鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Di19參與調(diào)控大豆干旱響應(yīng)的研究進(jìn)展

張古文，沈 立，鄭華章，劉 娜，馮志娟，龔亞明，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州310021； 2.浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司，浙江 杭州310020； 3.余姚市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)總站，浙江 余姚315400)

從古至今，干旱始終是人類面臨的最主要自然災(zāi)害。全世界干旱、半干旱地區(qū)約占陸地總面積的34.9%，40%以上的耕地受到干旱影響[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國旱地面積占總耕地面積的70%以上，干旱、半干旱地區(qū)耕地占總耕地面積的43%以上[2]。近年來，全球氣候異常趨于常態(tài)化，高溫、干旱、極寒和洪澇等極端天氣時(shí)有發(fā)生，其中，干旱對(duì)糧食生產(chǎn)的威脅最為嚴(yán)重，每年因干旱而造成的損失幾乎等于其他所有環(huán)境因子的總和，因此干旱已成為影響糧食生產(chǎn)的最主要障礙因素[3]。大豆在豆類作物中對(duì)干旱最為敏感，其根系不發(fā)達(dá)，需水量多，在主產(chǎn)區(qū)的東北、黃淮以及南方地區(qū)，大豆生產(chǎn)經(jīng)常會(huì)遭遇夏季干旱以及春夏連續(xù)干旱等季節(jié)性干旱的威脅，水分虧缺已成為制約大豆產(chǎn)量提高和品質(zhì)提升的最重要環(huán)境因子[4-5]。鋅指蛋白是含有鋅指結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)，鋅指是由一個(gè)含有大約30個(gè)氨基酸的環(huán)和一個(gè)與環(huán)上的4個(gè)半胱氨酸(Cys)或2個(gè)Cys和2個(gè)組氨酸(His)配位的Zn2+構(gòu)成，形成的結(jié)構(gòu)像手指狀。鋅指蛋白是植物中發(fā)現(xiàn)的種類最多、調(diào)控作用最顯著的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Di19(Drought induce 19)是一種受干旱誘導(dǎo)的小分子鋅指蛋白，最早于2006年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，之后的研究表明，它在高等植物中廣泛存在，并在植物的抗逆響應(yīng)中起積極作用[6-9]。本文針對(duì)大豆耐旱性機(jī)理、鋅指蛋白以及其家族成員Di19，對(duì)國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，對(duì)未來大豆耐旱性研究具有指導(dǎo)意義與參考價(jià)值。

1 大豆耐旱性研究進(jìn)展

1.1 大豆耐旱性相關(guān)的形態(tài)學(xué)與生理生化研究

國際上大豆耐旱性研究開始于20世紀(jì)70年代，我國大豆耐旱性研究始于20世紀(jì)90年代。最初的研究集中于干旱對(duì)大豆植株形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，包括根、莖、葉、植株、豆莢等。干旱脅迫下，大豆植株根系伸長受阻、葉片萎蔫、生長緩慢、單株莢數(shù)下降、籽粒變小、產(chǎn)量降低，但與干旱敏感型品種相比，抗旱性強(qiáng)的品種發(fā)根早、主根長、側(cè)根發(fā)達(dá)且數(shù)量多、根毛密度和總長數(shù)值大，產(chǎn)量下降幅度小[10-12]。之后，研究集中于生理生化指標(biāo)的變化。Zhang等[13]研究了干旱脅迫對(duì)耐旱性不同的兩個(gè)大豆品種葉片保護(hù)酶活性的影響；Sakamoto等[14]研究了干旱、低溫以及鹽脅迫對(duì)大豆根系保護(hù)酶活性的影響；王啟明等[15]研究了干旱脅迫對(duì)不同大豆品種苗期葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和細(xì)胞膜透性的影響。三者的研究結(jié)果一致表明，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(包括游離脯氨酸、游離氨基酸、可溶性糖、甜菜堿等有機(jī)溶質(zhì)與K+、Ca2+等無機(jī)離子)的積累，保護(hù)酶活性的提高，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等，對(duì)提高大豆的耐旱性均具有積極意義。前期研究結(jié)果表明，大豆對(duì)水分的需求有階段性差異，苗期需水量最少，開花期急劇上升，結(jié)莢期需求量最大，鼓粒期呈降低趨勢；遺傳學(xué)方面，抗旱性是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，涉及到植株性狀的許多方面，實(shí)際的育種工作中，對(duì)大批后代材料進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測和形態(tài)學(xué)鑒定是不現(xiàn)實(shí)的。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行抗旱機(jī)理研究和抗旱性改良是大豆抗旱育種的必由之路[16-17]。

