惡劣環(huán)境下異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的研究進(jìn)展

鄒玉蘭 ，王 瑩 ，陳 虎 ，呂永康

（1.太原理工大學(xué)煤科學(xué)與技術(shù)教育部和山西省重點實驗室，山西太原030024；2.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)保產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，山西太原030024）

工農(nóng)業(yè)廢水中氨氮的超標(biāo)排放導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，嚴(yán)重威脅人類的生產(chǎn)生活和生態(tài)平衡〔1〕。因此，減少工農(nóng)業(yè)污水排放的氨氮含量尤為必要。近年來，生物法處理氨氮因具有成本低、二次污染少等優(yōu)點而被廣泛使用〔2〕。傳統(tǒng)生物脫氮過程主要由好氧自養(yǎng)硝化和厭氧/嚴(yán)格缺氧異養(yǎng)反硝化兩部分構(gòu)成〔3〕。傳統(tǒng)生物脫氮的兩部分工藝對有機(jī)底物和氧氣的需求截然不同，導(dǎo)致操作復(fù)雜化和處理成本增加。1985年研究人員發(fā)現(xiàn)了一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（HN-AD）能力的脫氮副球菌 Paracoccus denitrificans〔4〕，并首次提出 HN-AD 的概念。 HN-AD 作為一種新型的生物脫氮技術(shù)，能夠在好氧條件下利用有機(jī)碳源，同時將氨氮徹底轉(zhuǎn)化為N2，實現(xiàn)COD和氮源的同步脫除，并克服了傳統(tǒng)脫氮過程中嚴(yán)格厭氧條件難以控制的限制。而HN-AD菌作為該項技術(shù)的主要參與者和完成者被陸續(xù)分離，如貪銅菌屬Cupriavidus sp.S1〔5〕、不動桿菌 Acinetobacter sp.JR1〔6〕和假單胞菌屬 Pseudomonas balearicastrain RAD-17〔7〕等。據(jù)研究報道，HN-AD菌相比于傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)具有如下優(yōu)良特性：（1）反硝化過程產(chǎn)生的堿能部分中和硝化過程產(chǎn)生的酸〔8〕；（2）可利用有機(jī)底物作為能源，使得異養(yǎng)硝化菌的繁殖速度遠(yuǎn)高于自養(yǎng)菌〔9〕，提高了對含氮污染物的降解速率并能同時脫氮除碳；（3）硝化和反硝化可在同一反應(yīng)器和好氧條件下同時進(jìn)行〔10〕，因此該過程基本無硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。前人研究表明，大部分HN-AD菌在相對溫和（如pH為7、溫度為30℃和低鹽度）的條件下發(fā)揮作用〔11〕。而實際廢水成分復(fù)雜，使得該類細(xì)菌很難發(fā)揮良好的脫氮特性，嚴(yán)重限制了其在實際廢水中的應(yīng)用。近年來為提高HN-AD菌的實際應(yīng)用性能，學(xué)者們將HN-AD菌在復(fù)雜環(huán)境條件下的脫氮性能作為研究重點。因此，筆者總結(jié)了在極端pH、溫度、重金屬、難降解有機(jī)物和鹽度等惡劣環(huán)境下HN-AD菌的脫氮性能，并闡述了其在污水處理中的研究現(xiàn)狀及面臨的問題。

1 不同惡劣環(huán)境下HN-AD菌的脫氮特性

1.1 極端pH

大多數(shù)HN-AD菌傾向于在中性或微堿性環(huán)境下生長，當(dāng)pH超過菌株的適應(yīng)范圍時會降低菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶活力，使微生物的生長受到抑制，進(jìn)而影響菌株的脫氮性能。近年來有學(xué)者篩選出可耐受極端pH的HN-AD菌，以適應(yīng)不同酸堿性的實際廢水。Jingrui Yang等〔6〕從酸性制藥廢水中分離出不動桿菌Acinetobacter sp.JR1，并對其在酸性條件下（pH=4.5）的脫氮性能進(jìn)行研究，結(jié)果表明當(dāng)初始pH為4.5、氨氮為103 mg/L時，總氮（TN）去除率高達(dá)97.9%；此外，JR1在pH為4.5～10范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的脫氮性能，TN去除率高達(dá)96%。耐堿異養(yǎng)硝化菌 Serratia marcescens W5〔12〕在 pH 為 10 時經(jīng)24 h培養(yǎng)后，氨氮去除率仍可達(dá)80%以上。Maoxia Chen等〔13〕從實驗室反應(yīng)器的活性污泥中分離出一株HN-AD菌Aeromonas sp.HN-02，其抗酸堿pH范圍達(dá)2.3～11，且當(dāng)pH在4～10時對應(yīng)的氨氮去除率高達(dá)70%。這些HN-AD菌能夠在極端pH環(huán)境下生長并進(jìn)行脫氮的可能原因為：（1）偏酸性條件下，HN-AD菌在反硝化過程中逐漸產(chǎn)堿進(jìn)而緩解偏酸的情況；（2）在偏堿性條件下含有更多的游離NH3，從而有利于異養(yǎng)硝化〔14〕。

