菜心耐熱性評(píng)價(jià)及酶促抗氧化系統(tǒng)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

龐強(qiáng)強(qiáng)，周 曼，孫曉東，張 文，蔡興來

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，海南省蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省瓜菜育種工程技術(shù)研究中心，海南 海口571100)

隨著全球平均氣溫的升高，高溫已成為影響農(nóng)作物生產(chǎn)最重要的氣候因子之一[1]。菜心(BrassicaparachinensisL.)，又名菜薹，為十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，由白菜亞種長期選擇和栽培馴化而來，是我國華南地區(qū)的特產(chǎn)[2]。菜心性喜涼，生長適溫15～25 ℃，在30 ℃以上的高溫天氣下，菜心的生長發(fā)育就會(huì)受到影響，會(huì)導(dǎo)致菜苔細(xì)小、質(zhì)劣，單株質(zhì)量和商品產(chǎn)量大幅下降[3]。由于海南特殊的地理位置，季節(jié)差異大，溫光水熱資源分布不均，造成了夏秋高溫多雨、冬春干旱少雨的不利氣候條件，且全年高溫期長，夏季田間溫度可達(dá)40 ℃以上，高溫已成為限制該地區(qū)菜心正常生長的重要因素。篩選和培育耐熱性強(qiáng)的菜心種質(zhì)是解決上述問題的必由之路，而耐熱性鑒定是選育耐熱品種的重要手段。已有研究表明，田間鑒定采用熱害指數(shù)可有效區(qū)分菜心的耐熱性，且其結(jié)果與室內(nèi)鑒定基本一致[4-5]。

植物對(duì)于高溫脅迫的響應(yīng)并非完全是被動(dòng)的，在長期的進(jìn)化過程中，植物能夠迅速感知外界溫度變化并做出響應(yīng)，以降低不利環(huán)境所造成的危害，維持體內(nèi)基本的代謝反應(yīng)[6]。例如，通過細(xì)胞膜穩(wěn)定性、酶抗氧化系統(tǒng)、非酶活性氧清除劑等的變化以獲得耐熱性，從而減緩高溫對(duì)自身的傷害。目前，高溫脅迫生理研究在蕓薹屬作物如大白菜(Brassicarapassp. pekinensis)[7]、甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)[8]、花椰菜(BrassicaoleraceaL.)[9]、油菜(BrassicaoleraceaL.)[10]等廣泛開展。相對(duì)而言，國內(nèi)外對(duì)菜心耐熱性的研究報(bào)道還較少。為此，本研究以19份菜心品種為試材，以熱害指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行田間耐熱性鑒定。在此基礎(chǔ)上，研究高溫脅迫對(duì)耐熱性不同材料葉片的電導(dǎo)率、丙二醛含量、抗氧化酶活性和相關(guān)基因表達(dá)的影響及脅迫解除后它們的恢復(fù)能力，旨在為菜心耐熱品種的選育及抗逆栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以收集的19份菜心品種為試驗(yàn)材料，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)CX1～CX19，來源見表1。田間試驗(yàn)于2017年7—8月在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所永發(fā)試驗(yàn)基地進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在海南省蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以珍珠巖為基質(zhì)進(jìn)行穴盤育苗，當(dāng)幼苗長至3葉1心時(shí)，選取生長一致的健壯幼苗移栽到田間，記錄田間氣溫變化，其他管理均按常規(guī)。田間移栽后7和14 d選取上述材料15株進(jìn)行熱害癥狀調(diào)查。

1.2 人工模擬高溫脅迫試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)菜心田間耐熱性篩選結(jié)果，選取耐熱型品種CX10、中等耐熱型品種CX17和不耐熱型品種CX13用于人工模擬高溫脅迫試驗(yàn)材料。選擇飽滿、均勻、無病蟲害的種子播種在16孔穴盤內(nèi)進(jìn)行育苗，每穴播3粒種子，每個(gè)品種播12盤，共36盤，播種后采用常規(guī)栽培模式管理，長出1片真葉時(shí)進(jìn)行間苗，每孔留苗1株。當(dāng)幼苗長至3葉1心時(shí)，移入25 ℃/18 ℃(晝/夜)，12 h/12 h(晝/夜)，光照80%，濕度70%的人工氣候箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中預(yù)培養(yǎng)3 d，之后將其中27盤(每個(gè)品種各9盤)幼苗移入另一人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行高溫脅迫處理，處理溫度為37 ℃/27 ℃(晝/夜)，高溫處理5 d后進(jìn)行恢復(fù)處理。另外9盤(每個(gè)品種各3盤)幼苗仍然培養(yǎng)在25 ℃/18 ℃(晝/夜)的人工氣候箱內(nèi)(對(duì)照)。除溫度不同外，高溫脅迫處理的其他環(huán)境條件均與預(yù)培養(yǎng)時(shí)保持一致。分別取高溫處理0 d(CK，即預(yù)培養(yǎng)條件下正常生長的植株)、3 d(H3)、5 d(H5)及恢復(fù)處理3 d(R3)菜心相同部位葉片，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗用于各項(xiàng)生長生理指標(biāo)測定和RNA提取，試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

表1 菜心品種名稱及來源Table 1 Variety name and source of Brassica parachinensis L.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熱害指數(shù)調(diào)查

