曲克蘆丁脂質(zhì)體的制備及體外釋放度研究

周永芳，李林松，李 錕*，楊碩曄

(1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063；2.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001)

曲克蘆丁(又稱維生素P4)可抑制血小板凝聚，防止血栓形成，改善血液循環(huán)，增加毛細血管抵抗力，治療急性缺血性腦損傷，使人體血管的一些病變得到改善；其還具有抗氧化功能，修復(fù)5-羥色胺、緩激肽等物質(zhì)引起的血管損傷；曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液能有效治療糖尿病腦梗死，提高糖尿病腦梗死的治愈率，降低其病死率[1]。

目前，曲克蘆丁有多種劑型如膠囊劑、口腔崩解片、注射劑、片劑、散劑和顆粒劑等。曲克蘆丁的水溶性和脂溶性均不好[2]，口服及注射曲克蘆丁制劑后，吸收不良，生物利用度低[3]。另外，注射劑因注射疼痛，患者依從性低，用藥不便。脂質(zhì)體作為藥物載體，既可以包封水溶性物質(zhì)又可以包封脂溶性物質(zhì)，可增強其水溶性和穩(wěn)定性，改變藥物在體內(nèi)的分布情況，還可以改良藥物的吸收，提高藥物的穩(wěn)定性，提高生物利用度，延長藥物作用時間[4]。

1 材料

1.1 儀器

TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Agilent LC 1260液相色譜儀(日本安捷倫科技有限公司)；G1322A標準真空脫氣機；G1312C二元泵；G1316A標準柱溫箱；G1314B可變波長檢測器；FD-1-50真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

曲克蘆丁(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；乙腈(分析純，西隴科學股份有限公司)；10 mg/mL魚精蛋白(注射液，上海第一生化藥業(yè)有限公司)；豆磷脂95、98(注射用，上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(美國Avanti公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 曲克蘆丁脂質(zhì)體的制備

分別稱取大豆磷脂、膽固醇、曲克蘆丁于圓底燒瓶中，加入10 mL甲醇，旋渦混合儀震蕩5 min，超聲 30 min，再加入8 mL的水進行超聲2 h，待液相不分離的時候進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，壓力控制0.05 MPa，水浴溫度30 ℃，20 min后取出，放入超聲儀中使其分散均勻即得曲克蘆丁脂質(zhì)體[5]。

2.2 曲克蘆丁脂質(zhì)體包封率的測定

2.2.1 色譜條件

流動相∶V(甲醇)∶V(水)=6∶4，檢測波長：350 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃。

2.2.2 準確度實驗

取曲克蘆丁標液(1000 μg/mL)10 μL，進樣三次，求平均值；將曲克蘆丁標液稀釋10倍(100 μg/mL)，進樣三次，求平均值。根據(jù) 計算準確度為113.8%，說明高效液相色譜的測量結(jié)果可靠性較高，數(shù)值可信。

2.2.3 回收率實驗

取標液100 μL(1000 μg/mg)，加入900 μL甲醇，得到1000 μL對照溶液，搖勻，測定。分別取標液80 μL、100 μL、120 μL，再分別加入120 μL、100 μL、80 μL魚精蛋白稀釋液，最后再加800 μL甲醇，得到1000 μL溶液，搖勻，測定。計算得80%樣品、100%樣品、120%樣品的回收率分別是100.4%、98.5%、102.4%，說明方法的回收率較好。

2.2.4 包封率的測定

采用HPLC法測定曲克蘆丁[6]：取脂質(zhì)體樣品100 μL，然后加入4 mL甲醇破乳，渦旋后測定。取兩只離心管，每只離心管中分別加入100 μL脂質(zhì)體溶液，再加入100 μL魚精蛋白，靜置5 min。然后加入4 mL去離子水，12000 r/min離心10 min，將上清液全部直接進樣測定，根據(jù)公式和測定數(shù)值計算包封率為14.28%。

2.2.5 冷凍干燥對脂質(zhì)體包封率的影響

將放置一段時間的樣品從冰箱(4 ℃)中取出，發(fā)現(xiàn)溶液中有固體顆粒物析出，使用渦旋混合器和超聲波清洗機對樣品進行分散。較長時間后觀察樣品，發(fā)現(xiàn)固體顆粒仍然不能完全溶解，繼續(xù)用超聲波細胞破碎儀來達到目的[7]。把樣品放入冰浴中，使用細胞破碎儀進行破碎，完成后觀察樣品呈均勻溶液。將樣品倒進小燒杯(50 mL)中，然后放入凍干機進行凍干，分別測定凍干前后脂質(zhì)體的包封率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 冷凍干燥前后包封率的變化

從圖1可以看出冷凍干燥對處方11、處方13、處方14、處方16的包封率影響并不大。而處方15、處方17包封率變化較大，這可能與凍干后復(fù)溶時的操作不準確有關(guān)。

