柑桔潰瘍病生物防治研究進展

錢佳琳 余水靜 周亮亮

摘要：柑桔潰瘍病是由地毯黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis pv.Cirri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害。生物防治以其高效、安全、環(huán)保受到柑桔潰瘍病防控研究工作者們的青睞。從基因工程技術、生物拮抗菌及噬菌體技術等方面綜述了柑桔潰瘍病生物防治的研究進展。

關鍵詞：柑桔潰瘍病;病原菌;基因工程;拮杭菌;噬菌體

柑桔潰瘍病（Citrus Bacterial Canker Disease，CBCD）是由地毯黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodispv.Citri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害，是國內外檢疫的對象[1]。該病害對柑桔造成極大的破壞，感染的嚴重程度會因不同的物種和品種以及氣候條件而異。潮濕天氣，細菌細胞從現(xiàn)有病變中滲出，為病害的進一步發(fā)展提供接種物。與許多其他細菌性疾病一樣，病原菌借風雨、昆蟲，從氣孔、皮孔和傷口侵入。潛育期的長短因品種的抗（感）病性、組織的老熟程度和溫度而異，一般為3～10d。在氣溫25～30℃下，雨量與病害發(fā)生成正相關，高溫多雨季節(jié)發(fā)病嚴重[2]。柑桔潰瘍病雖對人體無害，但會影響新鮮水果的適銷性，造成經(jīng)濟損失。生物防治以其高效、安全、環(huán)保受到研究工作者們的青睞，利用生物技術防治潰瘍病具有很大的潛力和市場前景?，F(xiàn)將近年來柑桔潰瘍病生物防治方面的研究進展作簡要綜述。

1 柑桔潰瘍病的病原

柑桔潰瘍病菌系具有品種特異性。由X.ax-onopodis pv.Citri（Xac）引起的柑桔潰瘍病，是迄今為止最普遍和最嚴重的疾病。因最初出現(xiàn)在亞洲，所以稱由該菌株導致的潰瘍病為亞洲潰瘍?。ˋsiatic citruscanker，ACC），即A菌系。該病在印度、巴基斯坦、印度洋島嶼、東南亞、中國和日本流行。B菌系，由X.ax-onopodis pv.aurantifolii引起的B菌系潰瘍病（或假潰瘍?。┦前屠?、阿根廷、烏拉圭檸檬上的嚴重病害，墨西哥萊檬、酸橙和袖子也易受到影響。C菌系，也是由X.axonopodis pv.aurantifolii引起的，已在巴西的墨西哥酸橙中分離出來，癥狀與A菌系潰瘍病相似[3-4]。1981年，在墨西哥的科馬利地區(qū)萊檬上發(fā)現(xiàn)了1株單一菌株，主要為害墨西哥萊檬和袖子樹以及波斯萊檬，即D菌系[5]。佛羅里達州于1984年發(fā)現(xiàn)了1株新的黃單胞菌株，該細菌與現(xiàn)有的引起潰瘍病的A、B和C的2株X.axonopodis病原體無關，命名為X.axonopodis pv.cit-rumelo，即E菌系。在沙特阿曼、阿拉伯、伊朗、印度發(fā)現(xiàn)一種A^*菌系，其宿主范圍僅限于墨西哥萊檬，且與常見的A菌系有所不同[6]。在留尼旺島和印度洋周圍的島嶼發(fā)現(xiàn)了一種A菌株的非典型形式，其對青霉素相關抗生素具有高水平的抗性[7]。

2 生物防治

由于大量地施用化學藥劑，造成植物體內農(nóng)藥殘留累積、產(chǎn)量降低、環(huán)境污染，當前人們對蔬菜瓜果的無污染、無殘留、無公害生產(chǎn)的需求越來越高，國內外柑桔產(chǎn)區(qū)都在積極探索生物防治策略以控制柑桔潰瘍病，利用生物農(nóng)藥防治柑桔潰瘍病已經(jīng)成為人們關注的焦點。目前，柑桔潰瘍病的生物防治仍處于基礎研究階段，主要是通過基因工程技術、生物拮抗菌及噬菌體技術等來抑制柑桔潰瘍病的發(fā)生及感染。

2.1 基因工程技術

采用基因工程技術，可通過編碼抗菌肽基因的過量表達、抗病蛋白和來自非植物來源的轉錄因子等策略，增強柑桔防御或在感染部位參與誘導程序性細胞死亡以提高柑桔對潰瘍病的抵抗力。羅賽男等[8]將獲得轉TERF1基因糖橙的春梢葉片進行柑桔潰瘍病病原菌的接種。試驗表明，在接種病原菌后，轉基因植株的平均發(fā)病率下降了50%左右，且發(fā)病的時間比冰糖橙和對照推遲了7d，其中3號株系的抗病性最強，葉片無病癥。Yang等[9]通過農(nóng)桿菌介導將pth A-nls轉移到甜橙中。體外試驗顯示，當用2.5×107cfu/mL的潰瘍病病原菌溶液進行針刺接種時，nls+轉基因克隆沒有顯示典型的病變發(fā)展，體內試驗結果表明，當針刺接種以104～105cfu/mL進行時，Sucarri甜橙的最低發(fā)病率為23.3%，Bingtang甜橙的發(fā)病率最低為33.3%。當噴霧接種104～107cfu/mL病原體時，nls+轉基因克隆沒有出現(xiàn)任何癥狀，甚至濃度升至109cfu/mL，發(fā)病率為20%～80%。

