一株高效異養(yǎng)脫硫菌的篩選及性能研究*

佟欣宇 ，李海紅 ，宦臣臣 ，閆志英

（1.西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048；2.中國(guó)科學(xué)院 成都生物研究所，四川 成都 610000）

隨著近年來(lái)資源化利用的迅速發(fā)展，堆肥過(guò)程中產(chǎn)生的惡臭氣體作為二次污染得到的越來(lái)越多的關(guān)注[1]。其中含有H2S的廢氣由于毒性較強(qiáng)且具有腐蝕性，嚴(yán)重危害人類健康和設(shè)施安全[2]。目前，處理這類污染物常見(jiàn)的方法有物理、化學(xué)和生物法。生物脫硫法是利用微生物所含酶系將含硫化合物轉(zhuǎn)化成單質(zhì)硫或硫酸鹽，因其設(shè)備簡(jiǎn)單，處理費(fèi)用低，反應(yīng)溫和，以及環(huán)保無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)成為現(xiàn)如今脫硫方向的研究熱點(diǎn)[3,4]。

目前，已報(bào)道的可用于生物脫硫的微生物種類繁多，但大部分是光能自養(yǎng)型微生物[5-8]。這類微生物脫硫效果顯著，但因其生長(zhǎng)速率緩慢且生存環(huán)境要求較苛刻而不適應(yīng)于大型反應(yīng)器的培養(yǎng)掛膜[9]，而有機(jī)異養(yǎng)型微生物可以彌補(bǔ)這些問(wèn)題。因此篩選具有高效脫硫能力的異養(yǎng)微生物，并探究其脫硫特性便顯示的尤為重要。本研究從硝化池活性污泥中篩選一株高效異養(yǎng)脫硫菌，探究其對(duì)去除溶液中硫化物的最佳反應(yīng)條件及對(duì)氣態(tài)H2S的去除效率，以期為生物脫硫的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌株來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)菌株均篩選自四川省成都市長(zhǎng)安垃圾填埋場(chǎng)的垃圾滲濾液硝化池活性污泥中。

1.2 培養(yǎng)基

（1）富集和脫硫?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)基 葡萄糖5.0g；KH2PO41.0g；K2HPO41.0g；MgCl2·6H2O 0.8g；FeCl2·12H2O 0.01g；NH4Cl 0.4g；NaHS 5.0g，蒸餾水 1000mL，pH 值為 6.8～7.2，115℃滅菌 30min。

（2）LB培養(yǎng)基 酵母提取物5.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 10.0g；蒸餾水 1000mL，pH 值為 7.0，121℃滅菌30min。

1.3 菌株的篩選

取10mL活性污泥于裝有90mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃，160r·min-1的恒溫?fù)u床下培養(yǎng)24h，靜止取10mL上清液于新的分離培養(yǎng)基中，如此反復(fù)5次。最后一次富集后，取上清液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度梯度稀釋，分別取0.2mL稀釋液于固體分離培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布并培養(yǎng)數(shù)天。將培養(yǎng)基中形態(tài)和樣貌不一的單菌落分離純化，并進(jìn)行斜面保存。

將篩選出的菌株按照10%的接種量接入已滅菌的脫硫?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)基中，于30℃，160r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。每一株分別設(shè)定3個(gè)平行和3個(gè)空白作為對(duì)照，每隔0.5h取樣并離心，測(cè)定其上清液中硫化物濃度以及沉淀中的硫單質(zhì)濃度，并以此作為判斷標(biāo)準(zhǔn)篩選出脫硫效果最佳的菌株。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株生理生化及分子生物學(xué)鑒定 參照《伯杰明細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶等生理生化試驗(yàn)。以及在電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株AS-2的基因組DNA，以此為模板，利用16S rDNA基因通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增16SrDNA的引物:27F（正向）（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（反向）（5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'）。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定。測(cè)得的序列通過(guò)NCBI中Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，使用MEGA6.0軟件繪制菌株進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

