寨卡病毒檢測技術(shù)的研究進(jìn)展*

鄭 茂 綜述，劉 曉，袁成良 審校

(四川省德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川德陽 618000)

寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA包膜病毒，直徑為40～70 nm，核酸長度約10.7 kb，分別編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[1]。寨卡病毒進(jìn)入人體后，多以隱性感染為主，引起低熱、皮疹、結(jié)膜炎及關(guān)節(jié)肌肉痛等非特異性臨床癥狀，易與登革熱病毒、基孔肯雅熱病毒感染等相混淆，早期診斷十分困難。寨卡病毒能通過胎盤和血腦屏障，孕婦感染后可能導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重先天性缺陷，其中以新生兒小頭畸形最為常見。宮內(nèi)感染寨卡病毒可能會使胎兒神經(jīng)發(fā)育遲緩，膀胱及腎臟發(fā)育不全，成人感染寨卡病毒可能會引起吉蘭-巴雷綜合征(GBS)。因此，建立靈敏且特異的寨卡病毒早期檢測技術(shù)，對快速診斷病毒感染尤為必要，本文簡要闡述了寨卡病毒的流行病學(xué)特征，并重點(diǎn)對近年來寨卡病毒的檢測技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 寨卡病毒感染的流行病學(xué)特征

寨卡病毒感染的患者或其他靈長類動物均可作為病毒傳染源，通過蚊媒傳播、母嬰傳播、性傳播等方式擴(kuò)散[2]。寨卡病毒最早于1947年在東非烏干達(dá)寨卡森林的恒河猴體內(nèi)分離成功，并因此而得名，不久后在非洲、太平洋島國等地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)人感染寨卡病毒的報(bào)道；2007年，在西太平洋的雅浦群島出現(xiàn)首次寨卡病毒大范圍疫情；2015年3月，巴西發(fā)生史上最大規(guī)模的寨卡病毒暴發(fā)、流行，導(dǎo)致超過20萬例患者感染，隨后在南美洲迅速傳播；2016年2月1日，WHO宣布寨卡病毒感染疫情已成為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，并于2016年11月18日將其轉(zhuǎn)為長期機(jī)制應(yīng)對[2]。

2016年2月，我國發(fā)現(xiàn)首例輸入性寨卡病毒感染病例，隨后廣東、浙江、江蘇、北京、河南等省市陸續(xù)報(bào)道了輸入性病例，其中廣東省出入境人流量巨大，是我國最主要的流行地區(qū)[3]。如果不及時(shí)控制輸入性寨卡病毒疫情，極可能造成暴發(fā)、流行。根據(jù)寨卡病毒基因組序列的不同，將其分為亞洲型和非洲型，兩種亞型同源性在90%左右。亞洲型寨卡病毒可導(dǎo)致新生兒小頭畸形、成人GBS等嚴(yán)重疾病，尚未見非洲型寨卡病毒導(dǎo)致上述疾病的報(bào)道，我國目前分離的所有寨卡病毒株均為亞洲型，總體變異率不高[4]。

2 寨卡病毒檢測技術(shù)

2.1病毒分離培養(yǎng) 病毒分離培養(yǎng)是應(yīng)用細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)從感染者血液、尿液、唾液、羊水、精液等各類標(biāo)本中分離出病毒，被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。寨卡病毒常用細(xì)胞培養(yǎng)、動物體內(nèi)接種等方式進(jìn)行分離。多種細(xì)胞系均適合于寨卡病毒的培養(yǎng)，如人胚腎細(xì)胞HEK293、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero等。動物體內(nèi)接種是最早應(yīng)用的病毒培養(yǎng)方法，將病毒接種于易感動物的皮下、腹腔、顱內(nèi)等部位，從而實(shí)現(xiàn)病毒的快速增殖，我國報(bào)道的首例寨卡病毒即采用乳鼠顱內(nèi)接種得以成功分離[5]。然而，寨卡病毒屬于第3類病原體，其分離培養(yǎng)必須在二級生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，故普通實(shí)驗(yàn)室難以開展。