X Zhang等[10]生成表達擬南芥NPR1基因（At-NPR1）的轉基因Duncan葡萄袖（DG）和Hamlin甜橙（Ham）。柑桔中AtNPR1的過量表達增加了對柑桔潰瘍病的抗性，具有最高表達水平的AtNPR1的品系（DG 42-2）是最具抗性的，伴隨著黃單胞菌屬群體減少10倍，其產(chǎn)生明顯較少的病變。Nicolas等[11]將菠蘿甜橙植物用遺傳構建體轉化，促使蛙皮抗菌肽的組成型積累;與未轉化的植物相比，轉基因植物在受控條件下進行的植物測定中顯示出減少了高達50%的柑桔潰瘍病癥狀。此外，轉基因植物中存在的較小尺寸的潰瘍和在癥狀發(fā)展中觀察到的延遲表明疾病嚴重程度顯著降低。

Li等[12]通過農(nóng)桿菌介導的胚性愈傷組織轉化，將水稻基因Xa21與GUS報告基因和潮霉素磷酸轉移酶基因（HPT）一起導入安柳城甜橙。通過體外針刺接種評估3種回收的轉基因系T2、T4和T6對柑桔潰瘍病的耐受性，發(fā)現(xiàn)3種轉基因株系均對柑桔潰瘍病菌感染具有較高的抗性，T4轉基因株系表現(xiàn)出較高的抗性。表明水稻Xa21基因為對抗柑桔潰瘍病是可行的。

Sendin等[13]在柑桔轉基因植株中評價了辣椒Bs2基因穩(wěn)定表達對柑桔潰瘍病抗性的影響。在表達Bs2的轉基因品系中觀察到相對于未轉化的對照植物，潰瘍病癥狀減少高達70%。Takehiko等[14]產(chǎn)生過量表達芳樟醇合成酶基因（CuSTS3-1）的轉基因Hamlin甜橙（Citrus sinensis L.Osheck）植物，具有最高芳樟醇含量的轉基因品系（LIL），在噴灑細菌時顯示出對柑桔潰瘍病的強抗性。

Adilson等[15]使用成熟外植體的薄切片的農(nóng)桿菌介導的轉化獲得組成型表達與來自煙草的PR1a信號肽融合的肌肉毒素IA肽的轉基因Pera甜橙，通過滲入和噴霧接種黃單胞菌進行轉基因和非轉基因植物葉片中的柑桔潰瘍病抗性評估。與非轉基因植物相比，轉基因植物葉片中的黃單胞菌群體低至2個對數(shù)單位。在注射浸潤或用黃單胞菌接種物噴霧后，非轉化對照（大于10個病灶/cm²）中潰瘍病灶的發(fā)生率顯著高于轉基因植物（小于5個病灶/cm²）。

2.2 生防拮杭菌

已知對柑桔潰瘍病菌有拮抗作用的微生物有枯草芽孢桿菌（Bacillus suhtilis（Ehrenherg）Cohn 1872，174）、草生歐氏桿菌（Erwinia herhicola（Lohnis）Dye 1964，268）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula1895，29）和丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae vanHall 1902，141）以及腐生的Xanthomonas sp.[3]。

譚小艷等[16]從南寧柑桔園土壤中分離到1株對柑桔潰瘍病菌具有強抑制力的鮑氏不動桿菌Bt8。在溫室條件下將該細菌懸浮液噴施到柑桔葉片上，該菌對柑桔潰瘍病具有53%的抑制率。

張洪波等[17]從柑桔葉表篩選出菌株KxI5和Kx48（初步鑒定分別屬于葡萄糖桿菌屬和乳酸桿菌屬）對柑桔潰瘍病防治效果明顯，在溫室條件下對柑桔潰瘍病的防治效果分別達到45.6%和55.6%，在重病果園中的防治效果分別為40.3%、47.7%，且Kx48要優(yōu)于KxI5。董玉蘭等[18]從湖南省不同地區(qū)的土壤樣品中篩選獲得3株拮抗效果突出的菌株CLT3、CLH2、CZRI，且防效基本都在50%以上。其中以CLT3的防效最佳，達到83.85%。經(jīng)鑒定CLT3為鏈霉菌屬，CLH2為假甲胞蔚屬，CZRI為克氏菌屬。

