加味溫膽湯對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代謝和超微結(jié)構(gòu)的影響*

張麗麗 李 雁 李 龍

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

心力衰竭是缺血性心臟病，臨床主要表現(xiàn)為心功能障礙和呼吸困難，病理特點(diǎn)是心肌細(xì)胞受損和凋亡。本病遷延難愈、預(yù)后極差，發(fā)病率、致殘率、病死率均處于較高水平，患者生命健康遭受?chē)?yán)重威脅［1］。多數(shù)心血管疾病末期表現(xiàn)為心力衰竭，其中急性心肌梗死后心力衰竭發(fā)生率高達(dá)60%，為心衰首要病因［2］。心肌過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）和心肌鈣蛋白（cTnI）是心肌細(xì)胞受損的重要標(biāo)志物，能靈敏反映心肌能量代謝狀況，對(duì)于判斷和預(yù)測(cè)心衰療效具有積極意義［3-4］。心肌能量代謝藥物曲美他嗪在治療初期對(duì)于心梗后心衰雖具有較好的治療效果，但后期作用不明顯、預(yù)后依然較差［5］。加味溫膽湯具有健脾祛痰化飲、活血祛瘀之功效，可針對(duì)心衰的病因病機(jī)對(duì)癥治療。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示加味溫膽湯能從根本上改善心肌能量代謝狀況和心肌超微結(jié)構(gòu)，并具有療效好、副作用少、維持時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)［6-7］，但目前仍缺少對(duì)心梗致心衰病能量代謝和心肌超微結(jié)構(gòu)療效和作用機(jī)制的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本課題組通過(guò)對(duì)HFMI大鼠模型給藥治療評(píng)估加味溫膽湯對(duì)大鼠心肌能量代謝水平和心肌超微結(jié)構(gòu)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取12周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，與湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司共同飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)體檢所選大鼠均身體健康、心臟功能正常，預(yù)計(jì)生存期大于6個(gè)月，體質(zhì)量（200±20）g。造模前適應(yīng)性籠養(yǎng)5 d，溫度（25±2）℃，濕度45%～70%，飼料符合《GB14924.3-2010》標(biāo)準(zhǔn)，飲用水為純凈水，實(shí)驗(yàn)周期8～10周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

加味溫膽湯，組成：法半夏、陳皮各9 g，茯苓12 g，甘草、膽星各3 g，竹茹、蒼術(shù)、延胡索、丹參、川芎、赤芍各6 g，牛膝12 g，黃芪、節(jié)菖蒲各6 g。由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室加工而成，制作工藝為標(biāo)準(zhǔn)制干浸膏，每克干浸膏相當(dāng)于生藥8.62 g。曲美他嗪片（瑞陽(yáng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066534）。

1.3 試劑與儀器

氯化鈉（分析純，CAS：7647-14-5，江蘇科倫多食品配料有限公司）；苯巴比妥注射液（福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20057384）；青霉素注射液［石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13021632］。大鼠cTnI、PGC-1α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自廣銳生物和上海滬震生物科技有限公司；10%甲醛溶液（南京化學(xué)試劑股份有限公司）。Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀：賽默飛；LS-20ECG動(dòng)物心電圖記錄分析儀（北京拜安吉科技有限公司）；S5獸用B超機(jī)［大為醫(yī)療（江蘇）有限公司］；JIDI-4D-WS離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；奧林巴斯生物顯微鏡CX43（上海）；HX-300S小型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；Leica RM2235石蠟包埋切片機(jī)（徠卡）；大小鼠脈搏血氧呼吸監(jiān)護(hù)儀（玉研儀器）；Latheta LCT 200小動(dòng)物CT機(jī)（日立阿洛卡）；BSA124S天子天平（賽多利斯）；-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）。

