一種可止血的富血小板血漿殼聚糖/絲素蛋白多孔傷口敷料的制備及性能表征

韓玎玎，賀曾，鐘銳，張學俊，王紅

·組織工程與細胞培養(yǎng)·

一種可止血的富血小板血漿殼聚糖/絲素蛋白多孔傷口敷料的制備及性能表征

韓玎玎，賀曾，鐘銳，張學俊，王紅

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 輸血研究所，四川 成都 610052

為了進一步提高傷口敷料的止血性能，文中在生物相容性良好的殼聚糖溶液中引入含有多種生長因子的人源性富血小板血漿 (Human platelet-rich plasma，hPRP)，并加入不同體積比例 (1∶1、1∶3、3∶1、1∶0) 的絲素蛋白溶液以提高材料的多孔性與止血性，通過冷凍干燥法制備不同配比的hPRP-殼聚糖/絲素蛋白敷料，并將純殼聚糖敷料作為對照組，研究hPRP和絲素蛋白對敷料的止血性能的影響以及絲素蛋白對PRP中生長因子控制釋放的影響。結(jié)果表明，在殼聚糖敷料中引入hPRP對敷料的止血性有所提高，但對敷料的多孔結(jié)構(gòu)及吸水率無明顯改善，若在hPRP-殼聚糖溶液中按照體積比為1∶1的比例加入絲素蛋白溶液，會得到具有較為均勻的多孔結(jié)構(gòu)的敷料，敷料的孔隙率與吸水率分別可達到86.83%±3.84%與1 474%±114%，且該比例的敷料在快速止血性能上表現(xiàn)優(yōu)異。此外，加入絲素蛋白與殼聚糖比例為1∶1的PRP敷料能有效減少PRP中生長因子在初始階段的爆裂釋放。因此，含hPRP的殼聚糖/絲素蛋白復合敷料有望成為一種能快速止血且能促進傷口愈合的新型傷口敷料。

富血小板血漿，殼聚糖，絲素蛋白，止血性，生長因子

殼聚糖是一種具有良好的生物相容性的天然材料，被廣泛用于制備傷口止血敷料，但單一的殼聚糖敷料在力學性能與吸濕性能上表現(xiàn)出了一定的局限性[1]，因此復合殼聚糖敷料成為了新的研究熱點。血小板作為血液三大成分之一，含有多種生長因子，例如IGF-1 (Insulin-like growth factor-1，促生長因子)、PDGF-BB (Platelet derived growth factor-BB，血小板衍生因子-BB)、VEGF (Vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長因子) 等，研究發(fā)現(xiàn)這些生長因子對于傷口的止血性與愈合性有極為重要的作用。近年來，有文獻報道將人源性PRP引入到殼聚糖中制備PRP-殼聚糖復合材料從而提高敷料的止血性與促傷口愈合性[2-3]，但PRP-殼聚糖傷口敷料也存在一定問題，例如與創(chuàng)面的貼合性較差、PRP中的生長因子的釋放速度太快從而失去活性過快導致敷料后期的促傷口愈合與抗菌性受到一定限制[4-5]，所以研究者通過制備殼聚糖與其他物質(zhì)的復合基材來提高敷料性能并控制PRP中的生長因子釋放速度，以保證PRP中的生長因子可持續(xù)釋放并保持其活性，提高傷口愈合性能。

蠶絲是人類最早利用的天然纖維之一，具有良好的生物相容性、較小的炎癥反應、遇水柔軟且較強的透氧滲水性[6]，再加上有研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白度具有調(diào)控生長因子釋放的作用[7]，這些特點使絲素蛋白成為醫(yī)用敷料的研究熱點之一，但單一絲素蛋白材料穩(wěn)定性差、止血效果不理想[8]，因此研究者將絲素蛋白與其他材料復合后克服這些缺點，比如由絲素蛋白與聚丙交酯乙交酯 (Poly(lactic-co-glycolic) acid，PLGA) (1∶2)的混合膜可作為慢性傷口止血材料[9]。本研究首次將絲素蛋白加入到hPRP-殼聚糖敷料中，通過調(diào)節(jié)絲蛋白溶液的混合比例來提高hPRP-殼聚糖材料的多孔結(jié)構(gòu)、吸濕性、止血性，并實現(xiàn)生長因子釋放的調(diào)控，制備得到新型的hPRP-殼聚糖/絲蛋白醫(yī)用敷料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

