植物細(xì)胞分裂素氧化酶基因研究進(jìn)展①

馬銘賽,歐陽樂軍,李莉梅,王澤琛,肖榮,布梁灝,劉智超

(1.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000；2.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院/葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室，新疆 喀什 844000)

細(xì)胞分裂素(CK)是一類重要的植物激素，它們在調(diào)控植物生長發(fā)育及其逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮著決定性作用，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂，平衡主根與側(cè)根的生長，調(diào)節(jié)植物各個器官的發(fā)育等多種生理功能。細(xì)胞分裂素氧化酶(CKX)既能特異性催化細(xì)胞分裂素類異戊二烯側(cè)鏈的不飽和鍵，又能控制CK的合成與降解，穩(wěn)定植物體內(nèi)CK的含量，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可促進(jìn)內(nèi)源CK降解的關(guān)鍵酶。

目前，關(guān)于植物CKX的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用機(jī)理等方面，而關(guān)于其功能的研究報道較少。為研究CKX的功能，可通過克隆植物CKX基因、構(gòu)建植物表達(dá)載體，對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，觀察其在植物生長發(fā)育以及響應(yīng)逆境脅迫中的作用，進(jìn)而確定CKX的功能?，F(xiàn)階段，利用此方法研究CKX基因的功能已初見成效[1-3]。本文主要對植物CKX基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行綜述，提出可利用生物信息學(xué)方法預(yù)測CKX基因在植物生命活動中的作用機(jī)制。

1 CKX研究概述

1.1 CKX研究現(xiàn)狀

1971年P(guān)aces[4]首次在煙草髓組織培養(yǎng)物粗勻漿中檢測到CKX，同時發(fā)現(xiàn)粗勻漿可將標(biāo)記的異戊烯基腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)橄汆堰?。此后，研究者相繼在玉米、小麥、菜豆和蠶豆[5，6]等不同植物的不同組織中檢測到CKX。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CKX在植物中普遍以糖基化和非糖基化的形式存在[7]。CKX合成由CKX基因表達(dá)調(diào)控。

CKX在大多數(shù)植物中通常以家族的形式存在，且多種植物CKX編碼基因的完全序列以及表達(dá)序列標(biāo)簽已被鑒定。ZmCKX基因家族被鑒定出至少存在5個家庭成員(ZmCKX1—ZmCKX5)且它們均與玉米粒的早期發(fā)育有關(guān)；擬南芥AtCKX基因家族中已有7個基因被鑒定(AtCKX1—AtCKX7)且其氨基酸序列的相似性為34.3%～65.9%，其中AtCKX7氨基酸序列相似性最低；水稻OsCKX基因家族中已發(fā)現(xiàn)11個成員(OsCKX1—OsCKX11)。還有研究者研究了小麥、棉花、蘭花等[7-18]植物的CKX基因。此外，在低等生物念珠藻[19]中也發(fā)現(xiàn)了CKX基因。表1列舉了近年來關(guān)于不同植物CKX的研究情況。

表1 不同植物CKX的研究現(xiàn)狀統(tǒng)計

1.2 CKX的生理學(xué)功能

CKX在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著巨大的作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)CKX可通過影響植物配子的發(fā)育影響其產(chǎn)量。利用花粉專一啟動子識別CKX1，并構(gòu)建表達(dá)載體獲得轉(zhuǎn)基因玉米，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米中ZmCKX1的過量表達(dá)可導(dǎo)致雄性不育且可顯著降低花芽細(xì)胞分裂素的含量，從而使玉米的產(chǎn)量降低[20]；為了提高水稻的產(chǎn)量，Ashikari等發(fā)現(xiàn)OsCKX2表達(dá)量的減少可促進(jìn)花序組織中細(xì)胞分裂素的積累，使籽粒數(shù)量增加，進(jìn)而使水稻的產(chǎn)量增加[21]；Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)TaCKX2-1和TaCKX2-2在小麥幼穗和莖中過量表達(dá)時表達(dá)量與穗粒數(shù)呈正相關(guān)，進(jìn)而影響小麥的產(chǎn)量。