1.4 模型制備

選取大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)表法分為兩組，每組15只。造模組通過(guò)手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性心肌梗大鼠死模型：以40 mg/kg劑量腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，手術(shù)取仰臥位，術(shù)前在大鼠頸、胸部常規(guī)消毒、備皮，于大鼠心臟端連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)心電指數(shù)，從頸部開(kāi)始，沿氣管術(shù)方向做3 cm縱切口，鈍性分離頸部肌肉組織，暴露氣管后插管，連接呼吸機(jī)；用無(wú)創(chuàng)性線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD），以結(jié)扎部位遠(yuǎn)端心肌變白、心搏減弱、心電圖出現(xiàn)ST段弓背抬升為急性心肌梗死成功標(biāo)志。假手術(shù)組完成穿刺但并未結(jié)扎左前降支。兩組操作完成后排凈胸腔氣體，縫合切口并消毒，術(shù)后肌肉注射20萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染。術(shù)后飼養(yǎng)72 h，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行心衰評(píng)分，若結(jié)扎造模組大鼠符合Framingham慢性心衰診斷標(biāo)準(zhǔn)證明造模成功，兩組大鼠術(shù)后心衰評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。假手術(shù)組作為篩選造模組所用的對(duì)照組，不計(jì)入后續(xù)分組研究。

表1 兩組大鼠術(shù)后72 h Framingham慢性心衰評(píng)分結(jié)果比較（分，±s）

表1 兩組大鼠術(shù)后72 h Framingham慢性心衰評(píng)分結(jié)果比較（分，±s）

符合兩項(xiàng)主證或主、次證各1項(xiàng)或次證超過(guò)3項(xiàng)，F(xiàn)ramingham評(píng)分大于1.5分

組別造模組假手術(shù)組n 2～3分 ＞3分15 15 0～1分0 12 1.5～2分10 3 5 0 0 0

1.5 給藥方法

術(shù)后72 h將造模成功的15只大鼠隨機(jī)分為3組，各5只。模型對(duì)照組給予生理鹽水4 mL/kg灌胃，每日1次；曲美他嗪組給予曲美他嗪溶液10 mg/kg灌胃；中藥組加味溫膽湯10 mg/kg灌胃。每日9∶00～10∶00間灌胃給藥，持續(xù)4周，每周對(duì)大鼠稱(chēng)體質(zhì)量。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 大鼠心功能檢測(cè) 分別在給藥前（術(shù)后72 h）、給藥后4周采用小動(dòng)物多普勒彩超對(duì)3組大鼠的心功能指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量。腹腔注射2.0%苯巴比妥進(jìn)行麻醉，仰臥位固定，于大鼠左胸前乳頭肌前對(duì)左室進(jìn)行掃描，探頭頻率7～15 MHz，測(cè)量左室舒張末容積（LEDV）、左室收縮末容積（LES），左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LEDVLES）×100%/EDV，即大鼠每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，LVEF正常值＞50%。

1.6.2 大鼠心肌能量代謝因子檢測(cè) 在給藥前（術(shù)后72 h）、給藥后4周，麻醉大鼠并在鼠尾靜脈抽取靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，將血清標(biāo)本置于-80℃超低溫冰箱凍存待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用雙抗夾心法測(cè)定大鼠心肌能量代謝因子（血清cTnI、PGC-1α）的濃度，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD（吸光度值）并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出血清蛋白濃度，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。

