硒對鉻-牛血清白蛋白互作光譜特征的影響

劉 康，胡承孝，蔡苗苗，高 林，張夢嬌，巴 蕾，楊丹丹，王 旭，趙小虎，，*

(1.華中農業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，微量元素研究中心，新型肥料湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430070； 2.農業(yè)農村部農產品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東 廣州 510640)

重金屬鉻(Cr)污染是一個全球性問題。有關Cr污染事件的報道層出不窮，各個國家都在不同程度上受其影響[1]。環(huán)境中的Cr主要以三價(Ⅲ)和六價(Ⅵ)形態(tài)存在，不同形態(tài)鉻離子的活性/毒性水平差異顯著[2-3]。其中，Cr(Ⅲ)為人體必需元素，而Cr(Ⅵ)毒性相對較大，有明顯的致癌、致畸和致突變作用，對人體危害極大[4-5]。

環(huán)境重金屬污染物進入體內后會與人體內的蛋白質結合，占據結合位點，產生毒性作用，從而使其變性或者喪失功能[6]。研究重金屬對蛋白質的毒性效應是環(huán)境污染與健康領域的熱點問題。有關重金屬與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的研究結果表明，鉛在一定程度上降低了BSA結構的穩(wěn)定性[7]；銅離子對BSA熒光有明顯的靜態(tài)猝滅效應，且隨著銅離子濃度增加，猝滅效果愈加明顯[8]；鎘對BSA有猝滅作用，既有靜態(tài)猝滅又有動態(tài)猝滅，但靜態(tài)猝滅占主導地位[9-10]。不同形態(tài)的鉻均可與BSA結合，但是具體機理尚不明確，需要聯(lián)合多手段進行更深一步的研究[6]。

硒(Se)是人體必需的微量元素之一，具有抗癌、增強人體免疫力和抗氧化的作用[11]。同時，它還具有拮抗重金屬的作用[12]。研究表明，Se對重金屬毒害有一定的緩解作用[13]。環(huán)境中適量的Se能夠降低重金屬對植物的毒性效應[14-18]。現(xiàn)已證實：Se是蛋白的活性中心，可通過抑制膜蛋白對重金屬的轉運、形成金屬-Se-蛋白質復合體等途徑減輕重金屬的毒性效應。由此推測：Se可通過影響蛋白質的結構和功能進而緩解重金屬對人體的毒害作用[19]。

蛋白質的空間構象和光譜特征是評價污染物對蛋白質毒性效應的重要指標。然而，生理模擬實驗的影響因素眾多，如溫度、溶液pH值、離子濃度、研究手段等都會對實驗結果有很大的影響，不同批次實驗的研究結果可比性弱[6-10]。因此，聯(lián)合多種手段，在相同實驗條件下，對Cr、Se與蛋白質的結合機理進行多層次、多水平的研究很有必要。在此基礎上，有望進一步闡釋Se對Cr-蛋白互作體系的影響。本研究以BSA為研究對象，模擬生理條件(pH值7.4)，選用紫外光譜和熒光光譜研究了不同溫度(298、308、313 K)條件下，Cr(Ⅵ)/Se(Ⅳ)與BSA的互作機制，以及Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)-BSA互作體系的影響，旨在從生物化學角度揭示Cr(Ⅵ)對蛋白的毒性效應、Se(Ⅳ)與蛋白的作用機理，并明確Se(Ⅳ)是否在分子水平上具有緩解Cr(Ⅵ)毒害的作用及其機理，可以為研究人員從多角度揭示Se(Ⅳ)緩解Cr(Ⅵ)對有機體毒害作用的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

RF-5301PC型熒光分光光度計，日本島津；S2-Standard Kit型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-3100PC掃描型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-800KDE臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ABY-1001-U優(yōu)柯浦元素分析型超純水機，上海純浦實業(yè)有限公司。

1.1.2 實驗試劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、BSA、布洛芬(Ibuprofen)、保泰松(Phenylbutazone)，均為生化試劑；鹽酸、氯化鈉、重鉻酸鉀、亞硒酸鈉、無水乙醇，均為分析純。實驗用水為超純水。