殼聚糖 (低分子量級)購于美國ALDRICH公司；蠶繭購于杭州潤蚨蠶絲制品有限公司；冰醋酸 (分析純級)購于科龍化工有限公司；氯化鈣 (分析純級)與無水乙醇 (分析純級)購于西隴化工有限公司；戊巴比妥鈉購于美國Sigma公司；SPF級雄性SD大鼠15只，體重220–250 g，實驗動物由四川省實驗動物專業(yè)委員會養(yǎng)殖場 (許可證號：SCXK[川]2015-030)提供，在中國醫(yī)學科學院輸血研究所動物實驗室進行飼養(yǎng)及實驗，實驗符合動物倫理學要求。

1.1.2 儀器

全自動血細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號BC-3000)、磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司，型號DH-101S)、真空冷凍干燥機(德國Christ公司，型號ALPHAl-4 LSC plus)、掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司，型號Quanta 250)、電子天平 (常熟市雙杰測試儀器廠，型號JJ223BC)、酶標儀 (美國Biotek公司，型號：Eon)、離心機 (美國Thermo Scientific公司，型號：SORVALL)。

1.2 方法

1.2.1 PRP的制備與活化

濃縮血小板由德陽血站提供符合國家獻血標準的健康獻血者，按《血站技術(shù)操作規(guī)程》[10]采集全血400 mL，采用富血小板血漿法制備濃縮血小板 (PC，每袋60–70 mL)，質(zhì)量均符合《全血及成分血質(zhì)量要求》(GB 18469-2012)[11]。每例PC取20 mL在3 000 r/min條件下離心10 min，取上層清液作為貧血小板血漿 (PPP)，根據(jù)全自動細胞計數(shù)儀測定的結(jié)果將PC用PPP調(diào)節(jié)至血小板濃度為500×109個/L，制備得到富血小板血漿 (PRP)。將0.1 mol/L的CaCl2溶液按照1∶10 (/) 的比例加入到PRP中，激活PRP。

1.2.2 絲素蛋白溶液的制備

將0.5% Na2CO3溶液煮沸后，將蠶繭按質(zhì)量體積比1∶50 (g∶mL) 放入0.5% Na2CO3溶液中，煮沸30 min，重復2次后用去離子水將脫膠后的蠶絲沖洗3次，放入37 ℃烘箱烘干。準確稱取烘干后的蠶絲4 g，將稱取的蠶絲撕碎后逐步加入到100 mL三元溶劑 (CaCl2∶H2O∶C2H5OH的摩爾比為1∶8∶2)，整個過程要控溫在75 ℃的條件下進行，直至蠶絲完全溶解后冷卻至室溫。將冷卻后的蛋白溶液倒入預處理過的透析袋 (截留分子量8–14 kDa)，用去離子水透析3 d后，收集透析袋中的全部溶液后用紗布濾去殘渣后，放入試劑瓶中，在4 ℃條件下保存。

1.2.3 hPRP-殼聚糖/絲素蛋白多孔敷料的制備

將殼聚糖溶解在2%的醋酸溶液中，制成濃度為4%的殼聚糖-乙酸溶液，整個過程不斷攪拌，待完全溶解后，在4 ℃條件下保存。將殼聚糖溶液與絲蛋白溶液按不同體積比例 (比例分別是1∶1、3∶1、1∶3、1∶0) 混勻后，加入混合液體積比10%的PRP到混合液中(分別記作PRP/CS-SK-1∶1、PRP/CS-SK-3∶1、PRP/CS-SK- 1∶3、PRP/CS-SK-1∶0)，超聲脫氣20 min后，放入4 ℃靜置至無明顯氣泡。將無氣泡的溶液加入到24孔板中，制備直徑大小一致的敷料。將孔板放入到?70 ℃冰箱凍結(jié)12 h后再放入冷凍干燥儀中凍干36 h，制備得到多孔PRP/殼聚糖-絲素蛋白敷料。另將4%殼聚糖溶液單獨作為原液，按照上述方法冷凍干燥后得到純殼聚糖敷料，記作CS，作為對照組。