80%以上的寨卡病毒感染為隱性感染，送檢的臨床標(biāo)本中病毒載量往往偏低，需要經(jīng)過多次培養(yǎng)傳代才可能分離到病毒。因此，病毒分離培養(yǎng)雖然特異度高，具有確診意義，但靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時(shí)長，難以實(shí)現(xiàn)大批量標(biāo)本的快速檢測，目前僅限于科研或其他鑒定方法的復(fù)核。

2.2血清學(xué)檢測

2.2.1單克隆抗體檢測 人體感染寨卡病毒3～5 d即可出現(xiàn)特異性IgM抗體，通過檢測IgM抗體可對病毒感染進(jìn)行早期診斷。IgG抗體在血清中出現(xiàn)較晚，存在時(shí)間長，若IgG抗體檢測陽性則可判斷為再次感染或慢性感染。NS1蛋白是寨卡病毒7種非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能以可溶性六聚體形式分泌至感染者外周血，在感染早期即可出現(xiàn)且存在時(shí)間長的蛋白。BOSCH等[6]采用重組NS1蛋白免疫小鼠篩選出一系列特異性抗體，建立了針對NS1抗原的快速檢測試紙，靈敏度和特異度可分別達(dá)81.0%、86.0%。KIM等[7]進(jìn)一步研發(fā)出寨卡病毒首個(gè)單克隆抗體快速檢測試劑盒，作用靶點(diǎn)是E蛋白和NS1蛋白的IgG或IgM抗體，IgG抗體的檢測靈敏度和特異度分別為99.0%、99.3%，IgM抗體的檢測靈敏度和特異度分別為96.7%、98.7%，且與登革熱病毒IgG和IgM抗體的交叉反應(yīng)率僅為16.7%、5.6%，可見該試劑盒使用簡便，且靈敏度和特異度均較高。我國學(xué)者向夢蓉等[8]設(shè)計(jì)的NS1抗原免疫層析膠體金試紙可成功區(qū)分寨卡病毒和登革熱病毒，同樣具有較高的靈敏度和特異度。單克隆抗體檢測技術(shù)日趨成熟，有望作為全球寨卡病毒流行地區(qū)的即時(shí)診斷和大規(guī)模篩查工具，但后期也仍需大量臨床樣本的持續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 根據(jù)ELISA原理的不同可分為間接法、競爭法、雙抗體夾心法等。ELISA檢測病毒感染的優(yōu)點(diǎn)是成本低、易操作、對設(shè)備要求低、可廣泛應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室，故成為目前寨卡病毒最常見的血清學(xué)檢測方法。ELISA檢測寨卡病毒的特異性靶位主要集中于NS1蛋白和E蛋白。研究顯示，通過構(gòu)建NS1基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達(dá)重組NS1蛋白或構(gòu)建NS1基因的真核表達(dá)載體，利用HEK293F細(xì)胞表達(dá)重組NS1蛋白純化蛋白后免疫小鼠，均能制備出高純度的抗NS1單克隆抗體[9-10]，這為建立ELISA檢測方法提供了基礎(chǔ)。

中國疾病預(yù)防控制中心的科研團(tuán)隊(duì)[11]選取寨卡病毒4種抗原(E蛋白胞外區(qū)、NS1蛋白、C蛋白、rE Ⅲ蛋白)進(jìn)行重組表達(dá)和純化，以間接法檢測相應(yīng)的IgG抗體，發(fā)現(xiàn)E蛋白胞外區(qū)和NS1蛋白的檢測靈敏度和特異度均達(dá)到較高水平，適合作為寨卡病毒的靶抗原。此外，該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)以NS1蛋白作為檢測抗原，采用間接法檢測感染者血清、尿液和唾液標(biāo)本中的IgA抗體，可以作為IgG抗體的替代指標(biāo)[12]。新加坡生物工程與納米技術(shù)研究所的科研團(tuán)隊(duì)[13]以單鏈DNA作為結(jié)合靶位點(diǎn)，建立了針對寨卡病毒NS1蛋白的ELISA雙抗體夾心法，具有極高的靈敏度，檢出限可低至0.1 ng/mL。

