花生栽培種InDel有效標記篩選與評估

劉 宇 閆彩霞 李春娟 徐洪明 孔 青 孫全喜王 娟 單世華

(1山東省花生研究所,山東 青島 266100;2中國海洋大學食品科學與工程學院,山東 青島 266000;3東阿縣農業(yè)技術推廣站,山東 聊城 252200)

花生是一年生草本植物,作為我國重要的油料作物和經濟作物之一,是優(yōu)質植物油和植物蛋白的重要來源[1-2]。其中,花生栽培種(Arachis hypogaeaL.)為異源四倍體(2n=4x=40,AABB)[3],與野生種(Arachisspp.)相比,其低水平的遺傳變異與有限的種質資源[4-5]限制了栽培種花生育種的研究與發(fā)展。雖然傳統育種獲得較大突破,但仍存在育種效率低、周期長的缺點。為了加快育種進程、縮短育種時間,以分子標記輔助育種為核心的育種體系,成為分子育種的重要研究內容。近年來,測序技術的快速發(fā)展使得新一代測序技術(next-generation sequencing,NGS)向低成本、高通量的方向發(fā)展[6],其中以測序技術為基礎的分子標記技術得到了迅猛發(fā)展。目前所開發(fā)的分子標記有上萬個,但在花生中僅有14.5%的分子標記顯示具有多態(tài)性,可用于構建遺傳圖譜的分子標記只有6.4%[7]。開發(fā)新的花生分子標記已成為當前研究的重要一環(huán)。

插入/缺失多態(tài)性(insertion-deletion,InDel)作為結構變異(structure variants,SVs)的重要組成部分廣泛的存在于基因組中,其分布密度僅次于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[8],且在一些農作物中InDel 標記的多態(tài)性高于簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)標記[9]。與SNP 標記相比,InDel 標記設計與檢測更簡單[10]。同時,InDel標記作為一種新型的共顯性分子標記,兼具各類遺傳標記優(yōu)點,具有開發(fā)成本低、準確性高、變異穩(wěn)定、易于分型等優(yōu)點[11]。此外,同樣長度的2 個InDel 變異不可能出現在同一個基因組位點上[12]。

目前基于全基因組水平開發(fā)的InDel 標記已廣泛應用于水稻[13]、沙梨[14]、油菜[15]、黃瓜[16]、葡萄[17]、棉花[18]等植物研究領域。季高翔等[19]基于棉花重測序數據開發(fā)了新標記,將矮化基因AS98 重新定位于D12 染色體InDel 50 和InDel 83 標記之間,物理間距45 kb。Chung 等[20]基于345 份玉米基因組重測序獲得1 973 746 個獨立的InDel 位點,這些InDel 位點多位于基因編碼區(qū),利用100 對引物對4 份玉米材料進行鑒定,獲得了89 個多態(tài)性引物。但在花生全基因組水平上開發(fā)和應用的 InDel 標記相對較少,Vishwakarma 等[21]基于花生全基因水平上開發(fā)出515 223 個InDels,并用長度大于50 bp 的InDel 位點設計5 698 對引物,利用其中214 個InDel 引物篩選出86 對多態(tài)性引物。本研究基于王娟等[22]簡化的花生基因組測序(reduced-representation genome sequencing,RRGS)結果,增加測試深度與廣度,篩選InDel 位點,選取遺傳背景較大的覆蓋4 個植物學類型的花生種質進行InDel 標記的有效性檢驗,并評估其在花生研究中的應用潛力,以期豐富可用于栽培種花生的分子標記,為InDel 標記在栽培種花生優(yōu)異基因挖掘、基因精細定位、遺傳多樣性分析等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取21 份遺傳背景差異較大的4 個植物學類型的花生種質作為檢測引物有效性材料,其中普通型6份、龍生型5 份、珍珠豆型7 份、多粒型3 份(表1)。每份種質選取2 粒完整飽滿種子,于培養(yǎng)皿中避光浸種3～4 d,待芽長至2～4 cm 后置于光照培養(yǎng)箱(溫度25℃,光照強度12 000 Lux)培養(yǎng)10 ～13 d,取幼嫩新葉。

表1 21 份花生種質信息表Table 1 Information of 21 peanut germplasms

1.2 InDel 位點篩選與引物設計

基于簡化基因組測序結果,利用Mircosoft Office Excel 2010 篩選出插入/缺失堿基數為3 ～12 bp 的InDel 位點?；诨ㄉ耘喾N基因組序列,將篩選出的位點定位在基因組上,于InDel 位點兩翼各200 bp 長度內進行引物設計。引物設計使用Primer 6.0,上游設計范圍為1～200 bp,下游設計范圍為213 ～401 bp,產物大小在150～350 bp 之間,退火溫度50～60℃。引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

