從免疫炎性損傷角度探討5種清熱解毒藥物抗流感的機(jī)制及其臨床意義*

李雅莉 徐紅日 曹鴻云 王虹虹 程 淼 王成祥李 猛 劉國(guó)星 劉 暢 劉 通 韓思維

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；4.陜西省中醫(yī)院，陜西 西安 710003）

流行性感冒，可參照中醫(yī)時(shí)行感冒辨證論治。自2009年新型甲型H1N1流感大流行以來，治療流感的新型藥物與疫苗的研究受到越發(fā)廣泛的關(guān)注。近年來開展了大量的中醫(yī)藥治療流感的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了多種具有顯著抗流感作用的單味中藥及中藥復(fù)方［1］，證明了中醫(yī)藥治療流感的作用不僅能直接抗流感病毒［2-4］，還可以調(diào)節(jié)流感病毒感染機(jī)體的免疫功能［5-6］。

眾所周知，流感病毒感染機(jī)體后可導(dǎo)致急性免疫炎性損傷。感染免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的炎性細(xì)胞因子參與其中。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等為代表的促炎性細(xì)胞因子的過度釋放可導(dǎo)致靶器官嚴(yán)重的炎性損傷，引發(fā)一系列臟器功能損傷，甚至多臟器功能衰竭。前期研究中發(fā)現(xiàn)，筆者所在醫(yī)院治療流感的有效處方益氣清瘟解毒合劑所含清熱解毒中藥在流感病毒感染后導(dǎo)致的急性外感熱病的極期，能夠清除炎性細(xì)胞因子，并截?cái)嗯まD(zhuǎn)，證實(shí)了急性外感熱病極期把住氣分關(guān)的重要性，這有利于防止“逆?zhèn)餍陌钡任Ｖ刈C候（并發(fā)癥）的發(fā)生，同時(shí)有利于縮短病程［7-8］。清熱解毒代表藥物如黃芩、板藍(lán)根、白頭翁、虎杖、白花蛇舌草在流感病毒感染不同時(shí)相各自發(fā)揮什么樣的免疫調(diào)節(jié)作用？其作用強(qiáng)度分別如何？上述清熱解毒代表藥物抗流感的作用在流感整個(gè)病程中的哪一時(shí)相各自發(fā)揮得最好？為進(jìn)一步探討和回答上述問題，本課題組設(shè)計(jì)和完成了相關(guān)研究?，F(xiàn)將其研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/cAnN小鼠，動(dòng)物級(jí)別為SPF/VAF，雄性，體質(zhì)量18～22 g，共224只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。購(gòu)進(jìn)動(dòng)物后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試藥與儀器 黃芩、板藍(lán)根、白頭翁、虎杖、白花蛇舌草，5種藥物采用水煮提取工藝制成顆粒劑，制造工藝由北京康仁堂藥業(yè)有限公司協(xié)助完成。藥物顆粒量及含生藥量情況：黃芩1 g，相當(dāng)于飲片量10 g；板藍(lán)根1 g，相當(dāng)于飲片量10 g；白頭翁0.5 g，相當(dāng)于飲片量10 g；虎杖0.5 g，相當(dāng)于飲片量10 g；白花蛇舌草1 g，相當(dāng)于飲片量20 g。乙醚、0.9%氯化鈉注射液（中國(guó)大冢制藥有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒，購(gòu)于尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司。YX型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物潔凈柜（北京文慧凈化設(shè)備廠）；電子天平（JA3003，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；低溫離心機(jī)（Heraeus Labofuge 400R）；微量可調(diào)移液器（DRAGON）；組織勻漿機(jī)；酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，THERMO）。

1.3 病毒株 流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1），由教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病實(shí)驗(yàn)室提供。雞胚傳代后，血凝滴度為1∶512，小鼠LD50為10-5.4，-75℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分組與造模 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芩組、板藍(lán)根組、白頭翁組、虎杖組、白花蛇舌草組，每組32只。各組按流感病毒感染后第1日、3日、5日、7日不同時(shí)相隨機(jī)分為4小組，每小組8只。造模方法：用乙醚輕度麻醉小鼠后，空白對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液滴鼻，每次25 μL。其余各組以25 μL FM1株病毒液滴鼻，感染濃度為10-4。