1.2 大豆耐旱性相關(guān)的遺傳學(xué)研究

近年來，迅速發(fā)展的分子遺傳學(xué)為大豆抗旱性的遺傳研究提供了有力的工具，尤其是數(shù)量性狀基因(QTL)作圖法在基因克隆與定位、比較基因組和育種改良等方面的廣泛應(yīng)用，極大地促進(jìn)了大豆抗旱性的遺傳研究。1996年和1998年，Mian等[18-19]先后利用2個(gè)作圖群體，分別發(fā)現(xiàn)4個(gè)和6個(gè)獨(dú)立的RFLP標(biāo)記與水分利用效率相關(guān)的QTL連鎖，能解釋各自性狀表型變異的38.0%和53.0%，開啟了大豆抗旱性遺傳研究的序幕。劉瑩[20]利用科豐1號(hào)×南農(nóng)11382-2的衍生RIL群體，檢測到13個(gè)控制比根重、比總根長、比根體積的QTL位點(diǎn)，并將其分別定位于N6-C2、N8-D1b+W、N11-E和N18-K連鎖群上。Du等[21]同樣利用科豐1號(hào)×南農(nóng)11382-2的衍生群體對(duì)大豆葉片上部和背部腺毛密度QTL進(jìn)行了定位，共獲得15個(gè)與葉片水分利用率相關(guān)的QTL，有6個(gè)位點(diǎn)可以同時(shí)用復(fù)合區(qū)間作圖法和多重區(qū)間作圖法檢測到，其中qtuH-2位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率在兩種作圖法中分別達(dá)31.81%和29.4%，暗示其可能為抗旱性主效位點(diǎn)。李燦東等[22]以紅豐11為輪回親本、Clark為供體親本構(gòu)建回交群體進(jìn)行耐旱性QTL位點(diǎn)篩選，結(jié)果表明，利用等位基因卡方測驗(yàn)方法可檢測到23個(gè)SSR偏分離位點(diǎn)，分別與葉片持水能力、根長、根干質(zhì)量、產(chǎn)量、生物量具有一致性，結(jié)合耐旱性QTL定位，共檢測到33個(gè)QTL，其中有17個(gè)位點(diǎn)可被兩種方法同時(shí)檢測到，如位于E連鎖群的Sat_136位點(diǎn)、位于K連鎖群的Satt398位點(diǎn)等，這些位點(diǎn)可能是控制大豆耐旱性的重要位點(diǎn)。Abdel-Haleem等[23]利用PI416937×Benning群體對(duì)控制葉片萎蔫等級(jí)的位點(diǎn)進(jìn)行了定位，共定位到7個(gè)QTL，其中5個(gè)來自耐旱親本PI416937，2個(gè)來自不耐旱親本Benning。邢光南等[24]利用兩個(gè)重組自交系對(duì)影響大豆葉面茸毛密度的QTL進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測到2個(gè)葉面茸毛密度主效QTL與耐旱性顯著相關(guān)，貢獻(xiàn)率分別達(dá)到20.7%和21.7%，且兩個(gè)群體葉片茸毛密度遺傳構(gòu)成中加性QTL貢獻(xiàn)率占20.7%～36.2%，表明大豆葉片絨毛密度的遺傳涉及多個(gè)效應(yīng)不同的基因。但到目前為止，大豆耐旱性的遺傳依舊是一個(gè)相對(duì)薄弱的研究領(lǐng)域，仍停留在QTL初定位層面，尚無進(jìn)一步的功能基因挖掘以及基因功能驗(yàn)證方面的報(bào)道[25]。

