水產(chǎn)品糖蛋白的分離分析研究進(jìn)展*

顧 盼，翟子揚(yáng)，祁艷霞，趙前程

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116000)

海洋是生命的故鄉(xiāng)，不僅有豐富的水資源，而且蘊(yùn)藏著寶貴的能源[1]，中國(guó)有黃海、渤海、東海、南海四大海域，海域遼闊，水產(chǎn)品種類豐富，有巨大地開(kāi)發(fā)利用潛力，前景廣闊。我國(guó)是水產(chǎn)品養(yǎng)殖大國(guó)，2017年水產(chǎn)品全年出口量達(dá)433.94萬(wàn)噸，出口額211.50億美元，同比分別增長(zhǎng)2.40%和1.99%[2]。水產(chǎn)品養(yǎng)殖種類豐富，其中貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量占養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%，是海洋養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分[3]。水產(chǎn)品不僅營(yíng)養(yǎng)豐富味道鮮美，而且還具有多種生理功能，如抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化等[4-5]。這些生理功能與水產(chǎn)品中的糖蛋白有著密切的關(guān)系。因此，本文回顧了近年來(lái)水產(chǎn)品糖蛋白的研究進(jìn)展，以期為水產(chǎn)品糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究提供參考依據(jù)。

糖蛋白(glycoprotein)是體內(nèi)重要的生物大分子，是由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)相連構(gòu)成的一種結(jié)合蛋白質(zhì)，在大多數(shù)情況下，糖含量低于蛋白質(zhì)含量，并且糖鏈作為綴合蛋白質(zhì)的輔基，廣泛存在于生物體中[6]，蛋白質(zhì)糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、構(gòu)象穩(wěn)定和活性等方面具有重要影響[7]。目前，隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有研究預(yù)測(cè)生物體內(nèi)有50%以上的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化[8]。糖蛋白同時(shí)具有糖和蛋白質(zhì)的性質(zhì)，大多可溶于水、稀酸、稀堿和鹽溶液中，但要注意在提取過(guò)程中必須保證糖蛋白分子的完整性，防止過(guò)酸、過(guò)堿、高溫以及劇烈的機(jī)械作用等對(duì)糖蛋白分子的破壞，使其失去活性。

1 糖蛋白的提取

1.1 鹽溶液浸提法

糖蛋白在稀鹽和緩沖鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性和溶解度性，通常將氯化鈉溶液做浸提液，這主要因?yàn)槿芤褐写嬖诘柠}離子可以與蛋白質(zhì)結(jié)合起到保護(hù)作用，蛋白質(zhì)不易變性便于提取。劉淑集等[9]以翡翠貽貝為原料，確定最佳提取條件為氯化鈉濃度0.2 mol/L，料液比1:1，提取時(shí)間61 min，提取溫度62 ℃，該條件下糖蛋白的提取率為51.55%。范秀萍等[10]從珠母貝全臟器中進(jìn)行糖蛋白分離，結(jié)果表明最佳分離提取條件為：浸提劑為濃度1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比為1:10，65 ℃下浸提60 min，此時(shí)珠母貝糖蛋白得率為3.37%。戴宏杰[11]以虎斑烏賊為研究對(duì)象，確定了最佳提取條件：氯化鈉濃度3.8 mol/L，料液比1:20，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度66 ℃，虎斑烏賊肌肉糖蛋白提取率為7.87%。章建設(shè)等[12]以魷魚內(nèi)臟為原料，確定提取工藝為：NaCl溶液濃度為3%，料液比為1:6、浸提時(shí)間為60 min、浸提溫度為80 ℃，此條件下糖蛋白得率最高。李雨哲等[13]從馬氏珍珠貝中進(jìn)行糖蛋白的提取，確定其最佳提取條件：pH 7.2的1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比1:2進(jìn)行冰浴，4 ℃下離心過(guò)濾得到糖蛋白提取液。何曉梅等[14]以三角帆蚌臟器為原料，以0.3 mol/L NaC1溶液為提取溶劑，浸提溫度4 ℃、料液比1:15、浸提時(shí)間9 h，此條件下糖蛋白得率大于3%。