1.5 給藥方法 感染流感病毒30 min后給藥，按標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量換算成小鼠的每日用藥劑量，每日灌胃1次，每次給藥0.1 mL/10 g；正?？瞻捉M以及病毒感染模型對(duì)照組根據(jù)體質(zhì)量灌服等量0.9%氯化鈉注射液，每日灌胃1次，每次給0.9%氯化鈉注射液0.1 mL/10 g。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 于感染流感病毒后第1日、3日、5日、7日摘眼球放血處死小鼠，留取小鼠血液，分離血清，-20℃冰箱中保存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IFN-γ含量。檢測(cè)程序按照試劑盒說明書進(jìn)行。以A450值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)小鼠血清的A450值計(jì)算出相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間以及組內(nèi)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清TNF-α含量比較 見表1。模型組血清TNF-α含量在造模后各時(shí)相與空白對(duì)照組比較均升高，在感染后第3～5日與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黃芩組、板藍(lán)根組、白頭翁組在流感病毒感染各時(shí)相血清TNF-α含量均降低，并于感染后第3日，黃芩組、板藍(lán)根組血清TNF-α含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），白頭翁組血清TNF-α含量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；虎杖組血清TNF-α含量在感染后第1～5日有降低趨勢(shì)，但與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；白花蛇舌草組血清TNF-α含量在感染后各時(shí)相與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清TNF-α含量比較（±s）

表1 各組小鼠血清TNF-α含量比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組黃芩組板藍(lán)根組白頭翁組虎杖組白花蛇舌草組n 6 8 7 8 7 7 6 1 d 188.13±35.124 233.21±22.042 207.58±20.410 211.68±25.291 225.57±38.896 223.28±31.721 229.14±24.289 n 8 8 8 8 8 7 8 3 d 180.285±24.995 303.927±29.525**238.591±25.123**△△248.660±17.899**△△266.794±24.999**△260.012±26.448**298.776±34.473**n 7 6 8 8 8 8 8 5 d 190.650±32.770 251.572±23.075*228.497±44.030 240.274±33.757 249.836±25.014 237.742±39.006 258.035±23.619*n 8 6 7 7 8 8 8 7 d 198.802±31.604 220.248±22.495 216.076±18.323 210.291±19.903 212.729±38.696 223.087±29.323 217.045±34.210

2.2 各組小鼠血清IL-1含量比較 見表2。模型組血清IL-1含量在造模后各時(shí)相與空白對(duì)照組比較均升高，在感染后第1～5日與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。黃芩組、白頭翁組在感染后各時(shí)相血清IL-1含量均降低，此兩組在感染后第3日小鼠血清IL-1含量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；板藍(lán)根組、虎杖組血清IL-1含量在感染后各時(shí)相有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；白花蛇舌草組血清IL-1含量在感染后各時(shí)相與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-1含量比較（±s）

表2 各組小鼠血清IL-1含量比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組黃芩組板藍(lán)根組白頭翁組虎杖組白花蛇舌草組n 6 8 7 7 6 8 8 1 d 126.061±23.043△△177.320±29.696**161.927±33.551*186.703±27.829**166.674±29.344*175.091±36.942**182.419±36.001**n 8 8 8 8 8 8 8 3 d 116.219±31.111 229.391±29.930**176.385±20.893**△222.763±34.592**182.743±12.611**△228.237±25.250**224.666±37.801**n 7 7 6 8 8 8 8 5 d 131.901±22.586 190.165±29.983**169.483±47.123 181.678±32.849*177.796±43.812*181.500±32.402*192.728±21.633**n 8 8 7 8 7 8 8 7 d 120.435±27.214 146.060±53.550 139.423±14.209 137.284±19.847 142.188±27.647 143.824±49.219 149.262±26.113

2.3 各組小鼠血清IL-6含量比較 見表3。模型組造模后各時(shí)相血清IL-6含量與空白對(duì)照組比較均升高，在感染后第3～5日與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。黃芩組、板藍(lán)根組在流感病毒感染后各時(shí)相血清IL-6的含量均降低，且第3～5日小鼠血清IL-6含量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；白頭翁組在流感病毒感染后第3日小鼠血清IL-6含量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；虎杖組在感染后第1日、第5～7日與模型對(duì)照組比較，血清IL-6含量有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；白花蛇舌草組在感染后第3日血清IL-6含量明顯降低，與模型對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清IL-6含量比較（±s）

表3 各組小鼠血清IL-6含量比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組黃芩組板藍(lán)根組白頭翁組虎杖組白花蛇舌草組n 6 8 6 8 7 8 8 1 d 115.987±20.512 128.129±27.577 121.974±31.269 116.963±21.148 127.957±13.800 122.953±37.268 125.234±35.286 n 8 8 8 7 8 8 8 3 d 108.822±21.290 179.774±11.541**158.450±15.578*△150.281±31.322*△161.125±16.47**△182.355±21.093**162.741±12.244**△n 8 8 8 8 8 7 8 5 d 116.707±10.305 163.953±58.027*126.716±12.993△123.081±19.088△142.241±22.429*161.093±15.430*147.978±22.687*n 8 8 7 8 6 8 7 7 d 94.673±36.242 126.421±27.499 115.742±17.527 111.772±13.784 129.553±15.392 127.857±30.944 114.125±19.235