馬冠華等[19]篩選出3個對柑桔潰瘍病菌有拮抗作用的放線菌菌株，抑菌圈直徑達42.0～60.0mm，且能破壞柑桔潰瘍病菌細胞膜完整性，增加細胞膜通透性，引起細胞質外滲。劉冰等[20]從贛南臍橙篩選到1株柑桔潰瘍病生防內生細菌GN232，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis sub sp.Subtilis），其抗細菌活性代謝產(chǎn)物在中性環(huán)境下穩(wěn)定，對溫度不敏感，紫外線照射25min后發(fā)酵濾液抑菌活性降低，胰蛋白酶對發(fā)酵濾液活性無明顯影響;此外，該菌株發(fā)酵上清液和農(nóng)用鏈霉素混用后對潰瘍病菌的抑制效果較單獨發(fā)酵濾液、農(nóng)用鏈霉素的抑菌效果分別提高26.8%和20.7%。

Julia等[21]從巴西Caatinga生物群系中分離的放線菌及其粗提取物針對不同的黃單胞菌屬（Xan-thomonas citri）亞種菌株進行了測試。研究發(fā)現(xiàn)，Caat1-54提取物可有效預防Xcc對葉片的新感染，但不能減少預先建立的柑桔潰瘍病灶中的Xcc群體。OrawanDaungfu等[22]從6種健康柑桔屬植物中分離獲得內生細菌。用解淀粉芽孢桿菌LE109或枯草芽孢桿菌LE24的細胞懸浮液接種的葉子可以完全控制柑桔潰瘍病。而接種了B.tequilensis PO80的葉子顯示出10%的發(fā)病率。用解淀粉芽孢桿菌LE109或枯草芽孢桿菌LE24的粗生物活性化合物處理的葉子可以完全控制柑桔潰瘍病。但用B.tequilensis PO80的粗生物活性化合物處理的葉子顯示出5%的發(fā)病率。

2.3 噬菌體技術

用于疾病控制的噬菌體的使用是植物保護的快速擴展領域，具有替代現(xiàn)有化學控制措施的巨大潛力。Balogh等[23]在溫室實驗中發(fā)現(xiàn)，噬菌體處理柑桔潰瘍病，導致疾病嚴重程度平均降低59%。在商業(yè)柑桔苗圃試驗中，噬菌體處理顯著減少了中度敏感的瓦倫西亞橙潰瘍病感染（48%和35%）;然而，在高度敏感的葡萄袖宿主上，它是無效的。在實驗性柑桔苗圃中，噬菌體處理提供了由噬菌體敏感菌株引起的柑桔細菌斑的顯著控制。

Ahmad等[24]分離并表征絲狀噬菌體XacF1可以感染柑桔潰瘍病菌。XacF1噬菌體的感染引起細菌宿主細胞的幾種生理變化，包括較低水平的細胞外多糖產(chǎn)生，運動性降低，生長速度較慢以及毒力顯著降低。毒力的降低表明可能利用XacF1作為抗柑桔潰瘍病的生物控制劑。

當用商業(yè)系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired re-sistance，SAR）誘導劑和拮抗性細菌作為柑桔潰瘍病綜合管理方法的一部分時，噬菌體處理表現(xiàn)出良好的效果。Ibrahim等固特阿拉伯溫室和田間條件下的柑桔潰瘍病葉子上，將配制的噬菌體與脫脂乳和蔗糖或非配制的噬菌體與acibenzolar-S-methy]（ASM）的組合應用與銅殺菌劑應用以抑制柑桔潰瘍病相比較。在溫室條件下，用氫氧化銅或噬菌體與ASM組合處理的植物，ACC在葉片上的發(fā)生率分別從75.2%顯著降低至12.8%或18.3%。與未處理的對照植物相比，在田間條件下配制的噬菌體與ASM組合作為土壤灌溉的應用顯著降低了14.8%（試驗1）和16.8%（試驗2）的發(fā)病率。用噬菌體與ASM組合處理的Xcc接種的植物在溫室和田間條件下顯示出顯著的ACC降低。

3 問題與展望

柑桔潰瘍病嚴重感染會導致多種后果，包括葉片脫落、果實品質下降和過早落果，是威脅柑桔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的嚴重病害。目前，生物防治試驗研究方法雖然能在一定程度上減輕柑桔潰瘍病。但是，許多的生物拮抗菌及噬菌體的試驗研究都是在室內進行，可以人為控制某些環(huán)境因素，田間環(huán)境多變且有許多不定因素，對其防治效果還有待研究?？剐栽耘嗥贩N的使用是最好的、長期的、最具成本效益和永久有效的管理柑桔潰瘍病的方案，而基因工程可以補充經(jīng)典的柑桔育種并增強易感商業(yè)品種的抗病性。已有大量的研究表明，通過轉基因技術引入抗性基因至感病品種能降低潰瘍病的發(fā)生。雖然目前可通過基因工程技術提升植株抗?jié)儾∧芰Γ晕创竺娣e田間推廣栽培。由于突變新菌株的產(chǎn)生，需要更好地了解Xac菌株的致病特性及正確鑒定，這對于培育新的柑桔潰瘍病抗性品種具有重要意義。（收稿：2019-07-01）

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作者簡介：錢佳琳（1995-），女，碩士研究生，主要研究方向：柑桔潰瘍病生物防治。

通信作者：余水靜（1976-），男，副教授，博士，主要研究方向：環(huán)境微生物。