1.6.3 大鼠心肌超微機(jī)構(gòu)完整性（MUS）評(píng)分方法 在第4周末次給藥后采血，腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，快速開(kāi)胸腔、剪開(kāi)心包，取出心臟，用生理鹽水溶液反復(fù)沖洗心臟至溶液變清無(wú)血液，將心臟浸入10%甲醛溶液中，經(jīng)橫斷面剔除心臟左室中部組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、修片、切片、裱片、烤片后進(jìn)行HE染色（核染）和Masson染色（纖染），染色后心肌細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維呈藍(lán)色。心肌超微結(jié)構(gòu)完整性評(píng)分：1分為心肌細(xì)胞排列整齊，心肌小動(dòng)脈周?chē)靶募〖?xì)胞間隙可見(jiàn)少許膠原纖維；2分為心肌結(jié)構(gòu)正常，但心肌膠原增多；3分為心肌細(xì)胞輕微水腫，心肌膠原少量沉積于心肌組織、小動(dòng)脈附近；4分為心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，心肌組織及小動(dòng)脈周?chē)休^多膠原沉積，并有向心肌細(xì)胞間隙伸展的趨勢(shì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0軟件對(duì)研究資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)兩組資料配對(duì)比較采用單因素方差分析，組間計(jì)量資料（）配對(duì)比較采取t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料（%）做χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HFMI大鼠心功能比較

見(jiàn)表2。治療后，中藥組和曲美他嗪組大鼠心功能指標(biāo)LVEF、LES增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且治療后中藥組LVEF高于曲美他嗪組，LES低于曲美他嗪組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組HFMI大鼠LVEF、LES數(shù)值比較（%，±s）

表2 各組HFMI大鼠LVEF、LES數(shù)值比較（%，±s）

與模型對(duì)照組治療后比較，*P＜0.05；與曲美他嗪組比較，△P＜0.05。下同

組別 時(shí)間LVEF LES中藥組（n=5）曲美他嗪組（n=5）模型對(duì)照組（n=5）治療前治療后治療前治療后治療前治療后54.39±4.18 75.26±5.27*△54.28±4.24 66.89±5.06*54.43±4.26 47.18±4.49△24.37±4.12 35.25±5.22*△24.28±3.54 46.56±5.01*24.46±3.78 37.75±4.46△

2.2 各組HFMI大鼠心肌能量代謝指標(biāo)比較

見(jiàn)表3。治療前，3組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療4周后，中藥組、曲美他嗪組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均較治療前顯著降低（P＜0.05），模型對(duì)照組上述指標(biāo)水平則與治療前相比有提升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后中藥組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均低于曲美他嗪組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較（±s）

表3 各組HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較（±s）

組別中藥組（n=5）曲美他嗪組（n=5）模型對(duì)照組（n=5）時(shí)間治療前治療后治療前治療后治療前治療后cTnI（μg/L）65.64±4.02 54.23±3.27*△65.56±4.17 59.55±3.85*65.61±4.11 67.89±3.96△PGC-1α（ng/mL）8.17±1.24 4.28±0.75*△8.24±1.08 6.36±0.82*8.21±1.19 9.02±2.02△

2.3 各組HFMI大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較

見(jiàn)表4，圖1～圖2。治療4周后，各組大鼠血清MUS比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）：中藥組＜曲美他嗪組＜對(duì)照組。

表4 各組HFMI大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)完整性評(píng)分比較（分，±s）

表4 各組HFMI大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)完整性評(píng)分比較（分，±s）