2.4 各組小鼠血清IL-10含量比較 見表4。模型組小鼠血清IL-10含量在造模后各時(shí)相與空白對(duì)照組比較逐漸升高，感染后第5～7日與空白對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）。黃芩組在感染后第1～5日血清IL-10的含量均升高，且第5日小鼠血清IL-10含量明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；板藍(lán)根組、虎杖組在流感病毒感染后第1日小鼠血清IL-10的含量明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.01），在感染后第3～7日血清IL-10含量與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；白頭翁組在感染后第3日小鼠血清IL-10的含量明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；白花蛇舌草組在感染后第1～3日與模型對(duì)照組比較血清IL-10的含量有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠血清IL-10含量比較（±s）

表4 各組小鼠血清IL-10含量比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組黃芩組板藍(lán)根組白頭翁組虎杖組白花蛇舌草組n 7 8 6 8 7 8 8 1 d 138.709±13.344 168.470±29.450 184.796±13.411 236.275±37.733**△△167.571±14.927 240.723±97.751**△△174.787±31.976 n 8 7 6 8 7 6 7 3 d 134.177±34.161 185.120±42.372 197.249±23.564*176.889±25.706 245.240±73.142**△176.856±18.998 229.056±99.782**n 6 8 7 8 7 8 7 5 d 156.572±53.988 223.060±32.222**283.467±23.861**△200.186±13.596**220.264±17.441**213.715±16.608**223.113±38.828**n 8 8 7 7 8 8 7 7 d 140.835±15.708 230.651±34.359**207.323±11.511**254.160±32.696**202.555±30.379**248.588±37.728**208.411±23.192**

2.5 各組小鼠血清IFN-γ含量比較 見表5。模型組血清IFN-γ含量在感染后各時(shí)相與空白對(duì)照組比較均升高，感染后第5日達(dá)峰，與空白對(duì)照組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。黃芩組在感染后各時(shí)相血清IFN-γ含量與模型對(duì)照組比較均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；板藍(lán)根組在流感病毒感染后第3～5日，血清IFN-γ含量與模型對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）；白頭翁組在感染后第5～7日血清IFN-γ含量與模型對(duì)照組比較有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；虎杖組、白花蛇舌草組在感染后第5日血清IFN-γ含量與模型對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）。

表5 各組小鼠血清IFN-γ含量比較（±s）

表5 各組小鼠血清IFN-γ含量比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組黃芩組板藍(lán)根組白頭翁組虎杖組白花蛇舌草組n 6 8 7 8 7 8 7 1 d 135.907±89.869 146.580±52.836 148.729±39.899 158.748±69.179 144.928±52.412 151.796±44.590 157.007±54.444 n 8 8 8 7 8 8 8 3 d 143.078±74.772 158.342±64.054 162.291±44.023 178.035±58.016*△155.367±61.242 170.875±46.768 175.284±43.975*n 8 8 8 8 8 8 8 5 d 137.413±85.776 170.322±87.331*175.114±59.088*209.657±51.197**△178.577±35.096*202.275±69.975**△198.709±65.898*△n 6 6 8 8 7 7 8 7 d 146.631±23.187 155.990±48.285 169.039±57.745 172.944±57.310 165.770±53.578 174.602±38.900 171.011±53.186

3 討 論

流感病毒感染人體后，介導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，可誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），造成靶器官?gòu)V泛的病理?yè)p傷，出現(xiàn)ARDS、休克及多臟器功能衰竭［9-10］。流感病毒侵入機(jī)體后，激活單核-巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎性細(xì)胞因子。前三者協(xié)同作用誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，引起嚴(yán)重組織損傷與血液循環(huán)障礙，引起休克和臟器功能衰竭［11-12］。IL-10可抑制抗原提呈及促炎介質(zhì)生成，從而抑制過強(qiáng)的免疫反應(yīng)及由此導(dǎo)致的組織損傷，同時(shí)IL-10可增強(qiáng)“清道夫”的功能，并有助于誘導(dǎo)免疫耐受［13］。

在流感病毒FM1感染后第1日，板藍(lán)根和虎杖能夠明顯升高血清IL-10的含量，說明板藍(lán)根、虎杖可能在感染初期抑制促炎性細(xì)胞因子的過度釋放，誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，從而減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴所造成的組織損傷。