1.3 大豆耐旱性相關(guān)的基因組學(xué)研究

近年來，隨著人們對(duì)植物耐旱機(jī)理了解的日益深入，大豆耐旱相關(guān)基因組學(xué)研究的進(jìn)展也十分迅速，美國、巴西、阿根廷等先進(jìn)生產(chǎn)國的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用日漸成熟和深入，我國也加快了研究步伐。2010年，張大勇等[26]首次從大豆中鑒定出50個(gè)水通道蛋白，并發(fā)現(xiàn)液泡膜水通道蛋白對(duì)干旱脅迫響應(yīng)敏感，編碼的蛋白與鋅指蛋白存在互作，參與耐旱性調(diào)控。隨后，F(xiàn)aria等[27]發(fā)現(xiàn)大豆轉(zhuǎn)錄因子GmNAC6基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和滲透壓脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。Le等[28]利用基因芯片分析的方法，研究了干旱脅迫下大豆盛花期(R2)和鮮莢采摘期(V6)葉片的轉(zhuǎn)錄組變化，結(jié)果表明，在V6和R2期，分別有612個(gè)上調(diào)基因和463個(gè)下調(diào)基因同時(shí)被檢測到，大多數(shù)上調(diào)基因編碼調(diào)節(jié)蛋白，如DREB、NAC等轉(zhuǎn)錄因子，還有部分基因編碼功能蛋白，如胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶等；進(jìn)一步的分析表明，大部分GmNAC轉(zhuǎn)錄因子家族和激素相關(guān)基因在干旱脅迫后表達(dá)下調(diào)，大部分與光合相關(guān)基因也在干旱脅迫后下調(diào)。Vidal等[29]構(gòu)建了干旱脅迫下兩個(gè)抗旱性差異顯著大豆品種的抑制性差減文庫，并對(duì)其上調(diào)基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在超過6 000個(gè)SNP位點(diǎn)中，有165個(gè)位于大豆染色體末端，主要涉及MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子。Xu等[30]對(duì)干旱脅迫下大豆Hsp90蛋白的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果從大豆中分離了12個(gè)GmHsp90基因，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，高溫、干旱、鹽脅迫條件下，所有家族成員的表達(dá)量均上調(diào)，5個(gè)家族成員(GmHsp90A2、GmHsp90A4、GmHsp90B1、GmHsp90C1.1、GmHsp90C2.1)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脅迫抗性提高，同時(shí)部分轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量顯著升高，一定程度上表明脅迫抗性的提高與脯氨酸含量的升高有關(guān)。Luo等[31]采用微陣列的方法從野生大豆中鑒定出一個(gè)脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子GsWRKY20，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，其基因表達(dá)受脫落酸、鹽脅迫、低溫脅迫以及干旱脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子發(fā)芽期以及幼苗生育早期，GsWRKY20基因表達(dá)量顯著升高，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)脫落酸的敏感性顯著降低，表明GsWRKY20基因在擬南芥抗逆性方面發(fā)揮積極作用。秦迪等[32]將甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因轉(zhuǎn)入大豆，結(jié)果表明，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽指數(shù)提高了2.5%～16%，活力指數(shù)提高了0.5%～0.6%，脯氨酸含量增加了9.9%～16.5%，POD活性升高了1.2%～10.5%，丙二醛含量減少了0.4%～12%，轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性顯著提高，BADH基因在大豆耐旱性方面發(fā)揮積極作用。目前，國內(nèi)外大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用成熟的方向主要集中在抗除草劑和抗蟲兩個(gè)性狀，抗旱性研究相對(duì)滯后，具有實(shí)用價(jià)值的分子標(biāo)記少，如何通過生物工程手段快速有效提高大豆的抗旱性是目前急需解決的關(guān)鍵問題。

2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆性中的作用研究進(jìn)展

轉(zhuǎn)錄因子在特定時(shí)間與特定基因啟動(dòng)子相結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而在植物生長發(fā)育及對(duì)逆境的應(yīng)答響應(yīng)中起調(diào)控作用。自從1987年人們首次從玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子以來，目前已經(jīng)分離到了六十多個(gè)受干旱誘導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)錄因子[33-35]。根據(jù)結(jié)合域的不同，主要分為鋅指蛋白家族、bZIP家族、AP2/EREBP家族、WRKY家族、MYB/MYC家族和NAC家族等，其中鋅指蛋白是種類最多、調(diào)控作用最顯著的一類[36-37]。