1.2 溫度

目前HN-AD菌脫氮的最適溫度范圍大都在25～37℃，而對于高緯度地區(qū)的中國北部、加拿大和北歐等地，每年水環(huán)境溫度低于10℃的時間長達(dá)4個月。以中國哈爾濱市的主要水源松花江為例，冬季水溫可降至1℃，水溫在1～10℃范圍內(nèi)可持續(xù)6個月左右〔15〕。因此，該類地區(qū)低溫脫氮菌的研究成為研究熱點。Mo Yang等〔16〕從中國北部松花江中分離出耐低溫的詹森菌屬Janthinobacterium sp.M-11，在2℃、碳氮比為5、初始氨氮為5 mg/L時氨氮去除率可達(dá)98%，表明該菌株具有低溫脫氮能力，且養(yǎng)分消耗低。Zejia Zheng等〔17〕從中國北部松花江中分離出可耐低溫（2℃）的不動桿菌Acinetobacter harbinensis HITLi7T，當(dāng)初始質(zhì)量濃度為5 mg/L時，氨氮和硝酸鹽的最大降解速率分別為 0.076、0.029 mg/（L·h）。Yi Xu 等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌 Pseudomonasputida Y-9在15℃時能夠有效降解氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，當(dāng)氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮初始質(zhì)量濃度分別為 208.94、205.63、205.32 mg/L 時，對應(yīng)的去除率為 98.3%、74.7%、85.6%，且平均降解速率可達(dá)2.85、1.60、1.83 mg/（L·h）。 該類 HN-AD 菌的耐冷機(jī)制可歸為：（1）代謝途徑的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的合成和蛋白質(zhì)的再折疊〔19〕；（2）低溫下 HN-AD 菌應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)增加〔13〕；（3）細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化酶以提高菌株的耐冷性〔20〕。

近年來，一些耐高溫菌株也被分離出來。張苗等〔21〕從燃煤電廠生物滴濾器的生物膜中分離出耐高溫菌Chelatococcus daeguensis TAD1，當(dāng)培養(yǎng)溫度為50℃、初始硝酸鹽為63.79 mg/L時，TAD1經(jīng)24 h可降解硝酸鹽，去除率可達(dá)99.12%，且未檢測到中間產(chǎn)物亞硝酸鹽的積累。G.Mével等〔22〕從深海熱液噴口分離出芽孢桿菌Bacillus MS30，經(jīng)研究觀察到65℃時硝化活性最佳。這些菌株在高溫時具有較好的脫氮性能，其耐高溫機(jī)制可歸為：與底物去除有關(guān)的酶活性增加〔23〕；高溫下產(chǎn)生更多的游離氨，有利于異養(yǎng)硝化〔6〕。