1.2 水浸提法

由于糖鏈的多羥基結(jié)構(gòu)具有高度親水性，糖蛋白或糖肽在水中極易溶解，所以可采用水來(lái)提取各種糖蛋白或糖肽。該方法操作簡(jiǎn)便，根據(jù)糖蛋白的來(lái)源和性質(zhì)不同提取條件也略有差異。黃來(lái)珍等[15]對(duì)近江牡蠣采用料液比1:4，水浸提時(shí)間120 min，溫度4 ℃，高速離心取上清液超濾濃縮，得到糖蛋白，其中總糖含量1.19%，可溶性蛋白含量2.18%。范秀萍等[16]以波紋巴非蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，水作浸提劑提取糖蛋白，提取條件為：料水比為1:10，浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間60 min，60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。馮曉梅等[17]對(duì)牡蠣采用料水比1:1低溫提取，水浸提時(shí)間120 min，溫度4 ℃，離心后凍干得到糖蛋白粗提物。郁迪等[18]以菲律賓蛤仔肉為原料，料液比1:3，90 ℃浸提，第一次浸提4 h，第二次浸提3 h，兩次浸提溶液混合醇沉并冷凍干燥得粗提物，純化后得到糖蛋白。夏光華等[19]以鯽魚卵為原料，采用水浸提的方法提取糖蛋白，料水比1:1浸提30 min，高速離心取上清液加入等體積的90%苯酚溶液攪拌2～3 h，二次離心得到粗糖蛋白。

2 糖蛋白的富集

水產(chǎn)品是復(fù)雜的生物體系，糖蛋白豐度低，而且后續(xù)的檢測(cè)中容易受到其他非糖基化蛋白質(zhì)的干擾，所以對(duì)糖蛋白進(jìn)行分離富集，去除干擾組分，對(duì)后續(xù)糖蛋白的分析檢測(cè)具有十分重要的意義。

2.1 凝集素親和層析法

凝集素親和層析法是將凝集素以共價(jià)形式與不溶性載體相連接作為親和吸附劑的層析技術(shù)。適用于從混合物中分離或分析多糖、糖蛋白、細(xì)胞膜碎片、酶、抗體復(fù)合物等糖類及糖復(fù)合物。凝集素是一類糖結(jié)合蛋白，能特異性識(shí)別并結(jié)合單糖或聚糖結(jié)構(gòu)中特定的序列，它們與糖鏈的結(jié)合既是非共價(jià)又是可逆的，因此在凝集素捕獲糖蛋白或糖肽后，可以通過(guò)特定的單糖與凝集素的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合將糖蛋白或糖肽洗脫下來(lái)。主要分成一種凝集素、多種凝集素或連續(xù)凝集素親和層析三種方法，一種凝集素親和方法操作簡(jiǎn)單但相對(duì)的僅能富集特定的糖蛋白或糖肽，多種凝集素法可以富集較復(fù)雜的糖蛋白，實(shí)驗(yàn)技術(shù)相對(duì)成熟、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。凝集素親和法應(yīng)用靈活多樣，植物凝集素最為常見(jiàn)如：刀豆素A、麥胚素、花生凝集素和大豆凝集素等。Wang[20]結(jié)合了多種凝集素的特異性，發(fā)展了一種包含刀豆凝集素，麥芽凝集素和木菠蘿凝集素三種凝集素的富集檢測(cè)血清中蛋白的策略，該技術(shù)已成功應(yīng)用于人血清的蛋白質(zhì)分析，并且發(fā)現(xiàn)了人類血清的蛋白質(zhì)都是糖基化的。Liu等[21]以氧化葡聚糖作為間隔物促進(jìn)合成了硅基材料伴刀豆球蛋白凝集素，并證實(shí)了該凝集素親和富集糖蛋白和糖肽具有良好的效果。劉玲[22]以鰱魚Ⅳ期卵為原料提取到半胱氨酸蛋白酶抑制劑粗提液，純化分級(jí)得到具有較高活性的組分，該活性部分經(jīng)刀豆凝集素Sepharose 4B親和層析富集純化后確定其為糖蛋白。

