可變剪切事件在胰腺癌中的發(fā)生及其臨床意義

帕成周，張貫啟，鄔善敏

可變剪切(alternative splicing，AS)又稱選擇性剪切，在mRAN前體到成熟mRNA的這一過程中，不同的剪切方式使得同一個基因可以產(chǎn)生多個不同的成熟mRNA，最終產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)[1]。AS包含7種選擇性剪切類型，即可變受體位點(diǎn)(AA)、可變供體位點(diǎn)(AD)、可變啟動子(AP)、可變終止子(AT)、外顯子跳躍(ES)、外顯子互斥(ME)、內(nèi)含子保留(RI)。

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)常見的首發(fā)癥狀為上腹部疼痛及不適，早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，容易忽略，就診率低。據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，2015年我國PAAD發(fā)病率位居惡性腫瘤第9位，死亡率位居惡性腫瘤第6位。PAAD現(xiàn)有治療手段有限，目前尚未明確發(fā)現(xiàn)PAAD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其相應(yīng)靶基因的作用。近年來研究表明[3-4]，AS事件常在癌癥中發(fā)生，可用于腫瘤靶向治療，且被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?，F(xiàn)分析AS事件在PAAD中的發(fā)生情況、臨床生存率及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便為臨床評估及深入研究提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集下載及篩選 自癌癥基因組圖譜(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/projects)下載并整理TCGA胰腺癌隊(duì)列的RNA-seq數(shù)據(jù)、臨床數(shù)據(jù)，獲取PAAD病例的臨床病理參數(shù)和預(yù)后資料，并提取剪接因子(splicing factor，SF)表達(dá)量。采用TCGA SpliceSeq工具(https://bioinformatics.mdanderson.org/TCGASpliceSeq/)進(jìn)行拼接百分比值(percent-splice-in值，PSI值)數(shù)據(jù)下載及提取可變剪切事件數(shù)據(jù)，探索與PAAD相關(guān)的AS事件的變化。

1.2 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用UpSetR包定量分析PAAD中7種AS類型之間的交集；對172例總生存期至少90 d的PAAD患者，采用單因素Cox分析篩選出與生存顯著相關(guān)的AS事件數(shù)據(jù)，定量分析PAAD中7種與生存相關(guān)的AS類型之間的交集，進(jìn)行與生存相關(guān)AS事件的亞組分析。利用Lasson回歸篩選后構(gòu)建Cox模型,借助AS事件的PSI值及回歸系數(shù)計(jì)算PAAD患者風(fēng)險值并截取中位值，分為高、低風(fēng)險2組。使用Survival包對納入的80例具有完整臨床資料的PAAD患者，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用單因素Cox回歸分析選擇可能影響PAAD預(yù)后的因素，采用多因素Cox回歸分析驗(yàn)證風(fēng)險值與PAAD患者生存時間的相關(guān)性。采用Cytoscape(3.7.1版)構(gòu)建PAAD生存相關(guān)AS事件與SF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究所有資料均用R(3.5.2版)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAAD中AS事件發(fā)生數(shù)目及與生存相關(guān)的AS事件發(fā)生數(shù)目 在PAAD樣品中，發(fā)現(xiàn)1 805個基因只發(fā)生ES，1 125個基因只發(fā)生AT，757個基因只發(fā)生AP，最常見的AS事件前3位分別是ES、AT、AP，ME為最罕見的AS事件，見圖1A。經(jīng)單因素Cox分析選取與生存相關(guān)的AS事件，研究表明與生存相關(guān)發(fā)生AS事件前3位為ES、AP、AT，ME仍較少見。其中，938個基因只發(fā)生ES，597個基因只發(fā)生AP，592個基因只發(fā)生AT，見圖1B。

2.2 PAAD中與生存相關(guān)的各型AS事件分析 在單因素Cox分析選取的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上進(jìn)行各類型AS事件的可視化分析，分別顯示了7種類型中與生存相關(guān)最重要的20個AS事件，CD44基因中發(fā)生的ES事件與生存顯著相關(guān)，UBA1、VRK3、SPAG7、ITGB1BP1、SPINT2、DNM2基因中分別對應(yīng)發(fā)生的AP、AT、RI、AA、AD、ME事件與生存顯著相關(guān)，并且大多數(shù)AP、RI事件是PAAD的危險因素，見圖2。

2.3 PAAD中AS事件的臨床生存分析 通過構(gòu)建Cox模型，見表1，利用PSI值、回歸系數(shù)計(jì)算PAAD患者風(fēng)險值中位值為1.00，并將所有AS事件分為高、低風(fēng)險2組，比較2組生存差異。通過Kaplan-Meier分析可發(fā)現(xiàn)高、低風(fēng)險2組的生存差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.10,P<0.01)。高風(fēng)險組的中位生存期為1.3年，低風(fēng)險組則為5.6年。值得注意的是，隨訪至第6年時，高風(fēng)險組無存活患者，低風(fēng)險組仍有2例存活，見圖3A。ROC曲線的AUC為0.765，表明該模型構(gòu)建比較準(zhǔn)確，見圖3B。單因素Cox回歸分析表明風(fēng)險值與患者總體生存率密切相關(guān)；多因素Cox回歸分析則進(jìn)一步提示高風(fēng)險值是影響PAAD患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(HR 1.050，95%CI1.03～1.07，P=0.000)，見表2。

