獼猴桃布魯諾果實(shí)LOX、HPL、ADH 和AAT 活性及其基因的表達(dá)量大體隨果實(shí)成熟進(jìn)程而快速增加,并伴隨酯類揮發(fā)性成分含量的急劇增加,醛酮類揮發(fā)性成分的急劇降低;但低溫不僅降低了獼猴桃布魯諾果實(shí)LOX 代謝前體物質(zhì)亞油酸和亞麻酸的分解,而且抑制了LOX、HPL、ADH 和AAT 等代謝相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)量,使果實(shí)在低溫貯藏期間酯類含量保持在較低的水平,醛酮類含量維持在相對穩(wěn)定的高水平狀態(tài)。說明LOX 代謝途徑在美味獼猴桃布魯諾果實(shí)采后主要揮發(fā)性物質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。然而,低溫貯藏對獼猴桃果實(shí)貨架期風(fēng)味物質(zhì)的影響,特別是果實(shí)低溫貯藏后在常溫貨架期間能否達(dá)到與常溫貯藏下相同的風(fēng)味品質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫貯藏影響美味獼猴桃布魯諾果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量,主要通過調(diào)控脂肪酸代謝的LOX 代謝途徑相關(guān)酶及其基因的相對表達(dá)量來控制酯類、醛酮類物質(zhì)的合成與分解;特別是抑制LOX 代謝途徑中的ADH 和AAT 活性及其基因的表達(dá),從而使果實(shí)在低溫貯藏期間酯類揮發(fā)性物質(zhì)含量保持很低的水平,醛酮類物質(zhì)含量維持在相對穩(wěn)定的高水平;當(dāng)果實(shí)在低溫貯藏61 d 后,其醛酮類物質(zhì)含量為常溫貯藏13 d(果實(shí)完全成熟)的3 倍以上。因此,低溫貯藏抑制美味獼猴桃布魯諾果實(shí)的脂肪酸代謝活性,使果實(shí)的脂類物質(zhì)含量低,醛酮類物質(zhì)含量高,從而較好維持了果實(shí)的特征風(fēng)味。