(1)0.1 mol·L-1pH值7.40的Tris-HCl緩沖溶液(以0.1 mol·L-1的NaCl維持離子強度，以下簡記為緩沖液)。稱取6.052 0 g Tris-Base(Angus化學試劑公司，純度99.9%)、5.844 4 g NaCl(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)，加水至800 mL溶解，用稀鹽酸調節(jié)pH至7.40，貯存?zhèn)溆谩?/p>

(2)BSA溶液：稱取0.165 0 g BSA(Biosharp生物科技公司，相對分子質量66 000)，用緩沖液溶解并定容至250 mL，即為1.0×10-5mol·L-1的BSA儲備液，貯存于4 ℃冰箱，用時按需稀釋。

(3)Cr(Ⅵ)溶液：稱取105 ℃烘干2 h的K2Cr2O7(國藥集團化學試劑有限公司)1.471 0 g，加水溶解并定容至100 mL，即為0.1 mol·L-1的Cr(Ⅵ)溶液，貯存?zhèn)溆谩?/p>

(4)Se(Ⅳ)溶液：稱取Na2SeO3(國藥集團化學試劑有限公司)1.729 4 g，加水溶解并定容至100 mL，即為0.1 mol·L-1的Se(Ⅳ)溶液，貯存?zhèn)溆谩?/p>

(5)布洛芬溶液：稱取0.257 8 g布洛芬(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，用無水乙醇溶解后定容至50 mL，即為0.025 mol·L-1的布洛芬溶液，用時按需稀釋。

(6)保泰松溶液：稱取0.385 5 g保泰松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，用無水乙醇溶解后定容至50 mL，即為0.025 mol·L-1保泰松溶液，用時按需稀釋。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 紫外光譜實驗

選取Tris-HCl作為緩沖體系，pH值設定為7.40以模擬人體生理環(huán)境。多次實驗下，BSA的熒光強度在此緩沖體系和pH條件下均較穩(wěn)定。

向25 mL容量瓶中加入25 mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液，然后分別加入0、5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成濃度梯度依次為0、2×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的Cr(Ⅵ)-BSA體系。室溫下恒溫30 min。用1 cm石英比色皿，以相對應濃度的Cr(Ⅵ)緩沖溶液(用緩沖液配制，下同)作為參比溶液，在190～450 nm范圍內進行全波長掃描。加入的最大金屬離子溶液總體積為50 μL，遠小于25 mL，實驗中可認為體積不變；因此，在實驗濃度下Cr(Ⅵ)離子與蛋白的濃度比為整數(shù)。Se(Ⅳ)-BSA作用的紫外光譜研究步驟同此。

1.2.2 熒光光譜實驗

向25 mL容量瓶中加入25 mL經緩沖液稀釋過的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，然后分別加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成濃度梯度依次為0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的Cr(Ⅵ)-BSA體系溶液。在不同溫度(298、308、313 K)恒溫30 min，固定激發(fā)波長為280 nm，在300～450 nm范圍內掃描蛋白的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，掃描速度為600 nm·min-1。在相同條件下進行3次重復實驗。Se(Ⅳ)對BSA作用的熒光光譜研究步驟同此。

由于熒光強度受熒光內濾效應的影響(所謂內濾效應指的是在蛋白質激發(fā)和發(fā)射波長處具有光吸收，導致熒光測定的結果不可靠)，通常情況下采用式(1)[20]進行校正：

Fcor=Fabse(Aex+Aem)/2。

(1)

式(1)中：Fcor和Fabs分別為校正后和原始的熒光強度，Aex和Aem分別為蛋白質-配體在激發(fā)和發(fā)射波長處的吸光度。本研究計算所用的相對熒光強度均為校正后的相對熒光強度。

1.2.3 結合位點的確定

向25 mL容量瓶中加入25 mL經緩沖液稀釋過的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，將BSA溶液分成2組，一組加入10 μL布洛芬溶液，另一組加入10 μL保泰松溶液，室溫下反應10 min后，分別加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成Cr(Ⅵ)濃度梯度依次為0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的分別含1.0×10-5mol·L-1布洛芬或保泰松的Cr(Ⅵ)-BSA-布洛芬或Cr(Ⅵ)-BSA-保泰松體系溶液，室溫下反應30 min，固定激發(fā)波長為280 nm，在300～450 nm掃描蛋白的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，掃描速度為600 nm·min-1。