E蛋白是寨卡病毒感染和復(fù)制的必需蛋白質(zhì)，參與病毒與宿主受體細(xì)胞的識別，具有3種不同結(jié)構(gòu)域，包括β桶狀的Ⅰ區(qū)(E Ⅰ)、參與E蛋白二聚體形成的Ⅱ區(qū)(E Ⅱ)及具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的Ⅲ區(qū)(E Ⅲ)，其中E Ⅰ/E Ⅱ可作為鑒定寨卡病毒的特異性B細(xì)胞表位[14]。柳紅妙等[15]設(shè)計(jì)了一種檢測寨卡病毒E蛋白的非包被ELISA，該方法與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測結(jié)果基本一致，且與登革熱病毒無交叉反應(yīng)，在抗寨卡病毒藥物篩選方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢。

除了常見的NS1蛋白和E蛋白的檢測外，國外學(xué)者利用多肽微陣列的篩檢方法發(fā)現(xiàn)寨卡病毒NS2b蛋白中1段20個(gè)氨基酸的多肽序列(NS2b-20)，用于ELISA檢測的靈敏度和特異度可達(dá)96.0%、95.9%[16]。以該段特異性抗原多肽序列作為靶抗原，我國學(xué)者王天禹等[17]建立了一種高通量、高靈敏度的熒光素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(LISA)，應(yīng)用于寨卡病毒的IgG抗體檢測，為實(shí)現(xiàn)高通量自動化檢測提供了基礎(chǔ)，適合寨卡病毒感染的免疫學(xué)診斷與流行病學(xué)調(diào)查。此外，近期PAWLEY等[18]從巴西寨卡病毒感染者中分離出一種特異性抗體，可以直接結(jié)合寨卡病毒免疫顯性表位，從而設(shè)計(jì)出一種高效的ELISA檢測方法，適合多種體液標(biāo)本檢測，如尿液、唾液、血清和全血，其中尿液標(biāo)本無基質(zhì)效應(yīng)且采集方便，可作為優(yōu)先檢測標(biāo)本。由此可見，多種寨卡病毒靶抗原可以應(yīng)用ELISA檢測，感染者的各類體液標(biāo)本也適合作為檢測對象，有效拓展了血清學(xué)方法在病毒檢測中的應(yīng)用。

2.2.3中和試驗(yàn) 中和試驗(yàn)是病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，失去對易感動物致病力的試驗(yàn)方法，主要檢測待檢標(biāo)本中病毒特異性中和抗體的水平。蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)在檢測寨卡病毒中和抗體方面的應(yīng)用較為廣泛。PRNT以使蝕斑數(shù)減少50%的血清稀釋度作為效價(jià)，在確認(rèn)病毒陽性標(biāo)本上更具特異性。NASCIMENTO等[19]報(bào)道PRNT尤其適合于寨卡病毒感染者恢復(fù)期標(biāo)本的特異性檢測。因此，美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)建議寨卡病毒IgM抗體ELISA檢測陽性的血清標(biāo)本應(yīng)通過PRNT進(jìn)行確認(rèn)。

與病毒分離培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)相似，雖然PRNT特異度高，但試驗(yàn)過程非常耗時(shí)、耗力。為了彌補(bǔ)PRNT這一不足，KOISHI等[20]研發(fā)了基于高通量圖像熒光的寨卡病毒中和試驗(yàn)，該方法檢測速度更快，并實(shí)現(xiàn)了多標(biāo)本同時(shí)檢測，可用于寨卡病毒感染的臨床診斷確認(rèn)及臨床疫苗研究。

2.2.4其他血清學(xué)檢測技術(shù) LAURI等[21]報(bào)道了一種用于診斷寨卡病毒感染的新型血清學(xué)方法，利用時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)，用兩種發(fā)色基團(tuán)分別標(biāo)記NS1蛋白和細(xì)菌L蛋白，再與特定分子蛋白結(jié)合。這種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的血清學(xué)方法適用于診斷寨卡病毒感染，并易與其他黃病毒感染進(jìn)行鑒別。此外，還有研究報(bào)道可通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定血清中的寨卡病毒中和抗體[22]。