1.2.4 孔隙率測定

在量筒中加入一定體積的無水乙醇，體積記為1，將直徑為1.2 cm、厚度為1 cm的敷料投入其中，靜置5 min，使敷料被無水乙醇完全浸透且表面無明顯氣泡，此時的總體積記為2；取出支架，量筒中剩余的無水乙醇體積記為3。敷料的孔隙率%按下列公式計算：%=(1–3)/ (2–3)×100%[12]，每組樣本平行測試3次，取平均值。

1.2.5 吸水膨脹率測定

將敷料切成合適的大小，使每個敷料的重量均在40 mg左右，稱質(zhì)量記為0，浸沒在37 ℃的0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 中1 h，取出后稱質(zhì)量，記為1，吸水率%就按下列公式計算：%= (1–0)/0×100%[12]，每組樣本平行測試3次，取平均值。

1.2.6 掃描電鏡 (SEM) 分析

將敷料切成約1 cm×1 cm，厚約5 mm，橫截面朝上，用導電雙面膠將敷料粘在金屬托架上，噴金后在20 kV的加速電壓下觀察支架結(jié)構(gòu)。

1.2.7 體外全血凝血測定

抽取新鮮抗凝全血5 mL，加入0.5 mL的 0.1 mol/L氯化鈣溶液，充分混勻備用。每組取 5個樣品，將樣品剪成規(guī)格為1.5 cm×1.5 cm，厚度為1 cm后，分別放入不同試管中，于37 ℃保溫。取已準備好的抗凝人全血1 mL加入試管，使敷料充分浸潤血液，將試管放入恒溫37 ℃搖床振蕩，每組的5個樣品分別于1 min、2 min、5 min、10 min和15 min從恒溫搖床取出后放入新的試管，向新試管中加入10 mL去離子水并保持 5 min，將敷料中未凝固的紅細胞洗出來，最后收集試管中的洗液，用分光光度計測定洗液吸光度 (波長=540 nm)。每組樣品每個觀測點設(shè)置3個平行樣。

1.2.8 生長因子釋放測定

將含有PRP的4組敷料 (1 cm×1 cm，厚約 5 mm) 浸泡在無水乙醇中30 min，用PBS溶液 (pH 7.4) 沖洗3次后將敷料孵育在1 mL PBS溶液 (pH 7.4，含有0.1%疊氮化鈉) 中，孵育過程保持37 ℃恒溫，在1 h、3 h、5 h、7 h、24 h、72 h、168 h時間點取出PBS溶液，并在?20 ℃中凍存，等孵育結(jié)束后用ELISA試劑盒檢測PDGF-BB與VEGF的含量。

1.2.9 大鼠體內(nèi)止血測定

取15只SD大鼠，隨機分成5組，每組3只，大鼠體重控制在220–250 g。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺后，腹腔注入2%戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)。待大鼠麻醉后，于腹部中部處做一個3 cm橫向切口，暴露胸腹壁淺靜脈并剪斷，自由流血3 s后將已稱重的敷料 (重量記作1)覆蓋于傷口處并輕輕按壓，同時開始計時，前30 s每10 s觀察 1次創(chuàng)面出血情況，后30 s后每5 s觀察1次創(chuàng)面出現(xiàn)情況，并記錄止血時間，傷口停止出血后精確稱量各組敷料重量 (重量記作2)，并計算出血量，出血量=1–2。