組別n 5 5中藥組曲美他嗪組1 2 MUS 5模型對(duì)照組.28±0.25△.43±0.36*3.56±0.32△

圖1 各組大鼠治療4周后心肌組織形態(tài)學(xué)（HE染色，100倍）

圖2 各組大鼠治療4周后心肌組織形態(tài)學(xué)（Masson染色，100倍）

3 討 論

急性心肌梗死、心肌炎、高血壓病、高脂血病、糖尿病等心血管疾病均能誘發(fā)心力衰竭（心功能障礙），其中急性心肌梗死導(dǎo)致的心力衰竭占60%～70%，是最為主要的病因，這與急性心肌梗死可對(duì)心肌細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，繼而引發(fā)心肌能量代謝紊亂、心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有密切關(guān)聯(lián)［10-12］。大量研究提示，線(xiàn)粒體是參與心肌能量代謝的重要細(xì)胞器，可生成關(guān)鍵調(diào)控因子PGC-1α，一方面，PGC-1α參與糖脂能量代謝，可維持血氧供應(yīng)正常水平、抑制能量代謝紊亂，但PGC-1α濃度過(guò)高可誘發(fā)糖脂代謝紊亂［13］；另一方面由PGC-1α主導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路也有助于修復(fù)和保護(hù)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而有效預(yù)防心室重構(gòu)、減少再灌注損傷。此外，cTnI水平變化對(duì)于心肌損傷極為敏感（特異性達(dá)91%、敏感性達(dá)100%）［14］，cTnI水平升高可提升心肌損傷，且數(shù)值越高，損傷越大。上述兩項(xiàng)指標(biāo)均有助于反映心肌能量代謝和心肌超微結(jié)構(gòu)。針對(duì)上述病因機(jī)制，西醫(yī)從優(yōu)化心肌能量代謝入手應(yīng)用了一些西藥，取得了不錯(cuò)的成果，如曲美他嗪就是一種能夠優(yōu)化心肌能量代謝的藥物，該藥有助于抑制氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡。但臨床數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用曲美他嗪治療心力衰竭雖然能夠在治療初期（大鼠心衰后1～2周）取得較大進(jìn)展，但在后期（大鼠心衰后4～6周）的療效不夠明顯，特別是對(duì)于心肌超微結(jié)構(gòu)的改善不足，這也說(shuō)明還要繼續(xù)尋找更加安全有效的用藥方案。

中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸為“心痹”“心水”“心咳”范疇，認(rèn)為情志不調(diào)、飲食不節(jié)為外因，心腎陽(yáng)虛和氣滯血瘀為內(nèi)因。加味溫膽湯具有健脾祛痰化飲、活血祛瘀之功效，可針對(duì)心梗后心衰患者的病機(jī)病因?qū)ΠY治療。從組方上分析，茯苓歸心、肺、脾、腎經(jīng)，可利水滲濕、健脾寧心，為君藥，主治肺水腫、心悸、胸悶氣喘、失眠、煩躁，法半夏辛溫，燥濕化痰，和胃止嘔；臣藥竹茹、陳皮、枳實(shí)，竹茹甘而微寒，清熱化痰，除煩止嘔。茯苓健脾滲濕，杜生痰之源；生姜、大棗協(xié)調(diào)脾胃，生姜兼制法半夏毒性。使藥甘草協(xié)調(diào)諸藥。歸納全方，法半夏、陳皮、生姜偏溫，竹茹、枳實(shí)偏涼，溫涼兼進(jìn)，令全方不寒不燥，理氣化痰以和胃，胃氣和降則膽郁得舒，痰濁得去則膽無(wú)邪擾，如是則復(fù)其寧謐，諸癥自愈。現(xiàn)代藥理研究則表明，加味溫膽湯中富含黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)等化合物，其中甘草的甘露醇具有利尿功效；多糖類(lèi)化合物可降壓降糖、調(diào)節(jié)免疫力；皂苷和黃酮類(lèi)成分則具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、護(hù)肝的藥理活性。此外，從生物學(xué)角度，加味溫膽湯治療心衰的機(jī)制還包括β淀粉樣蛋白（Aβ）清除與抗神經(jīng)炎癥、調(diào)控脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗、保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)心肌重構(gòu)和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡等。

本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示，治療后中藥組大鼠心功能指標(biāo)（LVEF）、心肌能量代謝因子（血清cTnI、PGC-1α）的改善水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：中藥組優(yōu)于曲美他嗪組，曲美他嗪組優(yōu)于對(duì)照組。此外，治療4周后，各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)完整性評(píng)分比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：中藥組＜曲美他嗪組＜對(duì)照組。表明加味溫膽湯對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌能量代謝具有促進(jìn)作用，對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)的完整性具有保護(hù)作用，并能有效改善大鼠的心功能，較曲美他嗪等西藥具有優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)。