2.3 曲克蘆丁脂質(zhì)體體外釋放度研究

2.3.1 測定方法

取100 mL的釋放介質(zhì)放于200 mL的燒杯中，取2 mL脂質(zhì)體置于透析袋中，并將兩端用細線封口，并置于以上所述的100 mL釋放介質(zhì)中，當溫度達到37℃時開始啟動搖床，搖床轉(zhuǎn)動速度為85 r/min。分別在0，10，30，70 min及2，4，6，8，12 h時刻取樣，每次取樣2 mL，并及時補充2 mL釋放介質(zhì)，將取出的樣品收集起來，之后測定其含量。

HPLC法測定不同時間點釋放介質(zhì)中藥物的含量。同時取適量的脂質(zhì)體，用甲醇破乳，測定總藥量W，并根據(jù)下面公式計算其釋放百分率[8]。

Qn=CnVo+∑CiVi(i=0～n-1) 釋放百分率(%)=Q/W 100%

2.3.2 釋放介質(zhì)考察

取某一處方脂質(zhì)體，分別以去離子水，PBS和生理鹽水為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為85 r/min，按照上述方法溶出后，測定其釋放度(表1)，考察其體外釋藥的情況(圖2)。

表1 不同釋放介質(zhì)的釋放度

圖2 不同釋放介質(zhì)釋放度趨勢圖

由表1和圖2可知，以PBS和生理鹽水為釋放介質(zhì)時對釋放度的影響均大于去離子水，雖然PBS和生理鹽水的釋放度相對較大，去離子水的釋放度相對較小，但是它們做釋放介質(zhì)時釋放度不夠穩(wěn)定，而去離子水是相對穩(wěn)定的。因此選擇去離子水作為釋放介質(zhì)。

2.3.3 不同處方的釋放度比

在37℃的條件下，以去離子水為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速85 r/min，分別測定處方3，處方6和處方9的釋放度，并比較其釋放度的差別[9](表2)。

表2 不同處方釋放度

由表2可知，處方9的第5組數(shù)據(jù)有明顯的波動性，數(shù)據(jù)不合理，而處方3和處方6均沒有出現(xiàn)這種波動，而且從整體數(shù)據(jù)來看，藥物沒有突釋現(xiàn)象，所以將這組數(shù)據(jù)舍去，建立一個新表格。而處方3的第一組數(shù)據(jù)不合理，是因為實驗時的不可控因素造成，且數(shù)據(jù)可以接受，所以不將其舍去(表3，圖3)。

表3 不同處方釋放度

圖3 不同處方釋放度趨勢圖

由圖3可知，三個處方釋放度曲線趨勢大致相同，而且相差較小，而且每個處方的釋放度都能達到74%之上，可見每個處方脂質(zhì)體包載的藥物均能得到較好的釋放。

2.3.4 數(shù)學模型擬合

分別以零級動力學，一級動力學和Higuchi方程，Ritger-Peppas方程，Webull方程對曲克蘆丁脂質(zhì)體的積累釋放曲線進行方程擬合得擬合方程如表4所示[10]。

表4 處方擬合曲線

擬合結(jié)果表明的體外釋放最優(yōu)擬合均為Weibull模型。

3 結(jié)論

本研究建立的魚精蛋白凝集法在測定曲克蘆丁脂質(zhì)體包封率時準確、有效、快速，可快速分離游離藥物和脂質(zhì)體，從而能夠準確測定并計算得到曲克蘆丁脂質(zhì)體的包封率[11]。采用冷凍干燥技術(shù)可將曲克蘆丁脂質(zhì)體制成凍干樣品， 根據(jù)數(shù)據(jù)，冷凍干燥對樣品的藥物含量影響較小，同樣對樣品的包封率也沒有明顯的影響。

通過對建立釋放度測定的方法學，我們可以得出該方法專屬性強，藥物性質(zhì)穩(wěn)定，線性關(guān)系在一定濃度下良好，回收率高，精密度和準確度均良好。采用搖床釋放藥物的方法，選出三個處方對曲克蘆丁脂質(zhì)體進行體外釋放度的研究[12]。采用的液相條件是：甲醇∶水=60∶40，檢測波長：350 nm，流動速度：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。對三個處方分別進行了零級動力學方程，一級動力學方程，Higuchi方程，Ritger-Peppas方程，Weibull擬合，擬合結(jié)果表明曲克蘆丁脂質(zhì)體的體外釋放最優(yōu)擬合均為Weibull模型。

實驗說明，將曲克蘆丁制備成脂質(zhì)體，并不會影響曲克蘆丁藥效的發(fā)揮，且輔料不會對曲克蘆丁脂質(zhì)體產(chǎn)生較大影響。曲克蘆丁脂質(zhì)體還會增強藥物的穩(wěn)定性，脂質(zhì)體可以選擇性的釋放藥物，使藥物的作用靶向性增強，更有利于藥物的吸收和利用。而且脂質(zhì)體的載體材料和細胞膜組成相似，對人體沒有免疫反應(yīng)和毒害作用[13]。因此將曲克蘆丁制成脂質(zhì)體對其發(fā)揮藥效具有很大的促進作用。但同時本實驗也有不足之處，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有待進一步提高。