2.2 酰肼化學(xué)法

酰肼化學(xué)法是利用糖蛋白或糖肽上糖鏈的順式鄰二羥基結(jié)構(gòu)與高碘酸反應(yīng)生成醛，醛基可以特異性地與酰肼樹(shù)脂上的氨基反應(yīng)形成共價(jià)鍵，從而被酰肼樹(shù)脂捕獲，并利用PNGase F酶或胰蛋白酶將糖肽從酰肼樹(shù)脂上釋放，得到富集后的糖基化肽段。酰肼化學(xué)反應(yīng)特異性高有助于糖基化位點(diǎn)的確認(rèn)，并且洗脫過(guò)程中蛋白質(zhì)損失小，但該方法反應(yīng)步驟多操作復(fù)雜，且條件難以控制。Zhang等[23]對(duì)人血清中的質(zhì)膜蛋白利用酰肼化學(xué)法進(jìn)行分析鑒定和定量糖肽。Sudhir等[24]采用酰肼法從人支氣管上皮細(xì)胞富集糖蛋白，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，在人支氣管上皮細(xì)胞中鑒定到了317個(gè)N-連接糖蛋白含608個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)。

酰肼法和凝集素富集法是糖蛋白富集應(yīng)用較廣泛的兩種技術(shù)，有報(bào)道認(rèn)為兩種方法互補(bǔ)使用可以提高糖基化位點(diǎn)的鑒定數(shù)目，但也有研究表明兩種方法并未顯示出顯著的互補(bǔ)性。雖然酰肼法的糖肽富集效率較凝集素富集法高，但是凝集素法鑒定到的糖蛋白和糖基化位點(diǎn)數(shù)目卻較酰肼法高[25]。

2.3 親水相互作用色譜法

由于糖鏈的多羥基結(jié)構(gòu)具有高度親水性，因此許多親水性的層析介質(zhì)可以用于糖蛋白或糖肽的富集，如纖維素[26]和瓊脂糖[27]。該方法可以富集各種類糖肽，操作簡(jiǎn)便，但是不可避免的會(huì)有非特異性吸附，不能有效區(qū)分不同類型的糖肽或者糖蛋白，從而影響后續(xù)分析的準(zhǔn)確性[28]。葉志國(guó)[29]以菲律賓蛤仔全臟器為研究對(duì)象進(jìn)行糖蛋白的提取，粗糖蛋白經(jīng)DEAE-52纖維素、Sephadex-G100柱層析分離純化，得到中性糖蛋白GP-1和酸性糖蛋白GP-2二個(gè)主要組分。秦玉青[30]從雌性扇貝生殖腺脫脂后提取糖蛋白，經(jīng)DEAE-纖維素柱鹽析、透析、Sephadex-G100純化及冷凍干燥后，得到中性糖蛋白(FNGP)和酸性糖蛋白(FAGP)。近年來(lái)，基于親水材料的萃取技術(shù)得到了一定的發(fā)展，在瓊脂糖、多聚酰胺等傳統(tǒng)材料的基礎(chǔ)上[31-32]，又出現(xiàn)了兩性離子-親水作用色譜材料[33]和基于點(diǎn)擊化學(xué)的親水作用色譜填料[34]，顯著增加了親水作用色譜對(duì)糖基化肽段富集的特異性和富集倍數(shù)，促進(jìn)了親水作用色譜在蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)規(guī)?；治鲋械膽?yīng)用。此外，結(jié)合質(zhì)譜分析，親水作用材料能夠用于完整的糖基化肽段鑒定和定量[35-36]，親水作用色譜在糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)分析中具有重要的價(jià)值。

