冷凍電鏡的“跨界大咖秀”
——雷建林與他的科學(xué)“魔法”

李明麗

2020年年初肆虐的“新冠肺炎”疫情對(duì)人民健康水平和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，都帶來(lái)極大影響。疫情發(fā)生后，解析病毒結(jié)構(gòu)、研發(fā)疫苗進(jìn)展，這些原本“學(xué)術(shù)味”十足的關(guān)鍵詞，也成了普通老百姓十分關(guān)心的話題。

2020年6月份，Science雜志發(fā)表西湖大學(xué)周強(qiáng)團(tuán)隊(duì)最新研究成果：他們利用冷凍電鏡技術(shù)，解析了新冠病毒S蛋白與中和抗體4A8復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，為靶向S蛋白N端結(jié)構(gòu)域的藥物設(shè)計(jì)和治療策略提供了基礎(chǔ)。該抗體是由陳薇院士團(tuán)隊(duì)從新冠肺炎康復(fù)病人的免疫細(xì)胞中篩選和鑒定的，具有強(qiáng)病毒中和能力。這一結(jié)果早在5月份第一時(shí)間向全社會(huì)公開。此前，周強(qiáng)團(tuán)隊(duì)已分別解析了新冠病毒受體ACE2全長(zhǎng)蛋白、S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ACE2全長(zhǎng)蛋白復(fù)合物的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，并第一時(shí)間向全社會(huì)公開，隨后在3月份被Science雜志刊登封面文章報(bào)道。值得注意的是，這些結(jié)構(gòu)解析所依托的冷凍電鏡數(shù)據(jù)，全部通過(guò)一套自動(dòng)化系統(tǒng)所采集。

看清病毒結(jié)構(gòu)，為藥物設(shè)計(jì)提供有力幫助，而解密這些結(jié)構(gòu)，則離不開冷凍電鏡平臺(tái)。這項(xiàng)對(duì)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)乃至物理化學(xué)的研究都有重大意義的平臺(tái)技術(shù)，目前在全世界范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)。帶著諸多疑問(wèn)，記者走訪了清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)總管、中國(guó)冷凍電鏡杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)獲得者，也是上述自動(dòng)化系統(tǒng)的開發(fā)者——雷建林，聽他介紹冷凍電鏡的“跨界大咖秀”。

冷凍電鏡是怎樣為生物學(xué)研究推波助瀾的？

“冷凍電鏡技術(shù)，顧名思義，就是應(yīng)用冷凍固定術(shù)在低溫下使用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察樣品的顯微技術(shù)，是一種結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)。為什么要在冷凍條件下觀察呢？這是因?yàn)樯飿悠分械纳锎蠓肿硬荒洼椪涨液?，如果直接將溶液上的蛋白放在電鏡上觀察，會(huì)破壞其精細(xì)結(jié)構(gòu)。這個(gè)時(shí)候，可以將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成非常薄的水膜，吸掉多余溶液后快速冷凍形成一層玻璃態(tài)的冰，再放到冷凍電鏡上觀察。這樣做，一方面不會(huì)破壞電鏡的高真空，另一方面更接近生物大分子的生理狀態(tài)。”雷建林開門見山地介紹。

回溯歷史，冷凍電鏡樣品制備技術(shù)的嘗試始于20世紀(jì)70年代，至1982年開發(fā)出真正成熟可用的快速冷凍制樣技術(shù)。伴隨著的是冷凍電鏡各種結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的日漸成熟，包括電子晶體學(xué)、單顆粒分析、電子斷層術(shù)以及近年發(fā)展起來(lái)的微晶衍射技術(shù)。一直以來(lái)，在X射線晶體學(xué)、核磁共振和冷凍電鏡三大結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段中，冷凍電鏡是最弱的一項(xiàng)，但是已到了萬(wàn)事俱備只欠東風(fēng)的階段。具有標(biāo)志性意義的事件是直接電子探測(cè)器成功開發(fā)并應(yīng)用于冷凍電鏡。2013年年底，加州大學(xué)舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測(cè)器K2相機(jī)和冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析了TRPV1膜蛋白3.4埃近原子分辨率結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡硬件的突破掀起了結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的一場(chǎng)風(fēng)暴，以往依托傳統(tǒng)X射線晶體學(xué)長(zhǎng)期無(wú)法解決的許多重要大分子復(fù)合體及膜蛋白的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，被各個(gè)擊破。