1.2.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 敷料的孔隙分析

敷料表面的微結(jié)構(gòu) (如孔隙率、孔隙分布等)會影響材料吸收傷口血量[13]以及PRP中生長因子的釋放速度[14]。從表1中可以看出CS組的孔隙率最低，在CS敷料中引入PRP后對敷料的孔隙率無明顯提高。加入絲素蛋白后，敷料的孔隙率有顯著增加，PRP/CS-SK-1∶1組敷料的孔隙率最高，約為86%。從SEM圖 (圖1) 中也可看出，未加入絲蛋白的兩組，CS組與PRP/CS-SK-1∶0組 (圖1A與圖1E) 的孔隙表現(xiàn)雖有序均勻，但孔徑分布不均勻。在敷料中加入絲素蛋白后，當殼聚糖與絲素蛋白的體積配比為1∶3時 (圖1D)，敷料的孔隙表現(xiàn)不連貫，孔結(jié)構(gòu)塌陷，這種孔隙會導致敷料蓬松易碎，但調(diào)節(jié)兩者的體積配比為1∶1后 (圖1C)，孔隙分布有序，結(jié)構(gòu)緊密，具有此類孔結(jié)構(gòu)的敷料的韌性會更高，同時有利于物理堵塞創(chuàng)傷口，促進止血，這可能是因為在支架中絲素蛋白的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)以無定型結(jié)構(gòu)為主，在冷凍過程中，絲素蛋白溶液中絲素分子會自組裝成片層，會在一定程度上影響孔隙結(jié)構(gòu)，與殼聚糖復合后，殼聚糖與絲素蛋白發(fā)生了分子間的相互作用，促進絲素蛋白結(jié)構(gòu)由無定型結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使復合材料的孔結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[15]。

2.2 敷料吸水性能分析

敷料的吸水性能與支架的親水性緊密相關(guān)，屬于止血材料的物理特性之一。當材料按壓在傷口上時，吸水性強的材料會吸收血液中的水分，導致血液黏度增加從而促進血小板聚集，實現(xiàn)血液凝固。表2結(jié)果說明不同配比制備的敷料在吸水率上表現(xiàn)出較為明顯的不同。CS組敷料與PRP/CS-SK-1∶0組敷料相比，吸水率無明顯變化，說明只引入PRP對敷料的吸水性無明顯影響。在敷料中添加絲素蛋白后，敷料的吸水率提高，其中絲素蛋白溶液體積比越高，敷料吸水率越高，這可能是絲素蛋白中含有賴氨酸、組氨酸和精氨酸等含有親水性基團的側(cè)鏈氨基酸殘基[16]，因此加入絲素蛋白會提高敷料的吸水性能。其次根據(jù)孔隙分布結(jié)果知道，絲素蛋白的加入會提高敷料的孔隙率，使材料有更多的孔去吸收儲存水分，從而提高材料的吸水能力。

表1 不同敷料的孔隙率測定結(jié)果

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圖1 敷料電鏡圖(A: PRP/CS-SK-1∶0敷料；B:PRP/CS-SK-3∶1敷料；C: PRP/CS-SK-1∶1敷料；D: PRP/CS-SK-1∶3敷料；E: CS敷料)

2.3 敷料體外全血凝固分析

圖2結(jié)果中縱坐標為血紅蛋白的紫外吸光度值，吸光度越高，說明去離子水洗出來未凝固的紅細胞數(shù)越多，相應的材料的凝血效果越差。在止血初期 (前2 min)，PRP/CS-SK-1∶0與CS組的吸光度值差異不明顯，說明兩種材料的快速止血效果表現(xiàn)相近，但材料處理5 min后只引入了PRP的殼聚糖敷料的吸光度值明顯低于CS組，說明引入了PRP的敷料開始表現(xiàn)出更好的凝固性，這可能是因為在止血初始階段，兩組敷料對血液中的水分吸收速度表現(xiàn)相似，從而導致紅細胞發(fā)生凝塊速度相似，使兩組敷料在止血初期表現(xiàn)出相似的凝固效果，但在后期PRP中高濃度的凝血因子促進了敷料的全血凝固能力[17]。在敷料中添加絲素蛋白后，敷料的吸光度值明顯低于未加入絲素蛋白的兩組，說明加入絲素蛋白后會進一步提高敷料的凝血性，并且由圖中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當殼聚糖與絲素蛋白配比為1∶1時，敷料在各個時間點的吸光度值均為最低，表明敷料的凝血性最好，并且在15 min內(nèi)血液幾乎全部凝固，這是因為絲素蛋白的引入會提高敷料吸水性，敷料吸收血液中的水分后使血液變得黏稠，紅細胞發(fā)生凝塊，從而實現(xiàn)凝血效果。