2.3核酸檢測

2.3.1反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR) 寨卡病毒感染者血液、尿液、唾液、精液、羊水或胎盤組織等標(biāo)本中均可檢出病毒RNA[23]。不同類型標(biāo)本檢出時(shí)間各有不同，血清在病毒感染后7 d內(nèi)可被檢出，尿液為20 d內(nèi)，精液可長達(dá)60 d。RT-PCR技術(shù)是從核酸水平檢測病毒RNA，相對于病毒分離培養(yǎng)，鑒定周期縮短。在患者感染早期，特別是臨床癥狀出現(xiàn)的1周內(nèi)，若檢測到寨卡病毒RNA即可快速確診[24]。但常規(guī)RT-PCR首先需要對病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增，最后通過凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，該方法操作較為煩瑣，只能對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，且易被污染，假陽性率偏高，目前已逐步被其他PCR技術(shù)代替。

2.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) RT-qPCR采用插入特異性熒光探針，實(shí)現(xiàn)對病毒RNA的定量分析，具有操作簡便，靈敏度、特異度高等特點(diǎn)，無需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析，故可有效避免人為操作帶來的污染，與常規(guī)RT-PCR相比，極大提高了檢測效率。在巴西東南部寨卡病毒流行區(qū)域，AYRES等[25]通過RT-qPCR在埃及伊蚊、白紋伊蚊和庫蚊中檢測出寨卡病毒RNA，直接證實(shí)了蚊媒傳播是寨卡病毒感染的主要途徑。

RT-qPCR根據(jù)采集熒光方法的不同主要分為染料法和探針法。染料法是利用某些熒光染料(如SYBR Green)與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，從而被熒光檢測器檢出。XU等[26]通過優(yōu)化基于SYBR Green探針的PCR引物設(shè)計(jì)后，實(shí)現(xiàn)了RT-qPCR一步法檢測寨卡病毒RNA，甚至可以檢測低至1 PFU/mL滴度的寨卡病毒。探針法是能與目的片段特異性結(jié)合的熒光探針，用相應(yīng)酶水解探針后釋放熒光，從而實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增產(chǎn)物，最為常用的是TaqMan探針。JUDICE等[27]通過研發(fā)一種新型TaqMan探針，使RT-qPCR在檢測寨卡病毒NS5基因方面達(dá)到更高的靈敏度，并且在血液和尿液標(biāo)本中的檢測結(jié)果高度一致。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部核酸交叉污染可能導(dǎo)致檢測結(jié)果呈假陽性，為了提高寨卡病毒核酸檢測的準(zhǔn)確性，也可對E基因、NS5基因等多個(gè)分子靶位同時(shí)進(jìn)行檢測，以涵蓋寨卡病毒多個(gè)譜系。

趙航等[28]通過分析寨卡病毒全基因組核酸序列，以NS5基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒，建立了基于RT-qPCR的寨卡病毒核酸檢測的高靈敏度方法，且該方法與登革熱病毒、丙型肝炎病毒無交叉反應(yīng)。此外，針對亞洲型和非洲型寨卡病毒，我國學(xué)者根據(jù)兩種亞型病毒基因組序列特征，分別設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RT-qPCR檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對病毒載量的絕對定量，可有效用于感染者的病原分型、早期診斷[29]。

針對RT-qPCR在極低寨卡病毒載量檢測方面的不足，南方醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)[30]研發(fā)了一種微滴式數(shù)字PCR，在極低病毒載量的臨床標(biāo)本中也表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。此外，廣東醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)[31]對PCR操作過程進(jìn)行簡化，自主研發(fā)了直接反轉(zhuǎn)錄定量PCR(dirRT-qPCR)，無需對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，可直接檢測臨床標(biāo)本中的寨卡病毒RNA，檢測限可低至95個(gè)RNA，且標(biāo)本量僅需5 μL。此外，dirRT-qPCR具有高通量和即時(shí)診斷的能力，還可以擴(kuò)展用于其他病毒檢測，顯現(xiàn)出床旁檢測及快速現(xiàn)場篩查的巨大潛力。