在流感病毒FM1感染后第3日，模型對(duì)照組血清TNF-α、IL-1、IL-6的含量達(dá)峰值，而黃芩組、板藍(lán)根組、白頭翁組在此時(shí)相能夠顯著降低血清TNF-α的含量，黃芩組和白頭翁組在此時(shí)相能夠明顯降低血清IL-1的含量，黃芩組、板藍(lán)根組、白頭翁組、白花蛇舌草組在此時(shí)相能夠明顯降低血清IL-6的含量，白頭翁組在此時(shí)相能夠顯著升高血清IL-10的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，黃芩能夠在感染后第3日，即急性外感熱病極期，可顯著降低血清促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的含量，抑制全身炎癥反應(yīng)，有利于防止嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。板藍(lán)根在流感病毒感染后第3日，可顯著降低血清促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的含量，同時(shí)顯著增加血清IFN-γ含量，并且在感染后第1日可顯著增加血清抗炎性細(xì)胞因子IL-10的含量，說明板藍(lán)根不僅可在感染初期發(fā)揮抗病毒作用，并在急性外感熱病極期可顯著抑制血清促炎性細(xì)胞因子的大量分泌，有利于抑制過度的免疫炎性損傷。白頭翁能夠在流感病毒感染第3日，顯著降低血清促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的含量，顯著增加血清抗炎性細(xì)胞因子IL-10的含量，提示在急性外感熱病極期，白頭翁能夠顯著抑制全身炎癥反應(yīng)，有利于抑制過度的免疫炎性損傷。白花蛇舌草能夠在流感病毒感染第3日，顯著降低血清中促炎性細(xì)胞因子IL-6的含量，有利于抑制過度的免疫炎性損傷。

流感病毒FM1感染后第5日，模型對(duì)照組血清TNF-α、IL-1、IL-6含量逐漸下降，IL-10、IFN-γ逐漸升高。在此時(shí)相，黃芩和板藍(lán)根可明顯降低血清IL-6的含量，黃芩亦可顯著升高血清IL-10的含量，板藍(lán)根、虎杖、白花蛇舌草可明顯升高血清IFN-γ的含量。由此可知，在流感病毒FM1感染后第5日，黃芩和板藍(lán)根仍然能夠顯著降低血清中促炎性細(xì)胞因子的含量，有利于抑制全身炎癥反應(yīng)，抑制過度的炎性損傷。黃芩在此時(shí)相還能顯著增加血清中IL-10的含量，更加有利于抑制靶器官過度的炎性損傷。在此時(shí)相，板藍(lán)根、虎杖、白花蛇舌草依然具有抑制流感病毒的復(fù)制和擴(kuò)散的作用，具有抗病毒作用。

在流感病毒FM1感染后第7日，即急性外感熱病后期，感染機(jī)體的細(xì)胞因子重新趨于穩(wěn)態(tài)，免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)逐漸恢復(fù)平衡狀態(tài)，清熱解毒代表中藥與模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。

綜上所述，流感病毒感染機(jī)體后，不同清熱解毒類中藥對(duì)感染免疫調(diào)控的作用不盡相同。黃芩味苦，性寒，歸肺、膽、胃、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證明，黃芩含有黃酮類化合物、揮發(fā)油及多糖等多種成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏等藥理作用［14］。黃芩在感染后第3～5日，即急性外感熱病極期，能夠顯著抑制免疫炎性損傷，該作用在諸清熱解毒類藥物中最為顯著。板藍(lán)根味苦，性寒，有清熱解毒、涼血利咽之功，其主要化學(xué)成分板藍(lán)根多糖、凝集素等具有抗流感病毒、抗菌、消炎等作用［15-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，板藍(lán)根在流感病毒感染后早期即可顯著抑制炎性反應(yīng)，在流感病毒感染后3～5 d，即急性外感熱病極期，具有顯著的抑制流感病毒的作用，且能夠較顯著地抑制免疫炎性損傷。白頭翁性平，味微苦辛，具有清熱解毒、止咳化痰、活血散瘀之功。現(xiàn)代藥理研究顯示，白頭翁含有三萜酸、木脂素、香豆素等化學(xué)成分，具有抗炎、抑菌、抗氧化等作用［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白頭翁在流感病毒感染后第3日能夠顯著抑制免疫炎性損傷?；⒄瓤嗪?，具有清熱解毒、利膽退黃、活血祛瘀、祛痰止咳等功效，主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類以及一些脂肪酸類化合物［18］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，虎杖具有抗炎、抗病毒等作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，虎杖在流感病毒感染第1日，即在急性外感熱病初期具有抑制免疫炎性損傷的作用，在流感病毒感染第5日具有抑制流感病毒的作用。白花蛇舌草微苦、甘寒，具有清熱解毒、利濕通淋等作用，其化學(xué)成分主要有萜類、黃酮類、蒽醌類、多糖類等化合物，有抗腫瘤、抗炎、抗菌等藥理作用［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，白花蛇舌草在流感病毒感染第3日具有抑制免疫炎性損傷的作用，而在感染后第5日具有抗病毒作用。