2.4 體內(nèi)止血效果

本試驗采用大鼠胸腹壁淺靜脈模型觀察敷料體內(nèi)止血情況。5組敷料的出血組織黏附性均表現(xiàn)好，敷料遇血液后，迅速吸血并變?nèi)彳?。由?結(jié)果得知加入PRP的敷料組的止血時間與止血量均小于CS組，說明加入PRP會提高止血效果，盡管加入PRP不會對敷料的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，但由于PRP是全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，與普通血小板相比，其凝血因子的濃度增加，使凝血酶原時間和凝血活酶時間縮短，減少失血量。加入絲素蛋白后，敷料的止血時間進一步縮短，失血量進一步減少且與CS組相比均具有統(tǒng)計學差異，這與體外全血凝固時間試驗結(jié)果基本一致，其中PRP/CS-SK-1∶1組止血用時最短，僅需48 s，失血量最少。

表2 殼聚糖與絲素蛋白不同比例的敷料吸水率測定結(jié)果

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圖2 不同敷料的體外全血凝固結(jié)果

2.5 敷料生長因子釋放

PRP是一種高成本的生物制品，因此需要基材促使PRP中的生長因子實現(xiàn)持續(xù)性釋放，提高釋放效率。圖3與圖4顯示PDGF-BB以及VEGF從負載了PRP的4組敷料中的釋放結(jié)果。對于PDGF-BB因子的釋放控制，PRP/CS-SK-1∶1組表現(xiàn)最佳，并在72 h實現(xiàn)持續(xù)性釋放。其余3組對PDGF-BB因子的釋放均顯示出了較為明顯的爆裂釋放，PRP/CS-SK-1∶0組、PRP/CS-SK-1∶3與PRP/CS-SK-3∶1這3組敷料在7 h的釋放量就分別達到了528 pg/mL、554 pg/mL與601 pg/mL (3組釋放量無顯著統(tǒng)計學差異)，而PRP/CS- SK-1∶1組僅為426 pg/mL。對于VEGF因子的釋放控制，在釋放7 h時，PRP/CS-SK-1∶0組的釋放量已達到266 pg/mL，而PRP/CS-SK-1∶1組最低，僅為210 pg/mL，但與其余3組無顯著性差異。這可能是因為生長因子的釋放情況與材料的結(jié)構(gòu)、表面電性及生長因子與材料間的疏水作用等多個因素有關(guān)。PRP/CS-SK-1∶1組敷料的爆裂釋放情況的減弱可能是因為此體積配比的敷料孔隙緊密，更緊密的孔結(jié)構(gòu)會減少孔徑大小，造成更長的擴散通道，從而減少釋放速度與爆裂現(xiàn) 象[18]。此外，材料的表面電性會影響生長因子的釋放速度，生長因子與材料之間的靜電跨度越小，初始的爆裂釋放情況越不顯著[19]。本研究中絲素蛋白的引入可能會改變敷料表面電性，殼聚糖在pH 7.4的PBS中帶正電，絲素蛋白在此條件下帶負電[20]，而VEGF與PDGF-BB兩種生長因子在pH 7.4的環(huán)境下等電點 (pI) 分別為8.5與9.8，均為正電，由此推測絲素蛋白的引入可能會導致敷料正電荷的減少；此外兩種生長因子的多肽結(jié)構(gòu)有差別，與同一種敷料間的疏水作用也可能不同，從而導致不同敷料的生長因子的初始爆裂釋放情況的不同以及兩種生長因子在同一種敷料中出現(xiàn)了不一樣的釋放規(guī)律。本課題組會在后續(xù)的研究中進一步驗證上述推測，并會從體外細胞培養(yǎng)和動物實驗等多方面考察絲素蛋白的引入對負載PRP的殼聚糖敷料中生長因子釋放的影響以及在促傷口愈合作用上的影響，從而篩選出能夠同時實現(xiàn)快速止血與有效促傷口愈合的新型敷料。

表3 不同敷料的止血時間與失血量測定結(jié)果

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圖3 不同敷料的PDGF-BB的釋放動力學結(jié)果