1.4.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 采用自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀Bioscreen C儀器測(cè)定菌株AS-2的生長(zhǎng)曲線。以1%的接種量將其接種至LB培養(yǎng)基，混合均勻后取200μL于96孔板，并設(shè)置10個(gè)平行組。設(shè)置在環(huán)境溫度30℃，中等轉(zhuǎn)速下，每隔30min對(duì)波長(zhǎng)λ=600nm處的吸光光度值進(jìn)行測(cè)量。

1.5 脫硫條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在控制其他條件不變的情況下，分別選取不同初始 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、不同溫度（24、27、30、33、36℃）、 不 同 轉(zhuǎn) 速（120、140、160、180、200r·min-1）和不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）為變量設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)探究菌株AS-2脫硫效率的最佳條件。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中硫化物、硫酸鹽及硫單質(zhì)的濃度計(jì)算去除率。

1.6 對(duì)H2S氣體的去除效果

將150mL培養(yǎng)基加入500mL厭氧瓶中，并向厭氧瓶中充入500×106的H2S氣體，最后將富集24h的菌液按照3%的接種量接入培養(yǎng)基中，與33℃，160r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 24h。每隔 4h 取樣測(cè)定空白組與實(shí)驗(yàn)組瓶中剩余的H2S濃度，評(píng)價(jià)菌株AS-2去除H2S氣體的能力。檢測(cè)方法采用便攜式儀器復(fù)合式氣體檢測(cè)儀來(lái)確定，檢測(cè)范圍為0～500×106，分辨率為 0.01%。

1.7 檢測(cè)和分析方法

硫化物的測(cè)定方法采用亞甲基藍(lán)分光光度法（λ=650nm）；單質(zhì)硫的測(cè)定方法采用四氯化碳萃取-高效液相色譜（HPLC）[10]法（λ=240nm）對(duì)離心后的沉淀物進(jìn)行檢測(cè)；硫酸鹽的測(cè)量方法采用哈希DR2800便攜式分光光度計(jì)，使用SulfaVer 4試劑粉包法進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫硫菌株的篩選

本實(shí)驗(yàn)共篩得3株具有脫硫能力的株。經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序及生理生化實(shí)驗(yàn)（結(jié)果見(jiàn)表1），對(duì)比《伯杰明細(xì)菌鑒定手冊(cè)》得出這三株菌分別為：脫氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）AS-1，巴利阿里假單胞菌（Pseudomonas balearica）AS-2，和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）AS-3。

對(duì)篩選出的3株脫硫菌進(jìn)行脫硫效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)合各自的硫化物降解率和單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率，對(duì)比選出脫硫效果最佳的一株作為后續(xù)探究實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株。圖1為各菌株在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中硫化物及單質(zhì)硫濃度的變化規(guī)律。

表1 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical reaction of heterotrophic strains

圖1 各菌株脫硫過(guò)程各離子濃度變化Fig.1 Changes in ion concentration during desulfurization of strains

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，菌株TS-1將初始濃度為632.83mg·L-1的硫化物在5h時(shí)去除完全，其中0～2h菌株AS-1對(duì)硫化物的去除速率達(dá)到最大可達(dá)217.43mg·（L·h）-1，同時(shí)菌株 AS-1 在 3h 時(shí)單質(zhì)硫的濃度達(dá)到最大值，為357.18mg·L-1，此時(shí)的最大單質(zhì)硫生成率為56.44%。菌株AS-2最大硫化物去除速率略低于 AS-1，但也達(dá)到了 210.64mg·（L·h）-1，并且在4.5h時(shí)將硫化物全部去除；AS-2在3h時(shí)達(dá)到的最大單質(zhì)硫生成率為60.80%，此時(shí)濃度為390.48mg·L-1，明顯高于 AS-1。菌株 AS-3 的硫化物去除速率僅為 195.17mg·（L·h）-1，且在 5.5h 時(shí)去除率才達(dá)到100%；單質(zhì)硫的最大濃度為321.59mg·L-1，最大生成速率為52.00%，為3株菌中最低。除此以外，空白實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中硫化物在5h時(shí)的去除率僅為30.23%，且單質(zhì)硫濃度不超過(guò)89.34mg·L-1，對(duì)比說(shuō)明各菌株的脫硫能力顯著。