2.4 PAAD中生存相關(guān)AS事件與SF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 為了探索生存相關(guān)AS事件之間的功能關(guān)系(|cor|>0.8，P<0.01)，使用Cytoscape生成基因相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，CELF3、CELF4、MSI1、NOVA1、CIRBP等剪接因子在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與AS事件密切相關(guān)。ELAVL3對高風(fēng)險的AS事件起負(fù)調(diào)控作用，PRPF39對低風(fēng)險的AS事件起正調(diào)控作用，而CPSF6對低風(fēng)險的AS事件起負(fù)調(diào)控作用。同時可以發(fā)現(xiàn)，RALYL存在對高風(fēng)險AS事件負(fù)調(diào)控及低風(fēng)險AS事件正調(diào)控的雙重作用，見圖4。

表1 基于AS事件的Cox模型參數(shù)

表2 單因素Cox回歸分析PAAD臨床特征、AS事件風(fēng)險值和總體生存率的相關(guān)性

3 討 論

剪切因子(SF)是參與RNA前體剪切過程的蛋白質(zhì)因子，表達(dá)異常會導(dǎo)致基因的AS發(fā)生改變，增加了基因組表達(dá)mRNA的多樣性，使其編碼的蛋白質(zhì)改變，進(jìn)而改變表型。在腫瘤中，SF表達(dá)異常可能會引起特定促癌剪切異構(gòu)體的形成，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[3]。本研究中，基于AS事件的風(fēng)險值計(jì)算，發(fā)現(xiàn)風(fēng)險值可作為預(yù)后特征。SF和生存相關(guān)AS事件之間存在調(diào)控關(guān)系的研究，讓人們對PAAD中SF在AS事件所處的調(diào)控中心有了更深入的認(rèn)識。

在PAAD中與生存相關(guān)的AS事件發(fā)生情況的研究發(fā)現(xiàn)，位列首位為ES。同樣，有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌中ES也是主要的AS事件[5-6]，可能與RNA的保守性及存在順式調(diào)控元件相關(guān)，目前尚未完全闡明。在亞組AS事件可視化分析中得到的部分基因在PAAD中的作用得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究證實(shí)ESRP可以調(diào)節(jié)CD44 v8-10和v6-10外顯子的剪接[7]，且CD44的選擇性剪接調(diào)控因子在正常或腫瘤細(xì)胞中的下調(diào)并不影響CD44的總mRNA水平[8]。在細(xì)胞水平及臨床研究中發(fā)現(xiàn)[9-10]，CD44陽性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞較CD44陰性亞群相比惡性程度更高，且與T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和腫瘤部位等相關(guān)。在腫瘤形成方面，CD44高表達(dá)的腫瘤組織在大小和質(zhì)量上更占優(yōu)勢。腫瘤中的UBA1、VRK3、SPAG7、ITGB1BP1、SPINT2、DNM2等基因中的AS事件值得關(guān)注。

通過ROC曲線，分析了AS事件對PAAD預(yù)后的預(yù)測能力。結(jié)果表明，AS事件與PAAD患者的存活時間相關(guān)，高風(fēng)險值可作為PAAD的不良預(yù)后因素。此外，本研究分析也強(qiáng)調(diào)了SF在AS事件中潛在的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，通過刪除MSI1/MSI2使得胰腺上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為腺癌的速度減慢，MSI1的缺失可引起小鼠MR下的腫瘤體積減少為原來的1/5倍。同樣，有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)NOVA1與胰腺β細(xì)胞功能有關(guān)，如胞吐作用、轉(zhuǎn)錄、胰島素受體信號傳導(dǎo)、剪接和細(xì)胞凋亡[12]。但是，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中凸顯出的SF功能及作用機(jī)制還需要深入探索。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還顯示出明顯的趨勢，即大多數(shù)低風(fēng)險AS事件與SF的表達(dá)呈正相關(guān)，而高風(fēng)險AS事件與SF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。盡管如此，一些特定SF表達(dá)的下調(diào)是否會導(dǎo)致低風(fēng)險AS事件減少和高風(fēng)險AS事件增加還需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

當(dāng)前癌癥治療的主要難題是患者對治療藥物產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。一項(xiàng)研究表明[13]，剪接體突變改變了剪接位點(diǎn)和/或外顯子的識別偏好，這種機(jī)制的變化可能會在癌細(xì)胞中產(chǎn)生突破點(diǎn)，利用剪接體突變的生化特性、基因組和生物學(xué)效應(yīng)優(yōu)化腫瘤治療方法和手段。Siegfried等[14]研究發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中丙酮酸激酶基因(PKM)的AS受到影響，導(dǎo)致促進(jìn)與癌癥相關(guān)的PKM2亞型表達(dá)升高，可增強(qiáng)胰腺腫瘤對吉西他濱的耐藥性。此外，通過反義寡核苷酸切換PKM剪接，從而有利于PKM1的替代變體表達(dá)，增強(qiáng)氧化磷酸化，使胰腺腫瘤細(xì)胞對吉西他濱消除耐藥性，進(jìn)而成為改善胰腺導(dǎo)管腺癌對化療反應(yīng)的新潛在治療靶點(diǎn)。

總之，本研究對PAAD中與生存相關(guān)的AS事件進(jìn)行了概述，并建立了有價值的預(yù)后模型，可用于疾病預(yù)后預(yù)測。AS事件與SF之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提出了SF如何潛在調(diào)節(jié)PAAD中AS事件的新見解。這些與生存相關(guān)的AS事件和SF為PAAD患者提供了許多新的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

帕成周:查閱網(wǎng)絡(luò)生物信息數(shù)據(jù)挖掘資源，完成大部分?jǐn)?shù)據(jù)分析，論文撰寫；張貫啟:完成部分?jǐn)?shù)據(jù)分析，論文指導(dǎo)；鄔善敏:論文審核