2020年5月下旬，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)再次打破分辨率紀(jì)錄。有兩個(gè)課題組分別利用冷凍電鏡新硬件，如冷場(chǎng)電子槍+能量過(guò)濾+新型相機(jī)、單色器+新型球差校正裝置，將去鐵蛋白的結(jié)構(gòu)解析分辨率分別推進(jìn)到1.2埃和1.25埃，達(dá)到真正的單個(gè)原子水平?！斑@無(wú)疑會(huì)繼續(xù)將這一風(fēng)暴延續(xù)下去。”雷建林介紹。

雷建林表示，依托冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，人類對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)有了更多的了解；而隨著冷凍電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，假以時(shí)日，科學(xué)家亦將實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生命體的更多解讀。

冷門學(xué)科是怎樣實(shí)現(xiàn)“從0到1”突破的？

對(duì)于雷建林來(lái)說(shuō)，是勤奮和機(jī)緣讓他一次又一次地把握住了機(jī)會(huì)，并一以貫之地在材料電鏡和冷凍電鏡方面不斷鉆研。而他的學(xué)習(xí)、工作經(jīng)歷，則是冷凍電鏡技術(shù)人才培養(yǎng)和平臺(tái)從“從0到1”籌建歷程的典型。

從1989年本科進(jìn)入武漢大學(xué)物理系，到1998年獲得武漢大學(xué)博士學(xué)位，并進(jìn)入中國(guó)科學(xué)院物理研究所從事博士后工作，十年寒窗為雷建林打下了堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。

自20世紀(jì)90年代中期開始，雷建林就以材料電鏡為主要手段開展工作，先后師從王仁卉先生和郭可信先生，開始從事準(zhǔn)晶熱漫散射的定量電子顯微學(xué)研究?！巴跸壬鷾Y博的學(xué)識(shí)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，讓我受益至今；而轉(zhuǎn)向冷凍電鏡領(lǐng)域的研究，則受郭先生影響頗深。”雷建林介紹。

1999年11月到2000年1月，在德國(guó)慕尼黑大學(xué)3個(gè)月短期訪問(wèn)學(xué)者的經(jīng)歷，更是讓雷建林拓展了視野，拓寬了科研思路，也為他后來(lái)的冷凍電鏡研究打通了“任督二脈”。

2000年起，雷建林的科研工作轉(zhuǎn)向冷凍電鏡領(lǐng)域。當(dāng)時(shí)，這個(gè)研究方向尚屬冷門，他先后在美國(guó)紐約州衛(wèi)生部沃茲沃斯中心及美國(guó)哥倫比亞大學(xué)跟隨冷凍電鏡的先驅(qū)及單顆粒算法的首創(chuàng)和實(shí)現(xiàn)者、2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Joachim Frank教授進(jìn)行冷凍電鏡的技術(shù)研發(fā)工作。

2008年年中，清華大學(xué)決定建設(shè)新的結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。于是，在雷建林等人的協(xié)助下，清華大學(xué)購(gòu)置了亞洲第一臺(tái)Titan Krios冷凍電鏡。同年11月，雷建林回國(guó)到正在籌建的清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)上任主管。

而這臺(tái)于2009年3月9日到貨服役的設(shè)備，也為平臺(tái)的建設(shè)和依托平臺(tái)的科研工作做出了重大貢獻(xiàn)?！八陂_展單顆粒分析、電子斷層成像等三維結(jié)構(gòu)的研究方面有著突出的優(yōu)勢(shì)，能夠解析蛋白復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞器甚至整個(gè)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)。”雷建林介紹。

作為全面負(fù)責(zé)平臺(tái)管理與運(yùn)行的總管，雷建林也和這臺(tái)設(shè)備一起，經(jīng)歷了清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)逐步壯大的全過(guò)程。硬件過(guò)硬，效率夠高，短短數(shù)年，平臺(tái)已發(fā)展成全世界最頂尖的冷凍電鏡平臺(tái)之一。如今，平臺(tái)已有10臺(tái)冷凍透射電鏡包括4臺(tái)最高端的Titan Krios電鏡，還有2臺(tái)雙束顯微鏡、關(guān)聯(lián)顯微鏡及和全套相關(guān)的輔助設(shè)備等。