1.2.4 Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系構象的影響分析

向25 mL容量瓶中加入25 mL經緩沖液稀釋過的1.0×10-5mol·L-1BSA溶液，然后加入20 μL 0.1 mol·L-1Cr(Ⅵ)溶液，室溫下反應10 min，繼而加入0、20 μL 0.1 mol·L-1Se(Ⅳ)溶液，制成BSA、Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-Cr(Ⅵ)-BSA體系，室溫下反應30 min，用1 cm石英比色皿，以相對應濃度的Cr(Ⅵ)或 Se(Ⅳ)緩沖溶液作為參比溶液，在190～450 nm進行全波長掃描。

1.2.5 Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系熒光光譜的影響分析

向25 mL容量瓶中加入25 mL經緩沖液稀釋過的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，將BSA溶液分成2組，分別加入0、20 μL 0.1 mol·L-1Cr(Ⅵ)溶液，室溫下反應10 min，然后分別加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Se(Ⅳ)溶液，制成Se(Ⅳ)濃度梯度依次為0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的分別含0、8×10-5mol·L-1Cr(Ⅵ)的Cr(Ⅵ)-BSA-Se(Ⅳ)體系溶液，室溫下反應30 min后，固定激發(fā)波長為280 nm，在300～450 nm掃描蛋白的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，掃描速度為600 nm·min-1。

1.3 數(shù)據統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據采用Excel 2010和SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，并采用Sigma Plot 10.0作圖。

BSA濃度為1.0×10-5 mol·L-1。圖中1～7指示的Cr(Ⅵ)濃度分別為0、0.2×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-5 mol·L-1. Lines 1-7 indicated solutions with Cr(Ⅵ) concentrations of 0， 0.2×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.圖1 Cr(Ⅵ)與BSA結合的紫外吸收光譜特征Fig.1 Characteristics of ultraviolet absorption spectrum of Cr(Ⅵ) in combination with BSA

2 結果與分析

2.1 Cr(Ⅵ)-BSA體系光譜特征

2.1.1 Cr(Ⅵ)-BSA結合的紫外光譜特征

如圖1所示，BSA主要有2個特征吸收帶，峰位置分別在220 nm和280 nm附近，分別是蛋白肽鍵和一些氨基酸殘基的吸收峰[20]。其中，220 nm處的吸收峰強度遠遠大于280 nm處的吸收峰強度，隨著Cr(Ⅵ)濃度升高，BSA在220 nm處的特征峰逐漸增強，表現(xiàn)為增色效應，且峰位紅移，而280 nm處的吸收光譜未發(fā)生顯著變化。紫外光譜的變化表明，Cr(Ⅵ)與BSA分子外部一些維持骨架結構的基團(如羥基、氨基、巰基)發(fā)生作用使骨架結構松散，鏈狀結構展開，二者形成復合物。

2.1.2 Cr(Ⅵ)-BSA結合的熒光光譜特征

以280 nm的單色光為激發(fā)光，苯丙氨酸(Phe)一般情況下不被激發(fā)，此時BSA的內源熒光主要來自于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)殘基，且以Trp起主要作用，Tyr次之。Cr(Ⅵ)與BSA分子間的相互作用能夠導致激發(fā)態(tài)熒光團的熒光猝滅，包括分子重排、能量轉移、基態(tài)絡合物的生成，以及碰撞引起的猝滅[6]。

BSA濃度為1.0×10-7 mol·L-1。圖中1～9指示的Cr(Ⅵ)濃度分別為0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines 1-9 indicated solutions with Cr(Ⅵ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.圖2 Cr(Ⅵ)與BSA結合的熒光吸收光譜特征Fig.2 Characteristics of fluorescence spectrum of Cr (VI) in combination with BSA