2.1 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆性

鋅指蛋白家族成員眾多，根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異，主要分為兩大類：一類為2個(gè)Cys、2個(gè)His和1個(gè)Zn2+相結(jié)合的C2H2型，這類鋅指最初發(fā)現(xiàn)于TFⅢA因子中，又稱為TFⅢA類型鋅指或經(jīng)典鋅指；另一類為4個(gè)Cys結(jié)合1個(gè)Zn2+的C2C2型，該類鋅指多為類固醇受體如：雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體等[38]。其中，C2H2型鋅指蛋白調(diào)控作用最為顯著，也是目前研究最多的一類，它們一般由28～30個(gè)氨基酸構(gòu)成，其基本序列為：C-X2-4-C-X3-P-X5-L-X2-H-X3-5-H (其中C為半胱氨酸，X為任意氨基酸，P為苯丙氨酸，L為亮氨酸，H為組氨酸)，相鄰的鋅指模體間的序列一般為保守的CH連接肽 (H/Clink)，其空間及基序結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示[37]。

圖1 植物C2H2型鋅指蛋白空間結(jié)構(gòu)[37]Fig.1 The spatial structure of plant C2H2 type zinc finger protein[37]

圖2 植物C2H2型鋅指蛋白基序結(jié)構(gòu)[37]Fig.2 The motif structure of plant C2H2 type zinc finger protein[37]

目前，植物C2H2型鋅指蛋白的研究主要集中在擬南芥、矮牽牛、水稻等模式植物中，發(fā)現(xiàn)了眾多與植物非生物脅迫有關(guān)的家族基因。如擬南芥中發(fā)現(xiàn)的STZ基因，編碼一種雙鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白，該基因在煙草中的過量表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫及高鹽脅迫的耐受能力；另外，STZ基因還可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子增強(qiáng)煙草植株對(duì)干旱的耐受性[14]。同樣，在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的ZPT2-3基因，其編碼的蛋白也含有雙鋅指結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱的耐受能力也顯著提高[39]。另外，水稻中的C2H2型鋅指蛋白基因OsDST可以負(fù)調(diào)控氣孔關(guān)閉，其缺失突變體也可以增強(qiáng)水稻對(duì)干旱脅迫的抗性[40]。

2.2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與大豆抗逆性

目前，國內(nèi)外有關(guān)大豆抗逆鋅指蛋白的研究還不多，少量的報(bào)道也主要集中于低溫響應(yīng)方面。2001年，Kim等[41]首次從大豆中分離到一個(gè)受低溫誘導(dǎo)的鋅指蛋白基因SCOF-1，該基因的表達(dá)受低溫和ABA特異性誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因研究證實(shí)其過表達(dá)可以增強(qiáng)擬南芥和煙草對(duì)低溫的耐受性。劉萌萌[42]克隆了一個(gè)大豆C2H2型鋅指蛋白基因GmC2H2，該基因受低溫、ABA脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)擬南芥研究表明，轉(zhuǎn)基因植株的對(duì)低溫的耐受性顯著高于對(duì)照。白晶等[43]從野生大豆中克隆得到了一個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因GjC2H2-1，結(jié)構(gòu)分析表明該基因具有B-box、L-box、和DLN-box結(jié)構(gòu)域，推測其與2001年Kim等分離的是同一個(gè)基因。吳學(xué)闖等[44]從大豆干旱處理的cDNA文庫中克隆出一個(gè)C3HC4型鋅指蛋白基因GmRZFP1，該基因受低溫、干旱、高鹽和ABA等脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，涉及多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。單曙光等[45]從大豆中克隆得到一個(gè)鋅指蛋白基因GmC2H2，轉(zhuǎn)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株耐寒性顯著提高。韓丹等[46]從大豆中克隆出一個(gè)含有兩個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的C2H2型鋅指蛋白基因，轉(zhuǎn)入受體‘吉農(nóng)28’中，轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力顯著提高。到目前為止，關(guān)于大豆鋅指蛋白的研究主要涉及低溫抗性方面，隨著研究的不斷深入，有關(guān)其與耐旱性的關(guān)系也應(yīng)當(dāng)受到重視，為大豆耐旱性改良提供理論基礎(chǔ)。

3 Di19家族基因研究進(jìn)展

Di19是最新發(fā)現(xiàn)的一類小分子鋅指蛋白，受干旱和高鹽誘導(dǎo)，從低等的藻類到高等植物均有發(fā)現(xiàn)。它們編碼一種小分子鋅指蛋白，蛋白序列含有兩個(gè)C2H2型結(jié)構(gòu)域，屬于ZZ型鋅指蛋白[47]。這種鋅指結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合RNA，參與蛋白與蛋白間的互相作用或蛋白與DNA間的識(shí)別，從而在植物的抗逆響應(yīng)中起積極作用[48-49]。