可以說(shuō)，平臺(tái)的飛速發(fā)展，與清華大學(xué)“既支持又不干涉”的方式分不開；而不斷提高的效率，則與平臺(tái)團(tuán)隊(duì)的精細(xì)管理息息相關(guān)。作為科研工作的重要設(shè)施，申請(qǐng)使用的課題項(xiàng)目很多，僅校內(nèi)需求便已呈供不應(yīng)求之勢(shì)。為此，清華大學(xué)成立了專門的委員會(huì)以評(píng)審申請(qǐng)課題，經(jīng)過(guò)審議決定后，再為課題組分配電鏡的使用時(shí)間?！拔覀冇幸惶兹粘５囊?guī)章制度，每一臺(tái)設(shè)備都有非常嚴(yán)格的使用須知，這樣就保證了設(shè)備盡可能在一個(gè)比較好的狀態(tài)下運(yùn)行。同時(shí)，因?yàn)槲覀兊脑O(shè)備是7×24小時(shí)對(duì)外服務(wù)的，全年無(wú)休，針對(duì)此，還有一套激勵(lì)機(jī)制，鼓勵(lì)平臺(tái)人員及時(shí)為用戶解決問(wèn)題，多做研究，多出成果。”

近年來(lái)，雷建林還全面負(fù)責(zé)西湖大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的建設(shè)，并為國(guó)內(nèi)眾多冷凍電鏡平臺(tái)的建設(shè)提供了幫助和建議，助推了我國(guó)冷凍電鏡的推廣和發(fā)展。

2014年之前，國(guó)內(nèi)最高端的冷凍電鏡還只有3臺(tái)。從2014年開始，國(guó)內(nèi)外均涌起冷凍電鏡的購(gòu)買熱潮。國(guó)內(nèi)很多單位以清華模式為標(biāo)準(zhǔn)陸續(xù)建設(shè)自己的冷凍電鏡平臺(tái)。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，到2020年年底，國(guó)內(nèi)安裝好的和已經(jīng)下訂單采購(gòu)的冷凍電鏡平臺(tái)中，最高端的冷凍電鏡預(yù)計(jì)將達(dá)40臺(tái)。

“這7年時(shí)間，伴隨著冷凍電鏡技術(shù)的突飛猛進(jìn)，冷凍電鏡平臺(tái)的建設(shè)也遍地開花，這有其合理性，但也有不少非理性的因素?！崩捉指袊@。

“每天節(jié)省上萬(wàn)元折舊費(fèi)”的系統(tǒng)能做什么？

冷凍電鏡的目標(biāo)是將結(jié)構(gòu)的解析提高到原子分辨率水平，通常需要通宵達(dá)旦收集數(shù)天乃至數(shù)十天以獲得幾千數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)十萬(wàn)張電鏡照片，如此大規(guī)模的數(shù)據(jù)靠傳統(tǒng)的手動(dòng)采集非常不現(xiàn)實(shí)，一方面耗時(shí)費(fèi)力，另一方面效率低下，這實(shí)際上已經(jīng)成為阻礙當(dāng)前高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的主要瓶頸之一。生物樣品普遍具有一定的結(jié)構(gòu)柔性，只有數(shù)據(jù)量足夠大，才能保證結(jié)構(gòu)的有效性。解決這一問(wèn)題的有效途徑就是開發(fā)高通量、全自動(dòng)化的冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。

近年來(lái)，雷建林先后作為課題負(fù)責(zé)人和項(xiàng)目骨干，獲得國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資助。他開發(fā)的自動(dòng)化電鏡數(shù)據(jù)采集技術(shù)和各種電鏡優(yōu)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于冷凍電鏡平臺(tái)，極大地提高了設(shè)備的使用效率。