Cr(Ⅵ)-BSA結合的熒光光譜特征見圖2。圖2中曲線1為不加Cr(Ⅵ)時以280 nm激發(fā)BSA的熒光光譜圖。實驗結果顯示：BSA最大熒光峰出現(xiàn)在345 nm附近；而相同條件下，Cr(Ⅵ)溶液在345 nm附近沒有熒光峰，表明Cr(Ⅵ)溶液不會產生與BSA相互干擾的熒光。將BSA的量固定，加入Cr(Ⅵ)后BSA的熒光發(fā)生猝滅，且隨著體系中Cr(Ⅵ)濃度增加，BSA的內源熒光猝滅程度隨之增強。BSA熒光猝滅過程的特征進一步表明，Cr(Ⅵ)與BSA之間存在相互作用，BSA的空間構象發(fā)生了改變。

2.2 Cr(Ⅵ)對BSA熒光猝滅機理的推斷

2.2.1 熒光猝滅方式的確定

熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。假設Cr(Ⅵ)對BSA熒光猝滅的方式為動態(tài)猝滅。將猝滅數(shù)據代入動態(tài)猝滅方式所遵循的Stern-Volmer方程[21]：

F0/F=1+Ksvc=1+Kqτ0。

(2)

式(2)中：F0表示無猝滅劑時蛋白的熒光強度；F表示有猝滅劑時蛋白的熒光強度；c表示猝滅劑濃度；Ksv表示猝滅常數(shù)；Kq表示熒光猝滅速率常數(shù)，各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1；τ0表示猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s。

根據不同溫度下的猝滅反應參數(shù)，以F0/F對猝滅劑濃度c作圖(圖2中插圖)，所得結果如表1所示。

動態(tài)猝滅是由激發(fā)態(tài)分子擴散碰撞發(fā)生相互作用所致，并不影響蛋白質結構和生理活性，主要依靠擴散速率，其猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大。靜態(tài)猝滅是基態(tài)時生成不發(fā)光的超分子復合物，可影響蛋白質的二級結構和生理活性，升高溫度會降低復合物的穩(wěn)定性，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)將隨溫度升高而減小[22]。由表1中Cr(Ⅵ)-BSA體系線性方程(R2>0.99)可知，本試驗所得Kq值遠大于各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(約為2.0×1010L·mol-1·s-1)，且Kq值隨著溫度的升高而有所降低，與由擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅規(guī)律不相符，因此推斷BSA的猝滅可能是因形成基態(tài)復合物而引起的靜態(tài)猝滅。

2.2.2 表觀結合常數(shù)與結合位點數(shù)

Cr(Ⅵ)與BSA結合時，其結合常數(shù)與結合位點數(shù)可由式(3)[20]求出：

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlgc，

(3)

式(3)中：n為結合位點數(shù)；Kb為表觀結合常數(shù)。

通過lg[(F0-F)/F]對lgc作圖，根據直線的斜率和截距即可求出Cr(Ⅵ)與BSA的結合位點數(shù)n和表觀結合常數(shù)Kb(表2)。

由表2中擬合的線性方程(R2>0.98)可知，Cr(Ⅵ)與BSA存在較強的相互作用，隨著溫度升高，Cr(Ⅵ)與BSA的結合常數(shù)Kb逐漸降低，生成復合物的穩(wěn)定性降低，進一步證明Cr(Ⅵ)與BSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，且結合位點數(shù)為1。

表1 Cr(Ⅵ)與BSA在不同溫度下的猝滅反應參數(shù)Table 1 Quenching parameters of Cr(Ⅵ)-BSA system at different temperature

表2 Cr(Ⅵ)與BSA在不同溫度下的表觀結合常數(shù)和結合位點數(shù)Table 2 Apparent binding constants and binding sites of the Cr(VI)-BSA system at different temperature

2.2.3 作用力類型的確定

假設在測定溫度范圍內焓變△H變化不大，△H和△S(熵變)可以從Vant’s Hoff方程[23]求得：

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R。

(4)

式(4)中：R=8.314 5 J·mol-1·K-1；K等同于表觀結合常數(shù)Kb。

自由能變△G由式(5)求得：

ΔG=ΔH-TΔS。

(5)