1.3 重金屬

在一些冶金、電鍍、印染和制革等工業(yè)廢水中含有 Cu2+、Zn2+、Cr6+、Ni2+等大量重金屬，會影響 HN-AD菌的脫氮性能。Jingrui Yang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)Cu2+為5 mg/L時僅有8.80%的氨氮被不動桿菌Acinetobacter sp.JR1降解，至Cu2+增加到10 mg/L時，菌株JR1不能生長從而無法降解氨氮。Maoxia Chen等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)Aeromonas sp.HN-02對Cu2+極為敏感，Cu2+為1.5 mg/L時幾乎完全抑制了該菌株的生長。而于大禹等〔24〕發(fā)現(xiàn)向模擬廢水中添加Cu2+對異養(yǎng)硝化關(guān)鍵酶有促進(jìn)作用。Ni Zhang等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌Pseudomonas putida ZN1能夠耐受較高濃度的Cu2+，Cu2+為800 mg/L時氨氮去除率仍可達(dá)62.10%，菌株ZN1中抗銅基因copB-I的成功擴(kuò)增可解釋其對Cu2+的高耐受性。從垃圾填埋場滲濾液處理反應(yīng)器中分離的假單胞菌P.aeruginosa PCN-2可同時去除Cr6+和硝酸鹽，且擴(kuò)增出Cr還原基因ChrR，進(jìn)而證實該性能〔26〕。 Zhiyi Sun 等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)在 10 mg/LCr6+沖擊下Cupriavidus sp.S1已完全停止生長，無法實現(xiàn)水中氮的脫除。綜上，不同菌種具有不同的重金屬耐受性。微量重金屬可作為微生物生長必需的微量元素，而過量的重金屬會嚴(yán)重抑制微生物的生長〔5〕。目前HN-AD菌的抗重金屬性能主要歸因于：（1）金屬離子可通過共價作用催化酶的親電子中心，成為酶的輔基，進(jìn)而激活酶的催化能力〔24〕；（2）HN-AD 菌具有相關(guān)金屬抗性基因，在特定環(huán)境中可編碼相應(yīng)的金屬抗性蛋白〔25〕；（3）HN-AD 菌同時存在相關(guān)金屬和氮的還原基因〔26〕。

1.4 難降解有機(jī)物

眾所周知，來自于焦化、制藥、石油等行業(yè)的廢水含有喹啉、吡啶、苯酚等難降解有機(jī)物，因此常規(guī)的微生物處理往往受難降解有機(jī)物毒性的影響而導(dǎo)致微生物的生長生理機(jī)能受抑制，最終抑制該類廢水的生物脫氮。近年來，一些研究者致力于分離可耐受難降解有機(jī)物的菌株，發(fā)現(xiàn)一些HN-AD菌可通過共代謝作用降解苯酚、吡啶、硝基酚、喹啉和抗生素等難降解有機(jī)物。Yaohui Bai等〔27〕分離出以吡啶為唯一碳氮源的新菌株Shinellazoogloeoides BC026，在45.5 h內(nèi)可將1 806 mg/L吡啶完全降解，且只要提供足夠的額外碳源，就能快速將中間產(chǎn)物氨氮徹底轉(zhuǎn)化為N2；其課題組又分離出一株以喹啉為唯一碳氮源的假單胞菌Pseudomonas sp.〔28〕，根據(jù)產(chǎn)物分析和相關(guān)基因的擴(kuò)增證明該菌株也可進(jìn)行HN-AD過程。黃桿菌Diaphorobacter sp.PD-7〔29〕以初始質(zhì)量濃度為1 400 mg/L的苯酚和120.69 mg/L氨氮分別作為唯一碳氮源時，氨氮在75 h內(nèi)幾乎被完全降解，平均降解速率為 1.61 mg/（L·h），苯酚在 85 h內(nèi)降解完全；相同條件下硝酸鹽為唯一氮源時，65 h內(nèi)硝酸鹽去除率達(dá)91%，平均降解速率達(dá)到1.61 mg/（L·h），苯酚也可在85 h內(nèi)被完全降解。紅球菌Rhodococcus pyridinivorans GF3〔30〕從 1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸污染土壤中被分離出來，在150 r/min和30℃下可降解9種蒽醌類化合物ACs，且能同步脫除ASA-2和硝酸鹽。此外，制藥廢水中存在常見的難降解抗生素類有機(jī)物，其廣譜抑菌性能使得該類廢水的生物治理更加困難。嗜鉻桿菌Ochrobactrum sp.KSS10〔31〕可降解氧四環(huán)素（OTC）、氨氮和硝酸鹽，使OTC從19.25 mg/L急劇降至4.63 mg/L，氨氮和總氮降解速率分別為 0.848、1.189 mg/（L·h），且硝酸鹽最大降解速率達(dá) 1.967 mg/（L·h），表明菌株 KSS10 可通過共代謝作用降解抗生素和無機(jī)氮。Achromobacter sp.JL9〔32〕可降解低碳氮比制藥廢水中的磺胺甲惡唑（SMX）和氮，且SMX生物降解率和脫氮率分別為90.4%（SMX）、92.4%（硝酸鹽）、86.7%（氨氮）和89.4%（總氮）。不同的菌株具有不同有機(jī)物耐受降解性能，HN-AD菌能夠同時降解有機(jī)物及氨氮的主要機(jī)制在于：（1）HN-AD菌中同時存在有機(jī)物和氮降解基因〔29〕；（2）有機(jī)物降解過程中相關(guān)鍵的斷裂促進(jìn)了細(xì)菌代謝和氮轉(zhuǎn)化〔31〕；（3）有機(jī)物降解過程產(chǎn)生腐殖酸和色氨酸蛋白，有助于HN-AD菌降解氮和有機(jī)物〔31-32〕。