雷建林獨(dú)立發(fā)展的高通量自動(dòng)化冷凍電鏡單顆粒數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)AutoEMation最初只適用于Tecnai系列電鏡，隨著清華大學(xué)引進(jìn)Titan Krios，2010年擴(kuò)展至Titan系列電鏡。隨著直接電子探測(cè)器的引入，2016年擴(kuò)展至直接電子探測(cè)器。系統(tǒng)還可根據(jù)用戶的特殊需要提供深度定制開發(fā)，獲得了大量的使用?！霸缭?0多年前還在CCD相機(jī)時(shí)代，我們用移動(dòng)電子束的方法取代移動(dòng)樣品臺(tái)的方法，實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)孔內(nèi)拍多張照片，從而極大地提高了數(shù)據(jù)采集效率。到了直接電子探測(cè)器K2時(shí)期，由于最大的瓶頸是相機(jī)數(shù)據(jù)的吐出速度，移動(dòng)電子束的方法對(duì)效率的提升不夠顯著。到了K3時(shí)期，隨著相機(jī)數(shù)據(jù)吐出速度的加快，移動(dòng)電子束的方法能大幅提升數(shù)據(jù)采集速度。”雷建林介紹。

這套系統(tǒng)不僅數(shù)據(jù)獲取效率高，還具有走位準(zhǔn)確等技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)——既適合于所有類型的電鏡載網(wǎng)，也適用于在孔洞中位置非常不確定的樣品如病毒、微絲、微管等。

此外，這套系統(tǒng)使用靈活，設(shè)置簡(jiǎn)單?！安还庵С秩詣?dòng)采集，也支持半自動(dòng)收集，后者極大方便了用戶快速檢查樣品；簡(jiǎn)化并自動(dòng)精確設(shè)置低劑量（low dose）成像條件；可選擇用物鏡(objective lens)或樣品臺(tái)(stage)設(shè)置離焦量（defocus），后者特別適用于球差電鏡，同時(shí)還巧妙地解決了既要盡量保持樣品臺(tái)Z軸不動(dòng)以減少Z方向motion，又要利用樣品臺(tái)Z軸來(lái)設(shè)置defocus范圍之間的矛盾；數(shù)據(jù)采集過(guò)程中能自動(dòng)校正能量過(guò)濾系統(tǒng)的零峰。”提起系統(tǒng)功能，雷建林滔滔不絕。

值得關(guān)注的是，這套系統(tǒng)支持傾轉(zhuǎn)樣品的自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集。核孔復(fù)合物（Nuclear Pore Complex，NPC）被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的圣杯之一。施一公團(tuán)隊(duì)最新用單顆粒技術(shù)發(fā)表的高分辨率的NPC結(jié)構(gòu)，就是用這套系統(tǒng)的傾轉(zhuǎn)功能采集的數(shù)據(jù)。此外，它還支持相位板數(shù)據(jù)的自動(dòng)化采集。王宏偉團(tuán)隊(duì)發(fā)表了分子量52千道爾頓的鏈霉親和素蛋白的3.2埃分辨率冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)，創(chuàng)造了利用冷凍電鏡單顆粒方法解析至近原子分辨率生物大分子分子量最小的紀(jì)錄，就是用這套系統(tǒng)的該功能采集的。

在自動(dòng)化采集技術(shù)銜接空白期的那段時(shí)間里，只能使用人工采集數(shù)據(jù)，需要三班倒“蹲守”在操作臺(tái)邊，而且操作繁瑣、效率低下，操作人員也異常疲倦。而通過(guò)這套系統(tǒng)的應(yīng)用，不僅大幅提高了電鏡的有效機(jī)時(shí)和單位機(jī)時(shí)的效率，同時(shí)還簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)收集門檻，“用戶經(jīng)過(guò)相關(guān)的培訓(xùn)后，不需要掌握更多的技術(shù)也可以自己獨(dú)立完成相應(yīng)的應(yīng)用。用戶不再需要三班倒，晚上可以睡覺，白天可以繼續(xù)做其他的工作”。

單臺(tái)冷凍電鏡設(shè)備的價(jià)格都是數(shù)千萬(wàn)元級(jí)別的。如此昂貴的設(shè)備，效率的提升等同于發(fā)揮了社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。雷建林介紹：“如果工作效率提高一倍，等于每臺(tái)高端電鏡每天光折舊費(fèi)就可節(jié)省上萬(wàn)元，這還不包括效率提升在科研方面創(chuàng)造的社會(huì)效益?！?/p>

“接下來(lái)最重要的還是繼續(xù)完善各種自動(dòng)化技術(shù)?！崩捉謱?duì)未來(lái)有著美好的愿景，他預(yù)期隨著冷凍電鏡技術(shù)的再發(fā)展和突破，冷凍電鏡的發(fā)展方向應(yīng)該是直接做原位研究。雖然實(shí)現(xiàn)起來(lái)困難重重，但是技術(shù)一旦突破，將為科研工作帶來(lái)更多利好。