2.4 硼酸親和層析法

硼酸親和技術(shù)是利用硼酸基團(tuán)與糖肽中糖鏈上的順式二羥基的可逆反應(yīng)形成環(huán)狀二酯，并且通過(guò)這種共價(jià)配位作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的分離和純化。在堿性條件下，硼酸基團(tuán)可與順式二羥基結(jié)構(gòu)相互作用形成穩(wěn)定的五元環(huán)絡(luò)合物，分子被介質(zhì)吸附；在酸性條件下絡(luò)合的部分被打開(kāi)，分子從介質(zhì)上解吸。硼酸親和層析法可以用于分離純化帶有順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物，例如：糖蛋白、核苷、核苷酸、糖類等。該方法操作簡(jiǎn)單只需改變pH值，優(yōu)化后可以洗脫非特異性吸附，專一性和普適性強(qiáng)[37]。Ren等[38]使用親水性的交聯(lián)劑通過(guò)原位聚合反應(yīng)以制備了親水性的硼親和整體柱，該硼親和整體柱被成功的用于糖蛋白的富集。Luo等[39]用氨基苯硼酸修飾二維單層氧化石墨烯后結(jié)合卵清蛋白，經(jīng)溶膠—凝膠法在其表面包覆一層有機(jī)硅，去除模板蛋白后得到了對(duì)卵清蛋白有雙重識(shí)別能力的硼親和印跡材料，其結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)具有硼親和配基以及與卵清蛋白結(jié)構(gòu)相匹配的形狀，能排除糖蛋白卵鐵傳遞蛋白的干擾，從雞蛋清中特異性選擇富集卵清蛋白，極大地提高了硼親和材料的選擇性。

3 糖蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析

3.1 傳統(tǒng)分析方法

傳統(tǒng)分析方法主要針對(duì)純化的單一組分的糖蛋白。確定一種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)主要有以下幾點(diǎn)：分子量大小、單糖組成、α-、β-異構(gòu)體、環(huán)狀結(jié)構(gòu)及糖苷鍵類型等情況。根據(jù)寡糖鏈和蛋白質(zhì)連接類型的不同，可分為N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇錨糖基化(GPI-Anchor)四種連接形式[40]，其中N-糖基化、O-糖基化兩種連接形式最為常見(jiàn)。對(duì)于提取到的糖蛋白傳統(tǒng)分析方法主要從糖蛋白的等電點(diǎn)測(cè)定、氣相色譜法、紅外光譜分析、β-消除反應(yīng)和紫外光譜分析等幾方面進(jìn)行。糖蛋白可分為酸性糖蛋白和堿性糖蛋白，酸堿性可通過(guò)其等電點(diǎn)的pH值來(lái)確定，糖蛋白糖鏈的單糖組成可通過(guò)氣相色譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。紅外光譜分析可以測(cè)定糖蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)的類型、異頭異構(gòu)體，紅外吸收峰的位置與強(qiáng)度反映了分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，可用于識(shí)別物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成或確定其化學(xué)基團(tuán)，而吸收譜帶的吸收強(qiáng)度與化學(xué)基團(tuán)的含量有關(guān)。β-消除反應(yīng)主要用來(lái)確定糖蛋白的糖苷鍵類型，N-糖苷鍵和O-糖苷鍵這兩種最為常見(jiàn)，前者對(duì)堿穩(wěn)定，后者易被堿打開(kāi)[41]。O-糖苷鍵被堿打開(kāi)后，在糖肽連接處若為絲氨酸即轉(zhuǎn)變成α-氨基丙烯酸，若為蘇氨酸，則轉(zhuǎn)變成為α-氨基丁烯酸，二者均在240 nm下具有特征性紫外吸收[42]。

