苦參軟膏對(duì)小鼠濕疹模型的治療作用及免疫機(jī)制分析*

蔡思龍 段亞星

（1.武漢科技大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430081；2.湖北省陽新縣第三人民醫(yī)院，湖北 陽新435200）

濕疹特征為紅斑和瘙癢性皮疹，影響全球國(guó)家約20%的兒童［1-2］。濕疹誘因復(fù)雜，不僅包括遺傳和環(huán)境因素，還包括免疫和皮膚細(xì)胞的特征。對(duì)外來抗原的超敏反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的異?；顒?dòng)是濕疹的主要原因，眾多炎癥因子在濕疹中起關(guān)鍵作用［3-4］。Notch1是Notch家族的重要成員，能輔助各種CD4+T細(xì)胞的分化，包括TH1、TH2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）［5］。研究表明，抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路可阻斷TH1和TH2極化。過量表達(dá)Notch1活性形式的轉(zhuǎn)基因小鼠在胸腺和脾臟中具有增高的CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，并且能增加自身免疫性皮炎的發(fā)病率［6］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是一種多效抗炎細(xì)胞因子，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化有關(guān)。人和小鼠CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可在TGF-β1刺激后從幼稚T細(xì)胞產(chǎn)生［7-9］?？鄥④浉嘤煽鄥⒖倝A組成，具有清熱燥濕，殺蟲止癢的功效?？鄥④浉嗑植拷o藥可避免胃腸道刺激，降低血液中的藥物濃度，減少副作用，還可以提高患者的依從性［10］。多項(xiàng)研究表明［11］，苦參軟膏可抑制過敏反應(yīng)，但抗炎作用尚不清楚。本研究擬探討苦參軟膏對(duì)小鼠濕疹模型的治療作用及免疫機(jī)制，為濕疹的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/cJ小鼠80只購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2016-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2016-0057。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：00182316。所有的小鼠于無特定病原體的環(huán)境中喂養(yǎng)：溫度（21±3）℃、濕度（55±3）%、12 h光照-黑暗循環(huán)（光照6∶00～18∶00），自由獲取水及飼料。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武漢科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，試驗(yàn)嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

1.2 試藥與儀器 苦參軟膏（上海寶龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)180319）；地塞米松軟膏（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)180126）；2，4-二硝基氯苯（DNCB）、檸檬酸鈉緩沖液（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)147548、401967）；SYBR-Green Supermix試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺試劑盒（上海碩美生物科技有限公司，批號(hào)PK00810、AB00317）；TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)ac6947）；Notch1、TGF-β1一抗（上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)171209、171216）；辣根過氧化物酶綴合的Notch1、TGF-β1二抗（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)180118、180207）；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）Elisa試劑盒（伊艾博武漢科技股份有限公司，批號(hào)180326、171229、180415）；磷酸緩沖液（PBS）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)47458）；Zeiss Axio成像儀、NanoDrop 2000核酸定量?jī)x、NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；QuantStudio 6 Flex Realtime PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.3 分組與造模 按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：對(duì)照組、模型組、地塞米松組（0.35 g/kg）、苦參軟膏組（0.35 g/kg），每組20只，雌雄各半。對(duì)照組、模型組、地塞米松組、苦參軟膏組小鼠于造模前1 d，在背部選取1.5 cm×1.5 cm面積的皮膚區(qū)域剃毛，隔日剃毛區(qū)域外涂50 μL的5%2硝基氯苯（DNCB）第1次致敏，1周后剃毛區(qū)再次去毛，次日外涂1%DNCB 100 μL激發(fā)，第2次致敏，每周致敏1次，連續(xù)4周，第4周致敏結(jié)束。對(duì)照組小鼠背部皮膚操作同模型組、地塞米松組、苦參軟膏組，但不外涂DNCB［12］。

