苜蓿根腐病菌(Fusarium solani )的LAMP快速檢測(cè)方法

蘭成忠,阮宏春,甘 林,代玉立,盧學(xué)松

(福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,福建 福州 350013)

苜蓿(Medicagosativa)是世界和我國(guó)最主要的優(yōu)良豆科牧草之一,被譽(yù)為“牧草之王”。目前苜蓿栽培面積已占我國(guó)多年生牧草面積的30%以上,占全部牧草面積的25%[1]。根腐病是苜蓿生產(chǎn)上一種毀滅性的病害,常導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降。隨著苜蓿新品種的不斷引進(jìn),栽培技術(shù)、水肥水平的不斷提高,苜蓿根腐病的發(fā)生也日趨嚴(yán)重,田間發(fā)病率一般達(dá)5%～7%,重病地達(dá)15%～21%,更嚴(yán)重的發(fā)病率達(dá)92%,嚴(yán)重影響了苜蓿的廣泛應(yīng)用,給苜蓿生產(chǎn)構(gòu)成了一定的威脅,成為限制苜蓿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一[2-4]。

引起苜蓿根腐病的病原菌大致有以下幾種:苜蓿疫霉菌(Phytophthoramegasperma)、鐮刀菌屬真菌(Fusariumspp.)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和腐霉屬卵菌(Pythoumspp.)等[4],其中茄鐮刀菌(Fusariumsolani)為優(yōu)勢(shì)病原菌之一[5]。病原菌的準(zhǔn)確鑒定與檢測(cè)是病害防控的基礎(chǔ),研究人員通常依據(jù)病原菌所致的癥狀和菌物形態(tài)特征對(duì)苜蓿根腐病原菌進(jìn)行鑒定和檢測(cè)[6-7],這種應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒定不僅困難且耗時(shí)費(fèi)力,不能滿足病害快速準(zhǔn)確鑒定、診斷的需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,常規(guī)PCR技術(shù)被成功地應(yīng)用于苜蓿根腐病菌的準(zhǔn)確鑒定和快速檢測(cè)中[8]。PCR技術(shù)雖然提升了病原菌鑒定的準(zhǔn)確性和檢測(cè)的快速性,但仍存在需要依賴精密的PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備和操作繁瑣等問(wèn)題。因此,很有必要建立新的檢測(cè)技術(shù)以期實(shí)現(xiàn)對(duì)苜蓿根腐病菌的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)技術(shù)是由日本榮研公司開發(fā)的一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及廉價(jià)的核酸高效擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)可在60～65 ℃恒溫條件下,利用高活性的鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增,在1 h內(nèi)即可觀察結(jié)果[9]。LAMP技術(shù)具有特異性強(qiáng)、設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于多種病原菌檢測(cè)中[10-12]。截至目前,關(guān)于苜蓿根腐病菌的LAMP檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究基于LAMP技術(shù)建立了苜蓿根腐病菌(F.solani)檢測(cè)體系,并對(duì)該體系的特異性、靈敏度及實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)行了一系列的研究,以期為苜蓿根腐病的準(zhǔn)確診斷和及時(shí)防治提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株包括苜蓿根腐病菌(F.solani,茄鐮刀菌)及其近緣種、其它植物病原真菌和卵菌，菌株的名稱和來(lái)源等信息詳見表1。供試紫花苜蓿品種為阿爾岡金,由西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

表1 供試的病原菌菌株

1.2 菌株培養(yǎng)及DNA提取

將供試的鐮刀菌和其它真菌培養(yǎng)于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)平板上,于25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后刮取平板上的菌絲,經(jīng)冷凍抽干研磨成菌絲粉,保存于-20 ℃?zhèn)溆?。將供試疫霉菌培養(yǎng)于CA(胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基)平板中,于25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后,從菌落邊緣切取大小約為3 mm×3 mm的菌絲塊，轉(zhuǎn)移至胡蘿卜液體培養(yǎng)基中,于25 ℃、180 r/min、黑暗條件下培養(yǎng)7 d,用雙層紗布過(guò)濾收集菌絲,經(jīng)冷凍抽干研磨成菌絲粉,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參照Murray和Thompson的方法[13],采用CTAB方法提取供試菌株基因組DNA,具體步驟如下:取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中(菌絲粉剛蓋過(guò)半圓形底部為宜),加入900 μL 2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0;20 mmol/L EDTA, pH8.0;1.4 mol/L NaCl)和90 μL SDS(十二烷基苯磺酸鈉)(CTAB和SDS需在60 ℃下預(yù)熱),使用振蕩器振蕩混勻,于60 ℃水浴1 h，使DNA釋放至緩沖液中，再以12000 r/min離心15 min;取上清液700 μL,加等體積酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1),輕輕振蕩混勻,以12000 r/min離心9 min;取上清液500 μL,加入等體積氯仿再抽提1次,以12000 r/min離心5 min;取上清液350 μL,加入1/10體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇,在-20 ℃下沉淀30 min,以12000 r/min離心5 min;棄去上清液,加入700 μL冰的70%乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心;傾掉上清液),在超凈工作臺(tái)上晾干至無(wú)酒精味,加入30～60 μL TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)進(jìn)行溶解,得到DNA溶液,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度，并稀釋至100 ng/μL待用。