分子間的相互作用力一般包括氫鍵、靜電引力、范德瓦耳斯力和疏水力。根據反應前后熱力學焓變△H和熵變△S的相對大小，可以判斷分子間的作用力類型。經以下熱力學規(guī)律判斷小分子物質與蛋白質等大分子物質間的結合力[24]：

△H>0，△S>0，為疏水作用力；

△H<0，△S<0，為氫鍵力和范德瓦耳斯力；

△H<0，△S>0，為靜電引力。

表3的結果顯示：△H=-53.528 kJ·mol-1<0，△S=-0.110 kJ·mol-1·K-1<0，表明Cr(Ⅵ)與BSA反應體系的作用力為氫鍵力和范德瓦耳斯力。吉布斯自由能變△G298=-20.837 kJ·mol-1，△G308=-19.740 kJ·mol-1，△G313=-19.191 kJ·mol-1，均小于0，表明Cr(Ⅵ)與BSA體系相互作用發(fā)生反應為自發(fā)過程。同時，△H<0表明反應放熱，溫度的升高不利于Cr(Ⅵ)與BSA復合物的形成，因此升溫將導致Cr(Ⅵ)與BSA的靜態(tài)猝滅常數(shù)減小，生成復合物的穩(wěn)定性降低，這也再次證明Cr(Ⅵ)與BSA的熒光猝滅類型是形成基態(tài)復合物導致的靜態(tài)猝滅。

表3 Cr(Ⅵ)與BSA在不同溫度下的熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of Cr(Ⅵ)-BSA system at different temperature

2.2.4 結合距離的確定

根據Forster非輻射能量轉移理論，非輻射能量轉移的發(fā)生條件是：(1)供體的熒光發(fā)射光譜和受體的紫外吸收光譜之間有充分的重疊面積；(2)供體和受體之間的距離r小于7 nm，且0.5R0

(6)

(7)

(8)

式(6)～(8)中：E為能量轉移效率；F0和F分別是加入能量受體前后供體的熒光強度；K2、n、φ分別是偶極空間取向因子、介質折射常數(shù)、BSA的熒光量子產率；J是供體的熒光發(fā)射光譜同受體吸收光譜的重疊面積；F(λ)是在波長λ下供體的熒光強度；ε(λ)是在波長λ下能量受體的吸收系數(shù)。本實驗的供體和受體分別是BSA和Cr(Ⅵ)(圖3)。對于BSA，K2=2/3，n=1.336，φ=0.118。經計算，E=9.76%，r=0.14 nm，R0=0.096 5 nm，符合非輻射能量轉移的發(fā)生條件。因此，Cr(Ⅵ)與BSA的結合距離是0.14 nm，為非輻射能量轉移。

2.2.5 結合位點的確定

為了確定Cr(Ⅵ)與BSA具體的結合位置，采用位點競爭取代實驗確定結合位點[26]。BSA包括2個主要的結合位點——site Ⅰ和site Ⅱ。本實驗選用保泰松和布洛芬作為位點競爭實驗的試劑，以測定其對供體和受體結合常數(shù)的影響，從而確定受體的結合位點(表4)。結果表明，布洛芬的加入對BSA-Cr(Ⅵ)體系的結合常數(shù)影響較大，故可初步確定BSA與Cr(Ⅵ)的結合位點為site Ⅱ。

BSA和Cr(Ⅵ)的濃度分別為1.0×10-7、1.0×10-5 mol·L-1。Concentrations of BSA and Cr(Ⅵ) were 1.0×10-7， 1.0×10-5 mol·L-1， respectively.圖3 BSA熒光發(fā)射光譜與Cr(Ⅵ)紫外吸收重疊譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectrum of BSA and ultraviolet absorption spectrum of Cr(Ⅵ)

表4 Cr(Ⅵ)-BSA體系中加入探針試劑前后結合常數(shù)的變化Table 4 Comparative assessment of binding constants of Cr(Ⅵ)-BSA system before and after addition of site probes