1.4 給藥方法 致敏結(jié)束3 d后取小鼠背部皮膚進(jìn)行給藥干預(yù)試驗(yàn)。地塞米松組、苦參軟膏組小鼠剃毛區(qū)外敷相應(yīng)藥物，并用六層醫(yī)用小紗布覆蓋創(chuàng)面（2 cm×2 cm），予醫(yī)用紙膠帶包扎固定，每天換藥1次，對(duì)照組、模型組小鼠剃毛區(qū)不予處理，持續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本采集與監(jiān)測(cè) 1）小鼠濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。制作小鼠濕疹皮膚組織HE染色切片，計(jì)數(shù)視野內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)目。2）小鼠濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定。根據(jù)制造商的說明，用TRIzol試劑從小鼠濕疹皮膚組織中分離總RNA。在測(cè)量RNA濃度后，NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性，根據(jù)制造商的方案將3 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR-Green Supermix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件如下：95℃10秒和60℃32秒，40個(gè)循環(huán)。β-肌動(dòng)蛋白為各靶基因的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCq方法定量，一式3份測(cè)量Notch1、TGF-β1表達(dá)水平，并計(jì)算平均值，β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。β-肌動(dòng)蛋白（96 bp）的引物是正向：5′-GATCAGCAGCAG AGTATG-3′（F）和反向：5′-AGAGTGTACGCACTA-3′（R）；Notch1（105 bp）的引物是正向：5′-CAGGGTTCCACTTCCAAACA-3′（F）和反向：5′-TGGAGATCAGC TCCCGTATAA-3′（R）；TGF-β1（85 bp）的引物是正向：5′-GGAGGAUGAUACAAGUUCA-3′（F）和 反 向 ：5′-GAGGCUGCCAUAUCUUUGA-3′（R）。3）小鼠濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。使用兩步Envision plus染色技術(shù)進(jìn)行Notch1、TGF-β1的免疫組織化學(xué)染色。制作4 μm厚的小鼠濕疹皮膚組織切片，然后將該部分脫石蠟并分別用二甲苯和梯度乙醇再水合，將樣本在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中孵育2 min，使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。將樣本與兔抗人小鼠濕疹皮膚組織Notch1（1∶2 500稀釋）、TGF-β1（1∶2 500稀釋）一抗于4 ℃溫育過夜。用磷酸緩沖液（PBS）洗滌樣品，在室溫下與辣根過氧化物酶綴合的二抗Notch1、TGF-β1孵育30 min，并再次用PBS洗滌。然后將樣品進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺著色，并用20%蘇木精復(fù)染在Zeiss Axio成像儀上成像染色。通過計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的陽性細(xì)胞數(shù)量來進(jìn)行定量，對(duì)于5個(gè)圖像，計(jì)算5個(gè)原始計(jì)數(shù)的平均值，并表示每個(gè)圖表的一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，在至少5個(gè)視野中使用半定量方法對(duì)染色的組織切片進(jìn)行評(píng)分，染色標(biāo)準(zhǔn)為0分表示＜5%陽性染色細(xì)胞（陰性表達(dá)），1分表示5%～20%陽性染色細(xì)胞（弱表達(dá)），2分表示21%～50%陽性染色細(xì)胞（中度表達(dá)），3分為＞50%陽性染色細(xì)胞（強(qiáng)表達(dá)）。4）小鼠濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的緩沖液制備小鼠濕疹皮膚組織勻漿，在4℃以12 000 r/min離心20 min后，收集上清液，用ELISA法測(cè)定IL-2、IL-6、TNF-α蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明顯下降（P＜0.05）；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平相近（P＞0.05）。

表1 各組小鼠皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組地塞米松組苦參軟膏組n 20 20 20 20炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/mm2）68.29±10.45 144.71±14.45*86.62±13.24△89.88±13.14△

2.2 各組小鼠皮膚組織HE染色比較 見圖1。對(duì)照組皮膚結(jié)構(gòu)正常，見復(fù)層鱗狀上皮，有角化物，真皮層無炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組表皮壞死，見瘢痕組織顆粒層、棘層增厚，真皮層血管充血擴(kuò)張、水腫伴大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；地塞米松組、苦參軟膏組仍可見中性細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，但數(shù)量明顯較模型組減少，表皮結(jié)構(gòu)清晰趨于正常。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色比較（400倍）

2.3 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1mRNA水平相近（P＞0.05）。

表2 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA水平比較（±s）

表2 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA水平比較（±s）

組 別n Notch1 mRNA TGF-β1 mRNA對(duì)照組模型組地塞米松組苦參軟膏組20 20 20 20 1.46±0.57 5.75±0.37*2.05±0.66△2.11±0.60△1.86±0.57 6.77±0.46*3.45±0.48△3.45±0.67△

2.4 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白水平比較 見表3，圖2～圖3。與對(duì)照組比較，模型組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白水平相近（P＞0.05）。免疫組化法下，Notch1、TGF-β1陽性表達(dá)為棕褐色，Notch1、TGF-β1陽性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。