綜上所述，本文選取具有最大單質(zhì)硫生成率的AS-2作為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株。根據(jù)OD600與時(shí)間的關(guān)系繪制其生長(zhǎng)曲線，如圖2（a）所示；并對(duì)其進(jìn)行掃描電鏡實(shí)驗(yàn)觀察其具體形貌特征如圖2（b）所示，以及圖2（c）所示對(duì)其培養(yǎng)基內(nèi)剩余固體物質(zhì)進(jìn)行掃描電鏡實(shí)驗(yàn)確定單質(zhì)硫的形態(tài)學(xué)特征。

從圖2（a）可看出，0～24h為菌株的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，24～68h為短暫的靜止期，隨后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。掃描電鏡顯示菌株AS-2呈短桿狀，其單菌長(zhǎng)約463nm，寬1.11μm。對(duì)菌株脫硫產(chǎn)物進(jìn)行掃描電鏡實(shí)驗(yàn)可觀察到有明顯的多面體菱形小塊，表面雜志較多，呈凹凸不平狀[11]，經(jīng)能譜分析測(cè)的其含有較多的S、C和O元素，證明除單質(zhì)硫外菌株在脫硫過(guò)程中還生成了其他物質(zhì)，可能在硫化物濃度較低時(shí)，菌株會(huì)將單質(zhì)硫繼續(xù)氧化成更高價(jià)態(tài)的硫形式，如硫酸鹽等。

圖2 菌株AS-2及其脫硫產(chǎn)物的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain AS-2 and its desulfurization products

2.2 菌株脫硫條件優(yōu)化

根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株在初始濃度為650mg·L-1的培養(yǎng)基中，3h時(shí)單質(zhì)硫的生成率最高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以3h的單質(zhì)硫生成率和最終產(chǎn)物硫酸鹽轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)最佳脫硫條件的依據(jù)。

2.2.1 不同初始pH值 如圖3（a）所示為菌株AS-2在不同初始pH值條件下的脫硫效率及生長(zhǎng)情況。由于酸性環(huán)境會(huì)抑制菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，在初始pH值為5.0和6.0時(shí)菌株AS-2的OD600值較低，導(dǎo)致其脫硫效率也較低；當(dāng)初始pH值為中性或弱堿性時(shí)，菌株AS-2的OD600值明顯升高，尤其是初始pH值為7.0時(shí)，具有最高的單質(zhì)硫生成率和硫酸鹽轉(zhuǎn)化率，說(shuō)明中性環(huán)境更適于累計(jì)單質(zhì)硫，促進(jìn)硫酸鹽的轉(zhuǎn)化，該結(jié)論與林旭等人篩選的硫氧化細(xì)菌結(jié)論一致[12]。綜上所述選擇7.0為最佳初始pH值條件。

2.2.2 不同接種量 如圖3（b）所示為菌株AS-2不同接種量條件下的脫硫效率及生長(zhǎng)情況。從圖中可以看出，隨著接種量由1%增加至7%，菌株的OD600值逐漸升高，當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí)菌株的OD600值反而降低。其中，當(dāng)接種量為3%時(shí)菌株AS-2的單質(zhì)硫生成率和硫酸鹽轉(zhuǎn)化率為最大。原因可能是較低的接種量導(dǎo)致菌體數(shù)量過(guò)低，不利于對(duì)硫化物的高效降解；而過(guò)高的接種量會(huì)導(dǎo)致菌株之間相互競(jìng)爭(zhēng)，營(yíng)養(yǎng)物含量不足，從而降低菌株的脫硫效率。綜上所述選擇3%為最佳接種量條件。