1.3 引物設(shè)計(jì)與篩選

應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)苜蓿根腐病菌(F.solani)的TEF-1α基因序列(GenBank No: MN602077)和其它鐮刀菌(Fusariumspp.)的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。選取F.solani種內(nèi)不同來(lái)源菌株間序列高度保守，并與其它種鐮刀菌差異較大的區(qū)段,利用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer software Explorer V5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì),所設(shè)計(jì)的多組引物經(jīng)特異性和靈敏度試驗(yàn)篩選,獲得1組對(duì)F.solani具有種的特異性且靈敏度高的LAMP引物,該引物在TEF-1α基因序列中的位點(diǎn)和序列見圖1和表2。該引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,用ddH2O溶解后分裝,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 LAMP引物在TEF-1α序列中的位點(diǎn)

表2 用于FusariumsolaniLAMP檢測(cè)的引物

引物名稱序列(5′-3′)F35′-ACCGGTCACTTGATCTACCA-3′B35′-GGGTAAATGCCCCACCAA-3′FIP5′-AATAGCAAGGCGCGATCGGG-CAAGCGAACCATCGAGAAGT-3′BIP5′-CGTCGAATTCCCTCCCTCGC-ATTACGGTCGGACCGCAA-3′

1.4 LAMP反應(yīng)體系

LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系為25 μL,包括5 μmol/L外引物F3和B3各1.0 μL、40 μmol/L內(nèi)引物FIP和BIP各1.0 μL、LAMP反應(yīng)混合液[40 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L (NH4)2SO4、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)、2.0 mmol/L dNTPs、0.2% Trion X-100]12.5 μL、8 UBst聚合酶1.0 μL、DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25 μL;以熒光染料SYBR green Ⅰ為顯色指示劑,于反應(yīng)前在PCR管內(nèi)蓋上加入1.0 μL SYBR green Ⅰ,然后輕輕地蓋上PCR管蓋。LAMP反應(yīng)條件:64 ℃溫育60 min;采用熒光染料目測(cè)觀察法判定反應(yīng)結(jié)果,待LAMP反應(yīng)結(jié)束后,瞬時(shí)離心PCR管，將染料與LAMP反應(yīng)液混勻后觀察顏色變化,避免因開蓋檢測(cè)而導(dǎo)致的氣溶膠污染。若反應(yīng)管中有目的DNA擴(kuò)增,則反應(yīng)液顏色呈現(xiàn)綠色,反之為橙色。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.5 LAMP檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證

取2.0 μL不同地區(qū)來(lái)源的苜蓿根腐病菌(F.solani)DNA作為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng),以ddH2O替代目標(biāo)菌的DNA模板為陰性對(duì)照。同時(shí)分別取2.0 μL其它供試菌株的DNA為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng),以苜蓿根腐病菌(F.solani)DNA為陽(yáng)性對(duì)照。以反應(yīng)后溶液顏色的變化對(duì)LAMP的特異性進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 LAMP檢測(cè)體系的靈敏度驗(yàn)證

用ddH2O將已知濃度的苜蓿根腐病菌(F.solani)基因組DNA進(jìn)行稀釋,配制成10倍數(shù)量級(jí)的系列濃度(1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL和10 ag/μL),備用;分別取2.0 μL不同濃度的DNA作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)后溶液顏色的變化對(duì)LAMP的靈敏度進(jìn)行判斷。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 人工接種發(fā)病組織中苜蓿根腐病菌(F. solani)的LAMP檢測(cè)

參照郭玉霞等[14]的方法將供試紫花苜蓿種子催芽后播種于裝有滅菌土壤的花盆(高9.0 cm,底徑7.5 cm,口徑11.0 cm)中,待苜蓿苗長(zhǎng)至約5 cm高時(shí),按辛寶寶等[15]的方法將供試苜蓿根腐病菌接種于苜蓿苗上。將已接種的苜蓿苗置于(28±3)℃溫室中,每天澆兩次水,保持土壤濕潤(rùn)。7 d后,分別取接種發(fā)病和空白對(duì)照的苜蓿根部組織,按照DNA secure Plant Kit(Tiangen)說(shuō)明書提取DNA,將其作為模板用于LAMP擴(kuò)增。以從苜蓿根腐病菌(F.solani)純培養(yǎng)菌絲提取的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以ddH2O作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)溶液顏色變化判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿根腐病菌(F. solani)LAMP檢測(cè)的特異性