3.1 Di19家族基因的分類與功能

目前，Di19家族基因研究最深入的模式植物是擬南芥。研究表明，擬南芥中含有7個(gè)Di19同源基因，分別命名為AtDi19-1～AtDi19-7。7個(gè)家族成員中，除了Di19-2和Di19-4定位于細(xì)胞質(zhì)以外，其余5個(gè)均定位在細(xì)胞核[6]。這7個(gè)家族成員均能夠受各種脅迫誘導(dǎo)，在擬南芥各種組織中廣泛表達(dá)，在其抗逆響應(yīng)中發(fā)揮多種作用。其中，AtDi19-1和AtDi19-3受干旱脅迫后迅速表達(dá)，AtDi19-2和AtDi19-4在鹽脅迫下表達(dá)量顯著增加。7個(gè)家族成員中，Di19-1的表達(dá)量最高，其T-DNA插入突變體對(duì)干旱脅迫敏感，而過表達(dá)植株則對(duì)干旱具有更高的抗性。經(jīng)過鑒定，Di19-1主要作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，它能夠結(jié)合PR1、PR2和PR5啟動(dòng)子區(qū)的TACA(A/G)T元件并激活它們的表達(dá)，且這種激活的作用能夠被CPKH(一種結(jié)合Ca2+的蛋白激酶)所增強(qiáng)[8]。蛋白互作結(jié)果表明，Di19-1能夠與CPKH激酶互作于細(xì)胞核，并能夠在體外通過Ca2+依賴的方式被CPK11和CPK3磷酸化[6]。目前，7個(gè)家族成員中，有5個(gè)己經(jīng)證明能與CPKH相互作用并被后者磷酸化，磷酸化的位點(diǎn)處于Dilg蛋白的NLS位點(diǎn)附近。同時(shí)，Di19-1能夠與F-box蛋白AtLKPZ(一種參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑的蛋白質(zhì))相互作用，但作用的位點(diǎn)尚不明確[50]。相反，有研究表明，Di19-3可能在干旱脅迫中起相反作用，在擬南芥中過表達(dá)AtDi19-3增加了植株對(duì)滲透脅迫的敏感性，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸的積累少，抗性低；而AtDi19-7則是參與紅光和藍(lán)光的信號(hào)傳導(dǎo)[9，47]。

3.2 Di19家族基因的作用機(jī)理

Di19家族基因作用機(jī)理方面，目前的研究僅限于與激素的互作層面。最初的研究表明[51]，擬南芥Di19家族基因的表達(dá)似乎不受激素的影響。但隨著研究的深入，2006年，Kariola等[52]發(fā)現(xiàn)，擬南芥Di19基因?qū)BA途徑有轉(zhuǎn)錄水平的響應(yīng)。ABI1、RAB18、ERD15以及ABF3等ABA信號(hào)調(diào)節(jié)組分都能在轉(zhuǎn)錄水平上被Di19基因誘導(dǎo)，添加外源ABA條件下，上述基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)均比對(duì)照強(qiáng)，證明Di19基因可能是ABA信號(hào)途徑的正向調(diào)控因子。棉花中的研究表明，棉花Di19基因GhDi19-1和GhDi19-2轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)鹽和ABA的超敏感性；轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)和幼苗的發(fā)育均受高鹽和ABA抑制，表明該基因可能負(fù)向調(diào)控ABA信號(hào)通路[53]。另外一項(xiàng)研究表明，小麥TaDi19基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽、ABA和甘露醇的敏感性增強(qiáng)，尤其是根系伸長對(duì)鹽脅迫的敏感性增強(qiáng)；另外，轉(zhuǎn)基因植株ABA信號(hào)通路的ABI1、RAB18、ERDI5和ABF3的表達(dá)受到抑制，表明該基因有可能負(fù)向調(diào)控ABA信號(hào)通路[54]。目前，有關(guān)Di19家族基因表達(dá)與ABA信號(hào)途徑的互作模式仍尚不明確，需要進(jìn)一步開展深入研究。