2.2.3 不同轉(zhuǎn)速 如圖3（c）所示為菌株AS-2在不同轉(zhuǎn)速條件下的脫硫效率及生長(zhǎng)情況。

由圖3（c）可知轉(zhuǎn)速對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖情況并沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為140r·min-1和160r·min-1時(shí)菌株的OD600值略高于其他。其中當(dāng)轉(zhuǎn)速為160r·min-1時(shí)菌株具有較高的單質(zhì)硫生成率和硫酸鹽轉(zhuǎn)化率，原因可能是該轉(zhuǎn)速條件下氧氣的溶解和傳質(zhì)過(guò)程較為均衡[13]。隨著轉(zhuǎn)速的提升單質(zhì)硫的生成率和硫酸鹽的轉(zhuǎn)化率均開(kāi)始降低，但硫酸鹽的下降幅度大于單質(zhì)硫，原因可能為較高的轉(zhuǎn)速降低了氧氣的溶解度，使培養(yǎng)基內(nèi)氧含量降低。綜上所述選擇160r·min-1為最佳轉(zhuǎn)速條件。

2.2.4 不同溫度 如圖3（d）所示為菌株AS-2在不同培養(yǎng)溫度條件下的脫硫效率及生長(zhǎng)情況。

由圖3（d）可知，培養(yǎng)溫度對(duì)菌株OD600的影響較低，說(shuō)明菌株AS-2在24～36℃間均可穩(wěn)定生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)溫度為33℃時(shí)培養(yǎng)基中測(cè)得的單質(zhì)硫生成率高達(dá)72.13%。原因可能是33℃條件下不僅促進(jìn)了菌株AS-2的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)使菌株體內(nèi)的脫硫酶活性達(dá)到最大，從而提高了生物脫硫的反應(yīng)速率。綜上所述選擇33℃為最佳培養(yǎng)溫度條件。

圖3 菌株AS-2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Single factor experiment results of strain AS-2

2.3 對(duì)H2S去除效果實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳脫硫條件，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證菌株AS-2對(duì)H2S氣體的去除能力。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖4 菌株對(duì)H2S氣體的去除能力Fig.4 Ability of the strain to remove H2S gas

由圖4可知，接入菌株AS-2的實(shí)驗(yàn)組將初始濃度約為500×10-6的H2S氣體在 24h時(shí)降低至17.23×10-6，去除率為96.55%。對(duì)比無(wú)菌的空白組24h時(shí)去除率僅為11.70%。原因可能是生物脫硫時(shí)，H2S氣體首先經(jīng)歷了由氣相轉(zhuǎn)入液相的過(guò)程，溶于液體的H2S氣體在接觸到脫硫菌后，再次被菌株吸收氧化[13]。因此，空白對(duì)照組中H2S氣體濃度的減少，是因?yàn)樯倭康腍2S氣體溶于培養(yǎng)基，而并非被徹底去除。綜上所述可見(jiàn)菌株AS-2不僅可高效去除溶液中的硫化物，同樣具有較強(qiáng)的去除H2S氣體的能力。

3 結(jié)論

（1）從成都長(zhǎng)安垃圾填埋場(chǎng)的垃圾滲濾液硝化池中分離純化出3株具有脫硫能力的菌株。對(duì)比其脫硫效率得到一株均有較強(qiáng)脫硫能力的菌株AS-2，經(jīng)鑒定為巴利阿里假單胞菌（Pseudomonas balearica）。

（2）通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出菌株AS-2的最佳脫硫條件：初始pH值為7.0，接種量為3%，溫度為33℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r·min-1。在此條件下菌株AS-2對(duì)硫化物的去除率達(dá)72.13%，硫酸鹽的生成率達(dá)69.74%，較未優(yōu)化條件時(shí)提高11.33%。

（3）在優(yōu)化的條件下，將菌株AS-2接種至含有500×10-6H2S氣體的培養(yǎng)基中24h，對(duì)H2S的去除率可達(dá)95.66%，而無(wú)菌空白組去除率僅為11.70%，驗(yàn)證菌株AS-2確實(shí)具有較強(qiáng)的脫硫能力。