1.5 鹽度

目前關(guān)于HN-AD菌的分離基本源于淡水或污泥，而來自于海水養(yǎng)殖、食品加工、石油生產(chǎn)、制革和制藥廠等許多工農(nóng)業(yè)的廢水往往具有高鹽度的特點〔14，33-34〕。 因此，嗜鹽 HN-AD 菌的篩選及脫氮性能研究成為國內(nèi)外研究者的主要關(guān)注點，為生物強(qiáng)化實現(xiàn)高鹽廢水脫氮成為可能。Jinming Duan等〔14〕從海洋沉積物中分離出Vibrio diabolicus SF16，在初始氨氮為119.77 mg/L、鹽度為1%～5%的范圍內(nèi)，氨氮去除率可達(dá)92%以上，且鹽度升至7%時氨氮去除率仍可達(dá)74.68%。Kun Zhao等〔33〕從蝦培養(yǎng)池中分離獲得Bacillussubtilis H1，鹽度為30 g/L時最有利于該菌生長和脫氮，且氨氮和亞硝酸鹽去除率分別達(dá)到87.2%、89.4%。 Dan Li等〔34〕從制革廢水中分離出克雷伯氏菌Klebsiella sp.TN-10，并研究其在不同NaCl質(zhì)量濃度下（0、15、25、35 g/L）的生長和硝化特性，研究發(fā)現(xiàn) NaCl為 0、15、25、35 g/L 時的最大生物量分別為 2.59、2.15、2.18、1.89，且最大氨氮去除率分別為 99.73%、99%、98.08%、98.27%。 Te Wang 等〔35〕從鹽池沉積物中分離出Halomonas sp.B01，在NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L、初始氨氮為2 121 mg/L時，96 h內(nèi)氨氮去除率可達(dá)98.8%。白潔等〔36〕從海底沉積物中分離出Zobellella sp.B307，在鹽度為5～75 g/L條件下生長良好且有穩(wěn)定的脫氮性能，氨氮和硝酸鹽氮的去除率均在94%以上。研究表明，適量的鹽度有利于調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)滲透壓與環(huán)境滲透壓相近，進(jìn)而為微生物生長提供良好的環(huán)境。但鹽度過高將會引起滲透壓過高，破壞細(xì)菌細(xì)胞使細(xì)胞中的水分過度損失及原生質(zhì)體分離，最終抑制微生物的代謝活動，包括與脫氮相關(guān)的代謝活性〔37〕。但以上分離出的HN-AD菌具有耐鹽特性，主要歸因于以下方面：（1）細(xì)胞通過產(chǎn)生抗氧化酶來對抗高鹽的沖擊，能催化清除超氧陰離子自由基，從而提供抗氧毒性的防御〔34-35〕；（2）HN-AD 菌 通過 合成 相容溶質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)大分子起保護(hù)作用〔35〕；（3）微生物生長和氮去除的相關(guān)酶具有耐鹽性〔35〕。

1.6 其他惡劣環(huán)境條件

除上述環(huán)境因素外，研究者還發(fā)現(xiàn)可耐受高氨氮負(fù)荷、低碳氮比和硫化物的HN-AD菌，如Zobellella taiwanensis DN-7〔38〕可將 1 000、2 000 mg/L 的氨氮分別在96、216 h內(nèi)降解完全。Janthinobacterium svalbardensis F19〔39〕在碳氮比僅為 2且初始 pH 為10條件下，能夠有效降解氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽和羥胺，去除率分別為 96.44%、92.32%、97.46%和96.69%。 Y.D.Jaffer等〔40〕研究了嗜唾液菌 Paracoccus saliphilus strain SPUM同時HN-AD和硫氧化工藝，經(jīng)過24 h培養(yǎng)，硝酸鹽和亞硝酸鹽的最大去除量分別為（14.17±0.31）、（11.22±0.31） mg/L，12 d 后硫酸鹽-硫的產(chǎn)量為（190±4.3）mg/L。這些能在惡劣環(huán)境下生長且能表現(xiàn)出良好脫氮性能的HN-AD菌的發(fā)現(xiàn)，為惡劣環(huán)境下含氮廢水的處理提供了良好的菌種資源。