高光頻現(xiàn)的平臺(tái)上都誕生了什么？

2017年10月4日，瑞典皇家科學(xué)院宣布將2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給對(duì)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展做出原創(chuàng)性貢獻(xiàn)的3位學(xué)者，其中包括雷建林的合作導(dǎo)師Joachim Frank。此舉被業(yè)界戲稱為“一個(gè)發(fā)給了物理學(xué)家的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，以獎(jiǎng)勵(lì)他們幫助了生物學(xué)家”，傳為佳話。從這項(xiàng)“跨界”大獎(jiǎng)上，亦足見冷凍電鏡技術(shù)在多學(xué)科應(yīng)用中的重要地位。

其實(shí)，在冷凍電鏡研究領(lǐng)域，清華大學(xué)根基深厚。這與多位院士的推動(dòng)分不開。在國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究基礎(chǔ)設(shè)施立項(xiàng)過(guò)程中，施一公院士聯(lián)合王志新、隋森芳兩位院士在清華大學(xué)基地計(jì)劃的約10個(gè)平臺(tái)中選定已經(jīng)起步的冷凍電鏡平臺(tái)作為重點(diǎn)建設(shè)方向。2011年，王宏偉教授入職清華大學(xué)領(lǐng)銜清華大學(xué)基地建設(shè)。

伴隨著冷凍電鏡技術(shù)的異軍突起，清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)高光頻現(xiàn)，連續(xù)多年誕生突破性重大科研進(jìn)展：

在2019年度中國(guó)生命科學(xué)十大進(jìn)展中，有兩大進(jìn)展離不開這個(gè)平臺(tái)。

其一是“植物抗病小體的結(jié)構(gòu)與功能研究”，由清華大學(xué)柴繼杰組、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所周儉民組和清華大學(xué)王宏偉組合作完成，解析了抗病蛋白ZAR1多個(gè)狀態(tài)復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)。

其二是“破解硅藻光合膜蛋白超分子結(jié)構(gòu)和功能之謎”。同時(shí)還入選了該年度的中國(guó)科學(xué)十大進(jìn)展。中國(guó)科學(xué)院植物研究所沈建仁、匡廷云組在國(guó)際上首次用X射線晶體學(xué)解析了硅藻捕光天線膜蛋白(FCP) 1.8埃的高分辨率結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步與清華大學(xué)隋森芳組合作用冷凍電鏡解析了硅藻光系統(tǒng)II和FCP超級(jí)復(fù)合物3.0埃的結(jié)構(gòu)。

此前，施一公組在“揭示RNA剪接的關(guān)鍵分子機(jī)制”等方面的工作，入選2016年度中國(guó)科學(xué)十大進(jìn)展，他本人獲得2017年未來(lái)科學(xué)大獎(jiǎng)生命科學(xué)獎(jiǎng)，以表彰他在解析真核信使RNA剪接體結(jié)構(gòu)和揭示其機(jī)理的重大貢獻(xiàn)；顏寧組完成的“肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的分子機(jī)理探索”，入選2016年度中國(guó)高等學(xué)校十大科技進(jìn)展；楊茂君組在“線粒體呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能”的工作，入選2016年度中國(guó)生命科學(xué)十大進(jìn)展……

令人驚嘆的是，上述這些成果的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)全部采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，絕大部分由雷建林獨(dú)立開發(fā)的自動(dòng)化系統(tǒng)收集完成。可以說(shuō)，清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的高光頻現(xiàn)，也得益于雷建林的管理和開發(fā)的技術(shù)。

截至2020年5月，依托清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，已有超過(guò)50篇以冷凍電鏡為主要手段的研究論文發(fā)表于Nature、Science、Cell三大國(guó)際頂級(jí)期刊上。平臺(tái)成為業(yè)內(nèi)標(biāo)桿的同時(shí)，因其平臺(tái)建設(shè)管理和技術(shù)研發(fā)的貢獻(xiàn)，雷建林個(gè)人也榮獲了第一屆“中國(guó)冷凍電鏡杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)”。

在這片孕育科學(xué)奇跡的神奇土壤里，雷建林還在不停播種并守望著更加絢爛的未來(lái)。