1.3 DNA 提取

采用植物基因組DP305-2 DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取材料花生的DNA,P100/P100+ Nanodrop-超微量分光光度計(Pultton,美國)檢測基因組DNA 質量與濃度,濃度稀釋至20 ng·μL-1。

1.4 PCR 擴增和電泳分析

25 μL PCR 反應體系:2 × EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL、DNA 模板0.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應程序:95℃預變性5 min,94℃變性50 s,60℃退火1 min,72℃延伸50 s,34 個循環(huán);72℃延伸7 min,4℃條件保存。

6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,電壓100 Ⅴ,電泳2 ～3 h。銀染顯色(參照張軍等[23]的銀染方法),拍照保存。

1.5 數據分析

根據引物對21 份花生種質的擴增結果進行記錄,有帶記為1,無帶記為0,缺失記為-,并使用A、B、C、D等大寫字母記錄基因型。利用POPGENE 軟件計算Shannon 指數、等位基因數、有效等位基因數。根據公式計算多態(tài)性信息量(polymorphism information content,PIC),即PIC=1-∑(xi)2,其中xi表示InDel位點第i個等位基因的相對頻率。

2 結果與分析

2.1 InDel 標記的鑒定

通過篩選獲得插入/缺失為3 ～12 bp 的InDel 位點共39 個,根據其位置信息設計39 對InDel 標記引物。由表2 可知,13 號染色體有6 個位點,12 號染色體有4 個位點,其余染色體位點較少。此外,有11 個位點位于外顯子區(qū)域,18 個位點位于內含子區(qū)域,5′端非翻譯區(qū)7 個位點,3′端非翻譯區(qū)3 個位點。由此可推測,栽培種花生基因組中的InDel 變異多位于非編碼序列。

表2 本研究篩選的39 個InDel 標記信息Table 2 The information of the 39 InDel markers screened in this study

表2(續(xù))

2.2 InDel 標記有效性檢驗

以21 份花生種質基因組DNA 為模板,采用PCR方法檢驗39 對引物的有效性。39 對引物均能擴增出清晰、均一的條帶,條帶大小與預測產物大小基本相同。經統計獲得多態(tài)性引物14 對,占總設計引物數的35.9%。其中,引物InDel-28 擴增結果變異最為豐富,獲得5 種不同類型的條帶(圖1-A);引物InDel-19擴增獲得3 種類型條帶,但僅有2 份種質出現變異(圖1-B);InDel-23 引物擴增獲得2 種類型條帶,變異較為豐富(圖1-C)。

圖1 3 個InDel 標記多態(tài)性檢測結果Fig.1 The polymorphism detection results of 3 InDel primers

2.3 InDel 標記在鑒定種質資源和特異性中的應用及其功能評價

利用軟件POPGENE 1.32 對14 對多態(tài)性引物在21 份花生種質中的擴增結果進行分析。由表3 可知,14 對引物共檢測出36 個等位基因,等位基因數為2 ～5 個,平均每個標記2.571 4 個。有效等位基因數介于1.099 8～3.073 2 之間,平均值為1.630 2。其中InDel-28 位點檢測到的等位基因數最多,為5 個;8 個InDels 位點只檢測到2 個等位基因;5 個InDels 位點檢測到3 個等位基因。Shannon 指數分布在0.191 4 ～1.295 1 之間,平均值為0.579 4,其中,InDel-36 標記Shannon 指數最低。PIC 介于0.090 7 ～0.674 6 之間,平均值為0.349 6,其變化趨勢與Shannon 指數一致,其中InDel-28 標記PIC 最高,而InDel-36 標記的PIC最低。

14 個InDel 標記中有3 個標記位于基因編碼區(qū)域,其中重要的2 個標記:InDel-04 標記與CCCH 型鋅指蛋白轉錄因子有關,InDel-11 標記與bHLH 130 轉錄因子有關,這2 個基因均會影響到花生的抗逆性,標記可用于育種選擇。11 個InDel 標記位于基因的非編碼區(qū)域,其中InDel-23 和InDel-24 標記均與花生的抗葉銹病有關;InDel-28、InDel-29、InDel-36 標記分別影響細胞色素P450、驅動蛋白NACK1 以及半乳糖醛酸轉移酶的功能。

綜上,開發(fā)的14 個InDel 標記可用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、農藝性狀的QTL 定位和育種性狀選擇。

表3 基于14 個InDel 標記的多態(tài)性信息Table 3 The polymorphism information based on 14 InDel markers