表3 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白水平比較（±s）

表3 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白水平比較（±s）

組 別n Notch1TGF-β1對(duì)照組模型組地塞米松組苦參軟膏組20 20 20 20 0.96±0.63 6.65±0.59*3.65±0.84△3.59±0.62△1.23±0.54 8.96±0.48*4.19±0.48△4.25±0.49△

圖2 各組小鼠濕疹皮膚組織Notch1表達(dá)（DAB染色，400倍）

圖3 各組小鼠皮膚組織Notch1、TGF-β1蛋白水平（DAB染色，400倍）

2.5 各組小鼠濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平比較 見表4。與對(duì)照組比較，模型組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平相近（P＞0.05）。

表4 各組小鼠濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平比較（ng/g，±s）

表4 各組小鼠濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平比較（ng/g，±s）

組別對(duì)照組模型組地塞米松組苦參軟膏組n 20 20 20 20 IL-2 78.98±16.32 326.21±19.69*208.36±15.32△213.41±16.01△IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69*307.67±19.32△315.41±23.41△TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34*432.39±15.39△446.98±18.95△

3 討 論

近年來，濕疹的治療主要集中在使用抗組胺藥物和局部使用皮質(zhì)類固醇的對(duì)癥治療。然而，長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇會(huì)導(dǎo)致其顯著的副作用，包括皮紋，色素變化和皮膚萎縮［13］。因此，迫切需要開發(fā)用于濕疹的新的有效療法。中草藥在治療濕疹方面具有悠久的歷史，在包括嬰兒在內(nèi)的各年齡段中具有相對(duì)較少的副作用?？诜?或局部給藥，如方風(fēng)通圣丸，丹皮酚霜等軍具有良好的療效?？鄥?，為豆科植物苦參的干燥根，春、秋二季采挖，除去根頭和小支根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。其性苦、寒，有清熱燥濕、殺蟲、利尿之功，用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風(fēng)等病癥，外治滴蟲性陰道炎［14-15］。據(jù)報(bào)道，苦參具有抗中毒作用，抗炎和抗腫瘤活性［16］。本次研究發(fā)現(xiàn)：模型組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明升高；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平明顯下降；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)水平相近。以上結(jié)果提示苦參軟膏能明顯減輕小鼠濕疹炎癥反應(yīng)，這與病理學(xué)結(jié)果中苦參軟膏組仍可見中性粒細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，但數(shù)量明顯較模型組減少，表皮結(jié)構(gòu)清晰趨于正常相符合。

Notch信號(hào)在代謝和炎癥過程中起關(guān)鍵作用。在巨噬細(xì)胞中，Notch1信號(hào)通過干擾素調(diào)節(jié)因子8（IRF8）和核因子-κB轉(zhuǎn)錄途徑促進(jìn)促炎極化，而在脂肪細(xì)胞中，Notch1信號(hào)抑制白色脂肪組織褐變和能量消耗并促進(jìn)胰島素抵抗。Notch1是炎癥過程中的關(guān)鍵信號(hào)分子，可誘導(dǎo)許多促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生［17-18］。阻斷Notch1信號(hào)傳導(dǎo)可部分減輕由DNCB誘導(dǎo)Th1過敏反應(yīng)，此外研究證明Notch1下調(diào)可導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子在DNCB誘導(dǎo)的小鼠模型中表達(dá)下降。TGF-β1是Notch的下游細(xì)胞因子，TGF-β1的激活已被證明在炎癥中起關(guān)鍵作用，其通過調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子，趨化因子和黏附分子表達(dá)。過量的TGF-β1可以通過整合TLR家族成員及其相關(guān)途徑的活性來增強(qiáng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TLR家族蛋白是一類在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)［19-20］。TLR4是TLR家族的成員，其在濕疹的炎癥反應(yīng)中起重要作用。本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白明顯升高；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白明顯降低；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白水平相近。以上結(jié)果說明，苦參軟膏能抑制Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制小鼠濕疹模型皮膚炎癥反應(yīng)。

本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，模型組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯升高；與模型組比較，地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯降低；地塞米松組、苦參軟膏組濕疹皮膚組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平相近。而 L-2、IL-6、TNF-α 是Notch1信號(hào)通路的下游細(xì)胞因子，這也提示，苦參軟膏能抑制Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制小鼠濕疹模型皮膚炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與抑制IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，苦參軟膏能抑制小鼠濕疹模型皮膚炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與苦參軟膏抑制Notch1、TGF-β1 mRNA、蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。