圖4 不同敷料的VEGF釋放動力學結(jié)果

本研究制備的新型敷料主要包括殼聚糖、絲素蛋白與人源性富血小板血漿3種原料，通過傳統(tǒng)且操作簡單的凍干燥法制備得到。該敷料中的殼聚糖與絲素蛋白是目前生物敷料中最為常見的原料之一，易獲取成本低，且國內(nèi)外已有大量文獻對如何制備這兩種原料的溶液進行了描述。同時，文中的新型敷料是利用從血液中心獲取的健康獻血者的全血來制備得到的同種異體富血小板血漿，而非從患者自身提取的自體富血小板血漿。與自體PRP相比，利用從已檢查合格的全血中提取的同種異體PRP進行治療不會受患者自身情況的限制 (例如，若患者為糖尿病創(chuàng)面患者是不適合作為供血者的)，同時可降低治療時間成本。但人源性的PRP仍然屬于高成本的生物制品之一，這樣的高成本不僅在于人全血的珍貴性也在于實現(xiàn)標準化制備異體PRP的困難性，目前已有團隊開始探討如何建立同種異體PRP制備的標準化流程[21]。因此本研究通過引入絲素蛋白來實現(xiàn)PRP中生長因子的可持續(xù)性釋放，提高該敷料的治療有效性，并且通過上述試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)體積比例為1∶1的PRP-殼聚糖/絲素蛋白敷料能表現(xiàn)出較好的快速止血能力，有望應用于戰(zhàn)場或災難急救現(xiàn)場。

3 結(jié)論

在純殼聚糖敷料中加入PRP后雖不會明顯改善敷料的孔隙結(jié)構(gòu)與吸水性，但體外全血凝血實驗與大鼠體內(nèi)止血實驗結(jié)果均顯示會提高殼聚糖敷料的止血性能。在PRP殼聚糖敷料中繼續(xù)引入絲素蛋白，并且在殼聚糖溶液與絲素蛋白溶液的體積配比為1∶1時，敷料具有致密的孔隙結(jié)構(gòu)與較高的吸水性，體外全血凝血實驗與大鼠體內(nèi)止血實驗也證明此比例敷料與其余幾組敷料相比，具有更好的止血性。同時，殼聚糖與絲素蛋白體積配比1∶1的敷料中對PDGF-BB的調(diào)控作用較為明顯，但對VEGF因子爆裂釋放的減少雖是 4組中最大的，但與其余3組差異性不明顯。因此，本試驗構(gòu)建的PRP/CS-SK-1∶1敷料無論在止血性能還是對生長因子釋放控制方面均具有一定的潛力，有望在體表或體內(nèi)慢性傷口敷料領(lǐng)域得到廣泛應用。

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Preparation and characterization of a hemostatic porous platelet-rich plasma chitosan/silk fibroin wound dressing

Dingding Han, Zeng He, Rui Zhong, Xuejun Zhang, and Hong Wang

,,,610052,,

In order to further improve the hemostatic performance of wound dressings, human platelet-rich plasma (PRP) containing various growth factors was introduced into chitosan solution. The silk fibroin solutions with different volume ratios (1:1, 1:3, 3:1 and 1:0) were added to improve the porosity and hemostasis of materials. The hPRP-chitosan/silk wound dressings with different ratios was prepared by freeze-drying and pure chitosan dressing was considered as the control group to study the effects of PRP and silk fibroin in different proportions on the hemostasis properties and the growth factors burst release. The hemostasis of chitosan dressing was improved by introducing PRP, but the porous structure and water absorption were not significantly improved. If silk fibroin solution was added in the ratio of 1:1, the more uniform porous structure and better hemostatic performance could be obtained. The porosity and water absorption could reach 86.83%±3.84% and 1 474%±114% respectively. In addition, the dressings with ratio of 1:1 had positive effects on reducing the burst release of growth factors on initial stage. Therefore, PRP-chitosan/silk fibroin composite dressing can become a kind of wound dressing that can achieve rapid hemostasis and promote wound healing.

platelet-rich plasma, chitosan, silk fibroin, hemostasis, growth factor

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May 13, 2019;

August 13, 2019

Supported by: CAMSInnovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (No. 2016-I2M-1-018),CAMSInnovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (No. 2017-I2M-3-021).

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10.13345/j.cjb.190190

(本文責編 郝麗芳)