CKX可影響植物的生長發(fā)育進(jìn)程，為植物的抗逆研究奠定了基礎(chǔ)。在研究煙草時發(fā)現(xiàn)，老葉片中CKX基因的活性低于幼嫩葉片，間接證明CKX可延緩煙草的衰老，使煙草的生長發(fā)育進(jìn)程減慢[23]；測量生長發(fā)育期完全不同的兩種大豆的細(xì)胞分裂素含量以及CKX的活性，發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育進(jìn)程快的品種的CK含量較高且CKX的活性較低，生長發(fā)育進(jìn)程慢的則相反，揭示了CKX可延緩大豆的生長發(fā)育進(jìn)程[24]；比較轉(zhuǎn)AtCKX2煙草和野生型煙草，轉(zhuǎn)基因煙草根部和葉部CKX活性增強(qiáng)，細(xì)胞分裂素濃度降低，表型改變，生長遲緩，從而證明CKX可改變煙草的生長發(fā)育進(jìn)程[25,26]。Procházková等[27]利用參與細(xì)胞分裂素合成的ipt基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)老葉片中細(xì)胞分裂素含量升高，進(jìn)而延緩了葉片的衰老。

CKX在生物或非生物脅迫下的生長調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著一定的作用。把線蟲接種于感染線蟲的栽培花生和抗線蟲的野生型花生之后，發(fā)現(xiàn)感染線蟲的花生AsCKX表達(dá)量增高，抗線蟲的花生反之，從而驗證AsCKX酶在線蟲感染花生時發(fā)揮一定的作用[28]。Mytinova等[25,26]發(fā)現(xiàn)AtCKX2轉(zhuǎn)基因煙草植株在干旱或鹽脅迫下植株抗氧化酶的含量與野生型相比變化明顯，說明AtCKX2在非生物脅迫下對植物的生長具有一定的影響。

此外，CKX還可以通過影響植物組織中細(xì)胞分裂素的含量來調(diào)節(jié)植物的生長周期、植物地上與地下部分的生長、棉纖維初始化數(shù)目以及豌豆根瘤的形成等[29,30]。

2 CKX研究進(jìn)展

2.1 CKX在植物中的表達(dá)調(diào)控研究

CKX參與同種植物的不同組織的調(diào)控。在擬南芥中，CKX具有一定的表達(dá)特異性，其中，AtCKX1和AtCKX2主要在根尖中表達(dá)，AtCKX4集中在托葉、氣孔及根冠中表達(dá)，AtCKX5在根分生組織中表達(dá)效果明顯，AtCKX6則主要影響雌蕊的發(fā)育[6,23]。在玉米中，CKX的表達(dá)在時間和空間方面也存在著一定的差異性，通過研究玉米CKX發(fā)現(xiàn)ZmCKX2、ZmCKX3、ZmCKX4、ZmCKX5分別在成熟的雄花穗中、老葉中、未成熟的雄花穗中、未成熟穗中表達(dá)；在表達(dá)時間上，ZmCKX2僅在授粉完成后才開始表達(dá)，ZmCKX3、ZmCKX4、ZmCKX5在授粉前就已經(jīng)表達(dá)，如果ZmCKX5授粉后表達(dá)則活性下降[31]。而在草莓中，F(xiàn)vCKX4在幼果的生長過程中發(fā)揮著重要的作用，F(xiàn)vCKX5在根中高表達(dá)[15]。

植物激素也可影響CKX的表達(dá)調(diào)控。在大麥葉片中，外施10-4mol/L的細(xì)胞分裂素，CKX活性顯著提高[23]；赤霉素對擬南芥AtCKX影響很小，但是其合成抑制劑多效唑會使AtCKX3、AtCKX4和AtCKX6轉(zhuǎn)錄水平降低，脫落酸會使AtCKX1、AtCKX3、AtCKX4和AtCKX6表達(dá)效果下降，茉莉酸、表油菜素內(nèi)酯等植物激素也會影響擬南芥AtCKX的表達(dá)[12]。