馮曉梅[17]對(duì)從青島牡蠣提取到的糖蛋白組分F22進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明F22是酸性糖蛋白，等電點(diǎn)為pH 5.5，紅外光譜分析顯示具有酰胺鍵特征吸收峰，F(xiàn)22的中性單糖是由葡萄糖這一種單糖組成的同多糖，由15種氨基酸所組成，其中纈氨酸在總氨基酸中占比最大，相對(duì)含量達(dá)到37.7%；其次為甘氨酸，其相對(duì)含量達(dá)到了10%以上，該糖蛋白是β-折疊結(jié)構(gòu)，糖苷鍵類型為吡喃型，糖肽鍵類型為N-糖肽鍵。徐明生等[43]從河蜆中提取到糖蛋白，經(jīng)鑒定該糖蛋白相對(duì)分子量19030 D，存在O-糖肽鍵，具有多糖的特征吸收，含有吡喃糖β-型糖苷鍵。包郁明[44-45]針對(duì)皺紋盤鮑臟器提取得到的糖蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該糖蛋白含有8種單糖，17種氨基酸，同時(shí)鑒定到該糖蛋白是β-折疊結(jié)構(gòu)，糖苷鍵類型為吡喃型，糖肽鍵類型為O-糖肽鍵。遲長(zhǎng)鳳等[46]以貽貝為原料提取糖蛋白，通過(guò)分析表明貽貝糖蛋白的分子量約為16.9 kDa，含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵，糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46%，由15種氨基酸組成，單糖的組成比例為D-葡萄糖:L-阿拉伯糖:D-半乳糖:D-果糖:D-甘露糖=1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。陳銀[47]以黑魚魚卵為原料提取糖蛋白，經(jīng)鑒定黑魚糖蛋白含有N-糖苷鍵和O-糖苷鍵，單糖組成為甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.20:1.00:12.22。徐永健等[48]以大海馬為原料提取粗糖蛋白，經(jīng)純化分級(jí)得到2個(gè)組分HG-11和HG-21，HG-11有15種氨基酸，HG-21有16種氨基酸，兩組分中的單糖有甘露糖、核糖、葡萄糖和半乳糖四種，鑒定到該糖蛋白是通過(guò)O-糖苷鍵連接的并且具有α螺旋結(jié)構(gòu)，糖苷鍵是α型吡喃糖。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

對(duì)于復(fù)雜生物體系中提取富集出來(lái)的的混合糖蛋白，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對(duì)其有較好的分析能力，蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)可以通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)確定，目前蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)包括雙向凝膠電泳[49]、蛋白質(zhì)芯片[50]、酵母雙雜交、同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(isotope coded affinity tags，ICAT)和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[51]。雙向凝膠電泳該技術(shù)是分析和檢測(cè)來(lái)自復(fù)雜生物蛋白質(zhì)的有力工具，根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同來(lái)分離蛋白質(zhì)[52-53]。蛋白質(zhì)芯片是一種蛋白質(zhì)組檢測(cè)技術(shù)，具有高度并行性、高通量、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)混合物中單個(gè)蛋白質(zhì)與他們相對(duì)應(yīng)的識(shí)別物間的相互作用[54]。液相色譜-質(zhì)譜(High performance liquid chromatography -mass spectrometry，HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)基本原理是先采用液相色譜將不同的糖肽進(jìn)行分離，然后進(jìn)入質(zhì)譜。在質(zhì)譜中首先將樣品離子化帶上電荷，然后帶電粒子經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束并進(jìn)入質(zhì)量分析器，在質(zhì)量分析器中，電場(chǎng)或磁場(chǎng)可以在空間或時(shí)間上對(duì)不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行分離，或是透過(guò)過(guò)濾的方式，將它們分別聚焦到檢測(cè)器上，從而獲得質(zhì)量與濃度(或分壓)相關(guān)的圖譜，最后是數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，即將質(zhì)譜所得的實(shí)際圖譜與肽段碎裂產(chǎn)生的理論圖譜進(jìn)行對(duì)比以確定肽段序列及其歸屬的蛋白質(zhì)[55]，HPLC-MS技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)成功地用于糖肽或糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析[56-57]。

糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括定性和定量?jī)蓚€(gè)方面，定性主要是對(duì)于蛋白質(zhì)的確定、糖基化位點(diǎn)的鑒定，以及完整的糖鏈信息三方面進(jìn)行解析，其中糖基化位點(diǎn)的鑒定在糖蛋白解析中顯得至關(guān)重要，因?yàn)橥暾腔牡亩?jí)譜圖非常復(fù)雜，所以不能直接搜索數(shù)據(jù)庫(kù)[58]。目前最常見(jiàn)最成熟的方法是通過(guò)內(nèi)切糖苷酶切除糖鏈并在糖基化位點(diǎn)引入一定質(zhì)量差異，將PNGase F作用在氨基酸與五糖核心中第一個(gè)GlcNAc之間，酶切后使得糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺(AsnN，114.043 Da)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?AspD，115.027 Da)造成相對(duì)分子量增加0.98 Da，從而起到糖基化位點(diǎn)質(zhì)量標(biāo)簽的作用被質(zhì)譜檢測(cè)到[59-60]。定量主要是對(duì)于生物樣本中糖基化程度進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量，相對(duì)定量又分為非標(biāo)定量和標(biāo)記定量?jī)煞N。在非標(biāo)定量策略中，蛋白或肽段通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜或串級(jí)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度、譜峰面積及譜圖數(shù)進(jìn)行定量。同位素標(biāo)記定量時(shí)給肽段引入一個(gè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，使得肽段分子量發(fā)生改變，通過(guò)比較不同同位素標(biāo)記的肽段的豐度從而對(duì)蛋白進(jìn)行定量。常用的同位素標(biāo)記方法包括化學(xué)反應(yīng)法、代謝標(biāo)記法以及酶促標(biāo)記法?；瘜W(xué)標(biāo)記法中常用的有ICAT (isotope-coded affinity tags)和ITRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)技術(shù)[61]。

陳寧等[62]從刺參水煮液提取到糖蛋白粗制品，得到了分子質(zhì)量分別為964.3 kD和2.5 kD的兩種糖蛋白，通過(guò)液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)確定其含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖6種單糖，含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，半必需氨基酸組氨酸的含量占比最高，還鑒定出該糖蛋白含有酸性黏多糖物質(zhì)。王曉斐[63]以中國(guó)對(duì)蝦為研究對(duì)象，經(jīng)免疫印跡確定過(guò)敏原組分為Pen c 1，結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明Pen c 1是分子量為36 kD的糖蛋白，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋，含有D-甘露糖和D-葡萄糖，存在O-糖苷鍵，經(jīng)質(zhì)譜分析表明122位天冬酰胺為Pen c 1的N-糖基化位點(diǎn)，第101位蘇氨酸為潛在的O-糖基化位點(diǎn)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于糖蛋白的檢測(cè)，李鳳等[64]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析新紅細(xì)胞生成刺激蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜和糖肽結(jié)構(gòu)，根據(jù)MS/MS碎片信息，結(jié)果顯示出3種類型的O-糖肽，其糖鏈組成為GalNAcGal(Neu Ac)_2、GalNAcGal(NeuAc)_1和GalNAcGal。江靜等[65]采用自制的親水固相萃取富集柱和生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對(duì)糖基化蛋白質(zhì)核糖核酸酶B進(jìn)行系列分析。結(jié)果表明：其糖基化位點(diǎn)為34位的Asn，糖鏈主要為5種高甘露糖型結(jié)構(gòu)(Man5-9GlcNAc2)。侯向昶等[66]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)燕窩中唾液酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示五種不同的燕窩唾液酸含量在6.0%～8.5%之間。同時(shí)劉彥品[67]也利用該技術(shù)測(cè)定奶粉中唾液酸含量，該方法前處理簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、靈敏度高，可廣泛用于母乳、牛乳和奶粉中唾液酸含量的測(cè)定。

4 結(jié) 語(yǔ)

水產(chǎn)品糖蛋白具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，根據(jù)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的不同可以采用不同的提取富集方法，但目前各種先進(jìn)的糖蛋白富集分析的方法多是針對(duì)于人體血液等組織的檢測(cè)，應(yīng)用于水產(chǎn)品糖蛋白的分析相對(duì)較少。隨著水產(chǎn)品糖蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究深入，將會(huì)有更多更好的技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品糖蛋白的分離分析。每種提取和富集的方法各有利弊，綜合來(lái)看，在研究過(guò)程中最好可以結(jié)合不同方法的優(yōu)勢(shì)，采用多種方法相結(jié)合來(lái)進(jìn)行更有效更全面的提取、富集分離、分析水產(chǎn)品糖蛋白。我國(guó)有豐富的海洋資源，為我們對(duì)水產(chǎn)品糖蛋白的研究提供了便利，但目前對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究較少，今后應(yīng)基于蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)的先進(jìn)技術(shù)手段加強(qiáng)對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究。