2.3.3其他基因擴(kuò)增技術(shù) 近年來，在傳統(tǒng)RT-PCR基礎(chǔ)上，科學(xué)家們研發(fā)出了一系列高效、靈敏的基因擴(kuò)增技術(shù)，如鏈侵入式擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)等，其中又以LAMP技術(shù)應(yīng)用較為廣泛。LAMP技術(shù)是在單一恒定溫度下(通常為65 ℃)，使用4～6個(gè)引物，通過鏈置換DNA聚合酶快速擴(kuò)增獲得新DNA，在1 h內(nèi)即可完成檢測[32]，且該方法僅需一臺普通加熱儀，可用于快速檢測及在一些資源匱乏地區(qū)對病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)測。鐘響等[33]針對寨卡病毒NS5基因設(shè)計(jì)并篩選的LAMP引物可在64 ℃ 50 min內(nèi)特異性擴(kuò)增NS5基因，并且與基孔肯雅熱病毒、登革熱病毒、黃熱病毒均無交叉反應(yīng)，檢測限達(dá)10 copy/μL，是普通PCR的100倍，可見改進(jìn)后的LAMP技術(shù)的靈敏度得到大幅提升。近期，ESTRELA等[34]在Bst DNA聚合酶基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化LAMP技術(shù)檢測條件，將寨卡病毒檢測時(shí)間縮短至10 min。對于寨卡病毒感染的急性期，CASTRO等[35]報(bào)道還可通過LAMP技術(shù)檢測感染者唾液標(biāo)本，從而實(shí)現(xiàn)快速診斷。

2.4生物傳感器檢測 生物傳感器是一種將生物元件與被測物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M(jìn)行檢測的儀器。隨著計(jì)算機(jī)軟件模擬技術(shù)的迅速發(fā)展，生物傳感器技術(shù)已擴(kuò)展到了病毒早期診斷的領(lǐng)域。MOCO等[36]使用石墨電極平臺研發(fā)了一種電化學(xué)生物傳感器，檢測寨卡病毒RNA僅需20 min，檢測限達(dá)1.72 copy/mL，且該傳感器在60 d內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性。也有學(xué)者使用表面印跡聚合物和氧化石墨烯復(fù)合材料，研發(fā)出新型寨卡病毒電化學(xué)生物傳感器，檢測限甚至可達(dá)到RT-qPCR的水平[37]。有文獻(xiàn)報(bào)道了一種基于芯片的電位傳感器，采用3D分子印跡技術(shù)可快速檢測緩沖液中低至10 PFU/mL滴度的寨卡病毒[38]。

此外，針對寨卡病毒NS1蛋白，TAKEMURA等[39]研發(fā)出一種等離子體共振放大免疫熒光生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)快速檢測。類似研究中，ZHANG等[40]還報(bào)道了一種基于生物檢測信號的新型乳液凝集試驗(yàn)，該試驗(yàn)簡便、廉價(jià)，適合于寨卡病毒NS1蛋白的現(xiàn)場檢測。

3 結(jié) 語

寨卡病毒是黃病毒屬中第一個(gè)被報(bào)道能通過母嬰傳播、性傳播的病毒。目前國內(nèi)外尚無抗寨卡病毒感染的靶向藥物，病毒疫苗也仍處于臨床試驗(yàn)階段。因此，建立經(jīng)濟(jì)、快速、特異度高的寨卡病毒檢測方法，對病毒感染的早期診斷尤為重要。病毒分離培養(yǎng)雖然是實(shí)驗(yàn)室檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)要求高，應(yīng)用極為局限，常規(guī)條件下難以開展，故普通實(shí)驗(yàn)室多通過血清學(xué)或核酸檢測寨卡病毒感染。血清學(xué)方法操作簡便、成本低廉、易于推廣，但仍存在一定程度的假陰性及與其他黃病毒屬的交叉反應(yīng)，故常將其與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，從而提高寨卡病毒的診斷效能。新興的生物傳感器技術(shù)，雖然初期檢測寨卡病毒靈敏度方面與PCR技術(shù)相比尚有一定差距，但隨著該技術(shù)的日益發(fā)展，目前其檢測限已達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)要求，且其快速和高通量檢測潛力是常規(guī)方法無法比擬的，應(yīng)用空間極為廣闊，有望取代現(xiàn)有的主流檢測技術(shù)。隨著病毒檢測技術(shù)及病毒基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展，寨卡病毒在不遠(yuǎn)的將來也能實(shí)現(xiàn)可預(yù)防、可控制、易治療。