2.2 利用基因克隆技術(shù)研究植物CKX的功能

植物克隆技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，對研究植物CKX的功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。余義和等[13]將同源克隆和RACE技術(shù)相結(jié)合，在“巨峰”葡萄中克隆出CKX3，并對其表達(dá)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CKX3在花序發(fā)育過程中表達(dá)量差異明顯，從而可對花序的生長發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。在對葡萄葉片用細(xì)胞分裂素6-BA 進(jìn)行處理后，CKX3的表達(dá)與細(xì)胞分裂素氧化酶的活性顯著升高；隨后，薛竟一[14]利用生物信息學(xué)知識鑒定得到葡萄的10條CKX序列并克隆其中7個CKX的cDNA全長，經(jīng)植物生長調(diào)節(jié)劑處理，獲得不同CKX在不同葡萄組織中的表達(dá)結(jié)果，對研究葡萄CKX的作用奠定了基礎(chǔ)；李嘉等將構(gòu)建成功的植物超表達(dá)載體BdCKX1-pCXSN利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化二穗短柄草，得到轉(zhuǎn)基因植株，在T1代轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)其地上部分生長狀況不容樂觀，猜測BdCKX1可能參與CK的代謝途徑，初步驗證了BdCKX1的功能[1]；王玲等運(yùn)用RACE技術(shù)克隆得到狗薔薇RcCKX5，分析其在狗薔薇不同組織中的表達(dá)情況，并用不同濃度的6-BA處理葉片，由此得到RcCKX5的表達(dá)量與6-BA濃度呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗證了此基因的功能[2]；張超利用生物信息學(xué)方法獲取桑樹MnCKX1—MnCKX6，并對其功能進(jìn)行預(yù)測，采用qRT-PCR技術(shù)分析MnCKX1—MnCKX6的時空表達(dá)，運(yùn)用基因編輯技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株并進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)MnCKX3和MnCKX4可能與桑樹花器官的發(fā)育有關(guān)，MnCKX1和MnCKX6可參與調(diào)控干旱和鹽脅迫，MnCKX2為雄花特異性基因，MnCKX5和MnCKX6可響應(yīng)外源細(xì)胞分裂素，這些可為今后桑樹性狀的分子改良奠定一定的基礎(chǔ)[3]。

吳云華等[32]對水稻OsCKX的重組載體pET-28a-CKO進(jìn)行構(gòu)建，為探索水稻OsCKX的功能以及更深層次的研究奠定了基礎(chǔ)；張晨等通過克隆得到了太子參的PhCKX，利用ABA和GA3對其進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過ABA處理PhCKX的表達(dá)量在生長發(fā)育的各個階段都出現(xiàn)不同程度的降低，而用GA3進(jìn)行處理則出現(xiàn)不同程度的增加，進(jìn)一步揭示了細(xì)胞分裂素可以影響水稻的生長發(fā)育[18]。為了驗證CKX對紫花苜蓿的影響，沙亞·海拉提通過克隆紫花苜蓿MsCKX，構(gòu)建植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302-MsCKX，得出紫花苜蓿MsCKX主要在植物的根和葉中表達(dá)，且MsCKX延緩了種子的萌發(fā)速率，提高了植物的耐鹽性和抗旱性[16]；李殷睿智[17]等克隆得到了蒺藜苜蓿MtCKX基因，并由此發(fā)現(xiàn)此基因過表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因擬南芥中細(xì)胞分裂素的含量降低，間接證明了CKX可對植物的生長發(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

3 結(jié)論及展望

目前，關(guān)于CKX的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及作用機(jī)理等方面的研究取得了一些進(jìn)展，為進(jìn)一步研究CKX的功能奠定了良好基礎(chǔ)。受研究技術(shù)的限制，人們對植物CKX功能的研究進(jìn)程仍然比較慢。隨著基因克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，研究者可通過克隆植物CKX，觀察其對植物生長發(fā)育的影響，間接獲得CKX的功能。此方法已經(jīng)初見成效，但是由于存在效率低、操作復(fù)雜等問題，對CKX的功能揭示還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

近年來，隨著生物信息學(xué)以及基因組測序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合已經(jīng)測序完成的植物全基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件對其基因組序列進(jìn)行比對、分析，獲取CKX的遺傳、突變、編碼、調(diào)控等信息，并比對其氨基酸序列，獲取其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、功能以及相互關(guān)系等信息，預(yù)測CKX在生物物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)移、信號傳導(dǎo)等生命活動中的作用機(jī)理。利用最新發(fā)展的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)分析CKX序列，快速構(gòu)建具有篩選標(biāo)記的CRISPR載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，通過突變體后代的表型確定CKX的功能，為快速驗證植物CKX在植物中的功能提供了一個強(qiáng)有力的工具。目前，關(guān)于CKX的研究主要集中在農(nóng)作物方面，對其在林木植物以及觀賞植物中的功能研究極少，今后可加強(qiáng)其在此類植物中的功能研究。