LAMP對(duì)供試菌株的特異性驗(yàn)證結(jié)果顯示,只有苜蓿根腐病菌(F.solani)反應(yīng)管中溶液呈現(xiàn)綠色,其余鐮刀菌、真菌、卵菌和空白對(duì)照的反應(yīng)液的顏色均保持不變,為橙色(圖2),表明所建立的LAMP能對(duì)F.solani的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,而不能使其余菌株發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng),因此LAMP檢測(cè)體系可以將苜蓿根腐病菌與其它病原菌區(qū)分開來(lái),具有種的特異性。

1～3:苜蓿根腐病菌。4～5:非苜蓿根腐病菌。6:空白對(duì)照。圖2 LAMP方法的特異性檢測(cè)結(jié)果

2.2 LAMP檢測(cè)的靈敏度

LAMP擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明,濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL的苜蓿根腐病菌基因組DNA顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光,其余濃度及陰性對(duì)照顯色結(jié)果為橙色,說(shuō)明所設(shè)計(jì)的苜蓿根腐病菌外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP通過(guò)了LAMP擴(kuò)增,對(duì)苜蓿根腐病菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 fg/μL(圖3)。

2.3 人工接種發(fā)病苜蓿根部組織中F. solani的LAMP檢測(cè)

提取接種苜蓿根腐病菌7 d后發(fā)病的苜蓿根部組織DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,結(jié)果顯示,所有發(fā)病的苜蓿根部組織DNA均通過(guò)了LAMP擴(kuò)增,顯色可觀察到綠色熒光；而空白對(duì)照的健康根部顯色結(jié)果為橙色(圖4)。表明所建立的LAMP檢測(cè)體系可用于苜蓿根腐病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定,同時(shí)還可直接用于苜蓿根腐病發(fā)病組織中病原菌的檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

根腐病是苜蓿生產(chǎn)上一種常見、易發(fā)和傳播迅速的重要土傳真菌病害[16]。因此,建立準(zhǔn)確、快速、高效的檢測(cè)方法,對(duì)阻止根腐病病原菌的傳播蔓延具有重要意義,是有效防控該病的基礎(chǔ)。

本研究以TEF-1α為靶標(biāo),建立了一種基于顏色判定的可快速、準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)苜蓿根腐病菌(F.solani)的LAMP技術(shù)體系。TEF-1α基因作為鐮刀菌PCR分子鑒定中的種特異性鑒定靶標(biāo),已被國(guó)內(nèi)研究人員廣泛地應(yīng)用于鐮刀菌的鑒定和快速分子檢測(cè)中[17]。因此,以該基因?yàn)榘袠?biāo)序列設(shè)計(jì)鐮刀菌的種特異性引物,可保證引物的高度特異性和廣泛通用性。

1～9：分別為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL。10:空白對(duì)照。

圖3 LAMP方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

1:陽(yáng)性對(duì)照。2:陰性對(duì)照。3、5、7:發(fā)病的根部組織。4、6、8:健康的根部組織。圖4 植物組織中根腐病菌的LAMP檢測(cè)結(jié)果

目前,檢測(cè)植物根腐病原鐮刀菌的主要步驟是從發(fā)病植物組織中分離菌株,利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征結(jié)合某些保守基因序列對(duì)分離物進(jìn)行鑒定[18]；另外,還有許多研究人員利用一些看家基因序列在鐮刀菌不同種之間的保守性,針對(duì)鐮刀菌不同種看家基因的特有位點(diǎn)設(shè)計(jì)種特異性引物并建立PCR檢測(cè)體系[19-20]。這些方法雖然存在耗時(shí)長(zhǎng)或需要特殊貴重儀器等缺點(diǎn),但在鐮刀菌鑒定和檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。與上述鐮刀菌鑒定和檢測(cè)方法相比,本研究所建立的LAMP檢測(cè)方法具有如下優(yōu)勢(shì):高效快捷,整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可于1 h內(nèi)完成,并可通過(guò)顏色對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化判斷;靈敏度高,對(duì)目標(biāo)病原菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 fg/μL,是常規(guī)PCR檢測(cè)體系檢測(cè)靈敏度的1000倍;運(yùn)行環(huán)境硬件條件低,不需要PCR儀、凝膠成像儀等貴重設(shè)備,僅用水浴鍋或加熱套等簡(jiǎn)單恒溫加熱設(shè)備即可;適用范圍更廣,可對(duì)發(fā)病植物組織中的病原菌進(jìn)行檢測(cè),可以克服植物組織中一些化學(xué)物質(zhì)對(duì)病原目標(biāo)DNA擴(kuò)增的抑制。本研究所建立的LAMP檢測(cè)方法可直接應(yīng)用于田間苜蓿根腐病菌的快速檢測(cè),適用于儀器設(shè)備簡(jiǎn)單的科研單位和基層農(nóng)技推廣部門使用,具有較廣闊的應(yīng)用前景。