2.3 Se(Ⅳ)-BSA體系光譜特征

2.3.1 Se(Ⅳ)-BSA結合的紫外光譜特征

如圖4所示，加入Se(Ⅳ)后，BSA的紫外吸收光譜上無明顯變化。這說明Se(Ⅳ)與BSA分子未發(fā)生較強的相互作用，單獨加入Se(Ⅳ)對BSA的構象并無顯著影響。

2.3.2 Se(Ⅳ)-BSA結合的熒光光譜特征

對Se(Ⅳ)-BSA結合的熒光光譜特征進行觀察。如圖5所示：Se(Ⅳ)的加入并不能使BSA的熒光呈現(xiàn)有規(guī)律的猝滅.Se(Ⅳ)與BSA的作用沒有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，表明單獨加入Se(Ⅳ)對BSA幾乎無影響。

2.4 Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)-BSA體系光譜特征的影響

2.4.1 Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)-BSA體系紫外光譜特征的影響

BSA濃度為1.0×10-5 mol·L-1。圖中1～7指示的Se(Ⅳ)濃度分別為0、0.2×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-5 mol·L-1. Lines 1-7 indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.2×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.圖4 Se(Ⅳ)與BSA結合的紫外吸收光譜特征Fig.4 Characteristics of ultraviolet absorption spectrum of Se(Ⅳ) in combination with BSA

BSA濃度為1.0×10-7 mol·L-1。圖中各曲線的Se(Ⅳ)濃度分別為0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.圖5 Se(Ⅳ)與BSA結合的熒光吸收光譜特征Fig.5 Characteristics of fluorescence spectrum of Se(Ⅳ) in combination with BSA

BSA、Cr(Ⅵ)、Se(Ⅳ)的濃度分別為1.0×10-5、0.8×10-4、0.8×10-4 mol·L-1。Concentrations of BSA， Cr(Ⅵ) and Se(Ⅳ) were 1.0×10-5， 0.8×10-4， 0.8×10-4 mol·L-1， respectively.圖6 Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系紫外光譜的影響Fig.6 Effect of Se(Ⅳ) on ultraviolet absorption spectrum of BSA-Cr(Ⅵ) system

如圖6所示，由于Cr(Ⅵ)的加入，BSA紫外吸收光譜中220 nm處的特征峰增強，表現(xiàn)為增色效應，且峰位紅移，而在280 nm處的吸收光譜未發(fā)生顯著變化，說明Cr(Ⅵ)與BSA蛋白分子外部的一些維持骨架結構的基團(如羥基、氨基、巰基)發(fā)生作用使骨架結構松散，鏈狀結構展開。Se(Ⅳ)的加入并未使體系表現(xiàn)出顯著的變化，表明加入Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)-BSA體系的紫外光譜特征未造成影響。

2.4.2 Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)-BSA體系熒光光譜特征的影響

對Se(Ⅳ)加入Cr(Ⅵ)-BSA體系后的熒光光譜特征進行觀察。如圖7所示：當Cr(Ⅵ)濃度為0時，隨著Se(Ⅳ)濃度的增加，BSA的最大熒光峰出現(xiàn)在345 nm附近，熒光強度在230～247 nm無規(guī)律波動；當Cr(Ⅵ)濃度為0.8×10-4mol·L-1時，熒光強度顯著降低，隨著Se(Ⅳ)濃度的增加，BSA的最大熒光峰出現(xiàn)在338 nm附近，熒光強度在143～151 nm無規(guī)律波動，表明Cr(Ⅵ)能改變BSA的構象，但加入Se(Ⅳ)對Cr(Ⅵ)造成的BSA熒光猝滅無影響。

3 討論

BSA濃度為1.0×10-7 mol·L-1。圖中相同Cr處理下各曲線的Se(Ⅳ)濃度分別為0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines under the same Cr treatment indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.圖7 Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系熒光光譜的影響Fig.7 Effect of Se(Ⅳ) on fluorescence emission spectrum of BSA-Cr(Ⅵ) system