3 討論

DNA 分子標記多態(tài)性水平的高低通常作為評估其應用潛力的標準之一。本研究成功檢測到14 對具備多態(tài)性的InDel 引物,多態(tài)率達35.9%,PIC 介于0.090 7～0.674 6 之間。王亮等[24]從225 對AFLP 引物中篩選出42 對多態(tài)性引物,多態(tài)率為18.6%;劉陽杰等[25]用12 對SSR 引物與48 對InDel 引物擴增77份美國花生種質,分別獲得4 對多態(tài)性SSR 引物(多態(tài)率33.3%)和15 對多態(tài)性InDel 引物(多態(tài)率31.3%);Vishwakarma 等[21]利用4 份不同植物學類型的花生種質對214 個InDel 標記進行多態(tài)性篩選,獲得86 個多態(tài)性標記,多態(tài)率達40.2%;Liu 等[26]從功能基因的保守序列中開發(fā)出48 個InDel 標記,對6 個不同植物學類型的118 份栽培種花生篩選,獲得16 個多態(tài)性InDel 標記,多態(tài)率為33.3%,且PIC 為0.017～0.660;Meng 等[27]利用4 個植物學類型的54 份花生種質對48 個InDel 引物進行篩選,其中24 對引物具有多態(tài)性,多態(tài)率高達50.0%,PIC 為0.036 4～0.903 0。上述研究的分子標記的多態(tài)率分布于18.6%～50.0%之間。通常評估分子標記的多態(tài)性水平的精確性與用于標記篩選的種質數量和種質之間的系譜差異有較大關系。與上述報道相比,本研究篩選獲得的InDel 標記處于中等多態(tài)性水平,可能是因為本研究僅選用了篩選的21 份花生種質。但本研究所選用種質材料覆蓋了4 種植物學類型和代表性種植區(qū)域,這種遺傳背景差異大的花生種質具有較強的代表性,由此篩選的InDel 標記能夠為花生種質遺傳多樣性分析提供重要參考。

目前,雖然已開發(fā)出大量的分子標記,但只有較少的重要性狀如抗線蟲病[28]和高油酸[29]等被應用到花生分子標記輔助育種進程中,還有較多如抗銹病、晚葉斑病以及青枯病[30-31]等重要性狀尚處于開發(fā)狀態(tài)。本研究篩選獲得的InDel 標記中有2 個重要標記位于基因的編碼區(qū)域:InDel-04 標記與CCCH 型鋅指蛋白的功能有關,該類型的鋅指蛋白不僅在植物發(fā)育與脅迫反應中起重要的調控作用,而且對次生壁的形成以及花藥的發(fā)育產生影響[32];InDel-11 標記與bHLH130 轉錄因子有關,該類型轉錄因子在植物的生長發(fā)育以及非生物脅迫響應方面至關重要。Guang等[33]研究發(fā)現棉花中bHLH130 基因表達受干旱、低溫的誘導,可能作為調控基因參與逆境應答過程。同樣,在花生的非編碼區(qū)中也獲得了多個重要標記,其中InDel-23 標記、InDel-24 標記分別與抗葉銹類Lr10 激酶、Lr10 抗病基因位點蛋白激酶受體有關,對植物的抗葉銹能力起到關鍵作用;標記InDeI-28 會影響花生中細胞色素P450 的合成,并且細胞色素P450 與植物的次生代謝的合成與解毒有著密切關系。有報道指出,在除草劑苯達松及甲磺隆誘導下,與細胞色素P450 合成相關的CYP81A6 基因會過量表達[34]。綜上,本研究篩選獲得的14 個InDel 標記,尤其是位于基因編碼區(qū)的InDel-04、InDel-11 標記,可為后續(xù)的功能標記開發(fā)提供重要參考。InDel 標記作為一種較新的遺傳標記,其相關的生物學功能和意義需要逐漸探索與挖掘,并通過進一步的驗證分析,使其能夠盡早應用到分子標記輔助育種進程中。

4 結論

本研究成功篩選得到14 個多態(tài)性InDel 標記,這些標記具有較高的遺傳多樣性。其中3 個多態(tài)性標記位于基因編碼區(qū),尤其是InDel-04、InDel-11 標記均與花生抗逆性相關,且在基因的非編碼區(qū)同樣發(fā)現了多個標記與花生重要性狀相關。本研究不僅豐富了用于栽培種花生的InDel 標記,而且這些InDel 標記可為后續(xù)功能驗證以及進一步開展栽培種花生種質資源鑒定提供有效工具。但這些標記尚需通過實時熒光定量PCR 檢測(real-time fluorescence quantitative PCR)和基因編輯等分子生物學技術進行進一步的功能鑒定和驗證。