2 惡劣環(huán)境下HN-AD菌在廢水處理中的應(yīng)用

在惡劣環(huán)境下分離獲得的具有良好脫氮性能HN-AD菌的實際應(yīng)用引起了部分研究者的關(guān)注，盡管相關(guān)應(yīng)用研究主要處于實驗室規(guī)模，通過人工接入優(yōu)勢菌種可達(dá)到強(qiáng)化模擬廢水生物脫氮的目的。耐鹽菌 Vibrio diabolicus SF16〔14〕直接投加到曝氣生物濾池中處理高鹽含氮廢水時，氨氮和總氮的去除率分別達(dá)97.14%、73.92%。在垂直流人工濕地系統(tǒng)中投入耐鹽脫氮菌 Zobellella denitrificans strain A63〔41〕，對氨氮、硝酸鹽和總氮的去除率分別達(dá)79.2%、98.7%和89.9%。通過接種假單胞菌Pseudomonas sp.HJ3〔42〕建立生物強(qiáng)化系統(tǒng)，對煤氣化廢水進(jìn)行同時脫氮除酚性能研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對氨氮、總氮和苯酚的去除率分別可達(dá)（67.07±0.76）%、（57.95%±0.12）%和（74.91±0.33）%。 Ying Wang 等〔43〕利用大孔樹脂和糞產(chǎn)堿菌Alcaligenes faecalis strain WY-01建立了吸附-釋放-生物降解系統(tǒng)來降解氨氮和高濃度苯酚，該體系中WY-01可將高達(dá)6 000 mg/L的苯酚降解完全，且初始質(zhì)量濃度為384 mg/L的氨氮去除率可達(dá)（99.03±3.95）%。Bin Zhao等〔44〕采用施氏假單胞菌P.stutzeri strain XL-2強(qiáng)化序批式生物膜反應(yīng)器處理高氨氮廢水，結(jié)果表明菌株XL-2的加入使脫氮效率提升了10%左右，且中間產(chǎn)物硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累量明顯減少，進(jìn)而大幅提升總氮去除率。

3 結(jié)語與展望

HN-AD菌能在利用有機(jī)碳源的同時，在單一有氧條件下實現(xiàn)同步硝化反硝化。為提高HN-AD菌的實際應(yīng)用性能，學(xué)者們將HN-AD菌在復(fù)雜環(huán)境條件下的脫氮性能作為研究重點。一方面，在極端pH、溫度、重金屬、難降解有機(jī)物和高鹽等惡劣環(huán)境下篩選獲得多種HN-AD菌株，這些菌株表現(xiàn)出較好的脫氮性能，甚至可實現(xiàn)難降解有機(jī)物的同時去除。HN-AD菌株自身的酶活特性及相關(guān)基因表達(dá)為其耐受惡劣環(huán)境的主要原因。另一方面，不同環(huán)境下的優(yōu)勢HN-AD菌可通過人工接入廢水處理系統(tǒng)來達(dá)到生物強(qiáng)化某類廢水處理的目的，并在實驗室水平取得一定強(qiáng)化效果。HN-AD菌株在不同極端環(huán)境下的生長及脫氮特性，表明它們在廢水處理方面有良好的發(fā)展?jié)摿?，提高了生物脫氮效率?/p>

目前HN-AD菌的研究主要處在實驗室規(guī)模，鮮有對實際廢水處理的報道。今后的研究可圍繞以下方面展開：

（1）利用分子生物學(xué)對惡劣條件下HN-AD菌的脫氮機(jī)理進(jìn)行深入研究。

（2）目前大部分研究是基于單個惡劣條件下進(jìn)行，接下來應(yīng)開展2個或多個惡劣條件下對HN-AD菌脫氮性能的影響研究。

（3）研究不同菌屬甚至相同菌屬的HN-AD菌對環(huán)境條件耐受性不同的原因。

（4）加強(qiáng)對HN-AD工藝技術(shù)方面的研究，使其盡快投入到實際廢水處理中。