蛋白質構象的變化主要表現(xiàn)為蛋白質紫外吸收光譜吸收峰的峰強或峰位的變化，本實驗借此來判斷小分子物質對蛋白質熒光的猝滅機理，利用紫外可見吸收光譜法計算小分子與蛋白質作用的結合常數(shù)和結合位點數(shù)，運用熒光猝滅法研究小分子物質與蛋白質的相互作用[27-28]。實驗中所選的BSA屬于血清白蛋白，具有重要的生理功能，可與許多內源性和外源性化學物質以不同的方式結合[29-30]。同時，它與人血白蛋白(HAS)結構相似，性質卻較為穩(wěn)定，價格更為低廉，已成為研究小分子物質與生物大分子相互作用的理想蛋白質模型并得到了廣泛應用[31]，成為重金屬與蛋白質作用研究的首選[32]。

為保證實驗的可比性和可重復性，在前人研究的基礎上[6，20，22]，首先，在統(tǒng)一的實驗條件下，對Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-BSA結合機理進行了更加深入、更加全面的探討，為進一步研究Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系的影響奠定了基礎。本實驗中Cr(Ⅵ)-BSA結合的紫外光譜220 nm處的吸收峰主要是由肽鍵上羰基的n-π*電子躍遷引起的，280 nm處的吸收峰則主要是由BSA分子中色氨酸和酪氨酸的芳香雜環(huán)π-π*和n-π*電子躍遷引起的[33]。隨著Cr(Ⅵ)濃度加大，它們與BSA分子發(fā)生相互作用，造成BSA構象改變，從而導致其微環(huán)境發(fā)生變化，反映到光譜特征上表現(xiàn)為BSA反應體系的紫外吸收光譜220 nm處峰位紅移，吸光度增加。Se(Ⅳ)-BSA結合的紫外光譜并未觀察到顯著變化。這表明Se(Ⅳ)與BSA分子未發(fā)生較強的相互作用，Se(Ⅳ)與BSA不能進行有效的結合，從而證明Se(Ⅳ)沒有造成BSA分子特征的顯著變化，Se(Ⅳ)的加入對BSA的構象并無顯著影響。

對Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-BSA結合的熒光光譜特征進行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)的加入能夠猝滅BSA的特征熒光，猝滅程度隨著Cr(Ⅵ)濃度的增大而增強。這一現(xiàn)象是由于生成了不發(fā)熒光的基態(tài)配合物[34]。而Se(Ⅳ)的加入并不能使BSA的熒光呈現(xiàn)有規(guī)律的猝滅，即Se(Ⅳ)與BSA的作用沒有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，表明Se(Ⅳ)的加入對BSA幾乎無影響。這可能是由于Se(Ⅳ)與BSA的作用力比較弱[35]，無法與BSA蛋白有效結合。

向BSA-Cr(Ⅵ)體系中加入Se(Ⅳ)，未觀察到Se(Ⅳ)對BSA的空間構象和光譜特征產生顯著影響。根據沈芳[35]對Hg(Ⅱ)、Se(Ⅳ)與BSA相互作用的研究，當Hg(Ⅱ)與Se(Ⅳ)同時加入時，BSA的二級結構有微弱變化，且變化極小，沒有單獨加Hg(Ⅱ)時的變化明顯。對比本實驗中Se(Ⅳ)對BSA-Cr(Ⅵ)體系的構象并無顯著影響的結果分析，可能是由于Cr(Ⅵ)首先加入反應體系，先與蛋白質巰基結合，導致Se(Ⅳ)的加入無法再次引起B(yǎng)SA的構象改變。

綜上所述，Cr(Ⅵ)能與BSA分子發(fā)生較強的相互作用，與BSA進行有效的結合，而Se(Ⅳ)與BSA的作用力較弱，不能進行有效的結合，且Se(Ⅳ)的加入對Cr(Ⅵ)與BSA的結合并無顯著影響。同時，本實驗分析得出了Cr(Ⅵ)與BSA分子作用的相關參數(shù)和結合方式。研究結果可為Cr(Ⅵ)、Se(Ⅳ)與蛋白質結合的分子機制研究提供借鑒，從而為研究Cr(Ⅵ)的毒性機制和Se(Ⅳ)對蛋白質的作用機理提供理論參考。