3.3 Di19家族基因的功能

目前，有關(guān)Di19家族基因的功能研究主要集中于其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)方面，除了擬南芥等模式作物，其他作物中也有了少量的研究。2009年，李朔[54]首次從小麥中分離了一個(gè)TaDi19基因，通過研究發(fā)現(xiàn)，其包含C2H2類鋅指結(jié)構(gòu)域、“DPLLSF”位點(diǎn)和“FVQDLVL”位點(diǎn)等保守位點(diǎn)，對(duì)ABA、PEG、NaCI、Ethophon、6-BA都有響應(yīng)，可以影響ABA途徑上的多種調(diào)控元件；另外，小麥TaDi19基因還受低溫脅迫誘導(dǎo)，推測小麥Di19基因?qū)嶋H是受缺水誘導(dǎo)，低溫脅迫造成的缺水比直接的滲透脅迫來得晚，因此響應(yīng)得也晚，同樣，低溫脅迫下葉片中的誘導(dǎo)程度大于根中，也是因?yàn)槿~片中缺水的程度相比于根中更大些。隨后，茹京娜等[55]通過對(duì)低溫處理的小麥轉(zhuǎn)錄組測序，獲得一個(gè)鋅指類轉(zhuǎn)錄因子TaDi19A，分析結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)全長747 bp，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，蛋白靠近N-段包含鋅指結(jié)構(gòu)域，C端為Di19結(jié)構(gòu)域，三級(jí)結(jié)構(gòu)包含2個(gè)α螺旋，具體結(jié)構(gòu)見圖3。功能分析表明，TaDi19A基因表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)入擬南芥后，低溫處理下，轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性強(qiáng)于野生型擬南芥，基因檢測結(jié)果表明，低溫處理后，CBL1、CBL2 和KIN1 等冷脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量顯著高于野生型，表明TaDi19A可能通過調(diào)節(jié)下游冷脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來提高轉(zhuǎn)基因植物的耐冷性。趙娟瑩等[56]從大豆中分離了一個(gè)Di19家族基因成員GmDi19-5，并研究了其對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，結(jié)果表明，GmDi19-5含有多種與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，在高溫脅迫下表達(dá)水平顯著升高；在大豆地上部和地下部均有分布，其同源基因定位于擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞核中，并且與受高溫脅迫誘導(dǎo)的DNA J蛋白互作。張敏[57]從玉米中克隆了一個(gè)Di19家族基因成員ZmDi19-5，并對(duì)其抗逆功能進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，ZmDi19-5基因在高鹽和高濃度PEG脅迫后上調(diào)表達(dá)；其在玉米各組織中均有分布，但在莖稈中的表達(dá)量最高；定位在細(xì)胞膜上，不具有轉(zhuǎn)錄激活活性；轉(zhuǎn)化擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱耐鹽能力顯著增強(qiáng)。張新宇等[58]從棉花中克隆了一個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因GhSIZ1，該基因受低溫、高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)，在棉花各組織中均有表達(dá)，但根系表達(dá)量最高，亞細(xì)胞定位表明其定位在細(xì)胞核中，推測其可能是Di19家族成員之一。目前，有關(guān)大豆Di19家族基因的研究僅有趙娟瑩等[56]的一篇報(bào)道，迫切需要進(jìn)一步深入開展。

A， TaDi19A基因結(jié)構(gòu); B，TaDi19A蛋白保守結(jié)構(gòu); C，TaDi19A蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。A， Gene structure of TaDi19A; B， Conserved domains of TaDi19A protein; C， Tertiary structure of TaDi19A protein.圖3 小麥TaDi19A的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)[55]Fig.3 Gene structure， protein structure of wheat TaDi19A gene[55]

4 展望

目前，相對(duì)于水稻、玉米等作物，大豆的基因組學(xué)研究相對(duì)落后，這主要是因?yàn)槠浠蚪M構(gòu)成過于復(fù)雜[59]。大豆祖先經(jīng)歷了基因組丟失、多倍化、二倍化等一系列復(fù)雜的事件才形成了目前的基因組，復(fù)制區(qū)域和重復(fù)序列多、染色體小、遺傳變異程度低，使得大豆分子生物學(xué)研究相對(duì)困難、進(jìn)展緩慢。今后，需要進(jìn)一步加強(qiáng)大豆分子生物學(xué)研究，深入挖掘Di19基因家族在大豆干旱響應(yīng)中的功能，從分子水平闡明其參與調(diào)控菜用大豆干旱響應(yīng)的機(jī)制，為生產(chǎn)以及遺傳上以Di19介導(dǎo)的耐旱途徑作為改良靶標(biāo)提供基因資源和理論依據(jù)。