參照張景云等[11]、李光光等[4]的方法，略有改動(dòng)，熱害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)(無熱害癥狀，植株生長正常)；1級(jí)(植株受害葉片數(shù)<全株葉片數(shù)<1/3)；3級(jí)(全株葉片數(shù)的1/3≤植株受害葉片數(shù)≤全株葉片數(shù)的1/2)；5級(jí)(全株葉片數(shù)的1/2≤植株受害葉片數(shù)≤全株葉片數(shù)的2/3)；7級(jí)(植株受害葉片數(shù)≥全株葉片數(shù)的2/3)；9級(jí)(植株失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值或死亡)。熱害指數(shù)=∑(X×Xi)/(A×N)，X代表熱害級(jí)數(shù)，Xi代表X熱害級(jí)數(shù)下的植株數(shù)，A代表最高級(jí)數(shù)，N代表調(diào)查總株數(shù)。

1.3.2 田間溫度統(tǒng)計(jì)

采用溫濕度自動(dòng)記錄儀(浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司，TPJ-20-LG)記錄菜心生育期間田間氣溫變化，統(tǒng)計(jì)每天最高和最低氣溫。

1.3.3 生理指標(biāo)測定

電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性參照李合生等[12]方法。

1.3.4 基因表達(dá)分析

基因表達(dá)分析采用TransZol Plant試劑盒提取樣品的總RNA，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)程序按寶生物公司的SYBR?Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書要求進(jìn)行，以Actin為內(nèi)參基因，目的基因的表達(dá)量用2-△△Ct法來計(jì)算，每個(gè)基因的表達(dá)反應(yīng)重復(fù)3次。Mn-SOD、CAT和POD基因的引物序列根據(jù)與菜心種屬較近的同源序列比對(duì)設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列信息見表2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel軟件計(jì)算每個(gè)材料各處理測定值與對(duì)照測定值的相對(duì)值，當(dāng)相對(duì)值大于1時(shí)代表處理測定值高于對(duì)照測定值，相對(duì)值小于1時(shí)代表處理測定值低于對(duì)照測定值，相對(duì)值等于1時(shí)代表處理測定值等于對(duì)照測定值，之后再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。采用SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素分析采用Duncan法。

表2 引物序列信息Table 2 Primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心生育期間田間氣溫變化

由圖1可知，菜心生育期間田間每天的最低氣溫在26～30 ℃，其中最低氣溫在28 ℃及以上的天數(shù)有57 d(91.94%)。最高氣溫在37 ℃及以上的天數(shù)有51 d(73.91%)，40 ℃以上的天數(shù)有15 d(24.19%)，最高氣溫可達(dá)41 ℃，說明菜心在整個(gè)生育期受到持續(xù)高溫脅迫。

2.2 菜心田間熱害指數(shù)調(diào)查結(jié)果

菜心田間熱害指數(shù)調(diào)查結(jié)果見表3，通過2次熱害指數(shù)的調(diào)查，計(jì)算平均值，依據(jù)熱害指數(shù)平均值篩選出耐熱性強(qiáng)的品種，指數(shù)越小說明材料耐熱性越強(qiáng)。由表3可知，參試菜心各品種在田間自然高溫條件下均出現(xiàn)熱害癥狀，但不同品種間存在差異。耐熱性由強(qiáng)到弱依次為CX9>CX3=CX19>CX10>CX14>CX6>CX11=CX16>CX5>CX1>CX17=CX18>CX12=CX15>CX4=CX8>CX7>CX13>CX2。利用篩選出的耐熱材料和不耐熱材料用于后續(xù)生理指標(biāo)的測定。

2.3 聚類分析

根據(jù)熱害指數(shù)，采用中間距離法對(duì)19個(gè)菜心品種進(jìn)行聚類分析。由圖2可知，19個(gè)菜心品種劃分為耐熱型、中等耐熱型和不耐熱型3種類型，其中耐熱型品種有5個(gè)，分別為CX3、CX19、CX10、CX14、CX9；中等耐熱型品種有11個(gè)，分別為CX11、CX16、CX6、CX17、CX18、CX1、CX5、CX12、CX15、CX4、CX8；不耐熱型品種有3個(gè)，分別為CX7、CX13、CX2。

2.4 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

圖1 菜心生育期間田間最高氣溫和最低氣溫變化Fig.1 The highest and lowest temperature changes during the growth period of Brassica parachinensis L.

表3 熱害指數(shù)調(diào)查結(jié)果Table 3 Investigation results of heat injury index

圖2 十九個(gè)菜心品種熱害指數(shù)聚類分析Fig.2 The clustering analysis of heat injury index of 19 cultivars

由圖3可知，高溫處理3 d時(shí)，CX10、CX17、CX13這3個(gè)菜心品種的電導(dǎo)率分別是對(duì)照的1.31、2.04、2.68倍，MDA含量分別是對(duì)照的2.32、3.68、4.03倍，其中耐熱型品種CX10的電導(dǎo)率和MDA含量較對(duì)照上升幅度較小，其次為中等耐熱型品種CX17，不耐熱型品種CX13的上升幅度最大。高溫處理5 d時(shí)，3個(gè)菜心品種的電導(dǎo)率和MDA含量仍顯著高于對(duì)照?；謴?fù)處理3 d后，電導(dǎo)率和MDA含量較高溫脅迫時(shí)有下降趨勢，但仍高于對(duì)照處理，其中耐熱型品種的變化幅度較小，不耐熱型品種的變化幅度較大。由此可見，耐熱型品種在高溫脅迫下受到的傷害較小，并且恢復(fù)能力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于不耐熱型品種。

2.5 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心抗氧化酶活性的影響

由表4可見，在高溫處理下，3個(gè)菜心品種葉片中SOD、POD、CAT活性變化一致，均呈先上升后下降的趨勢。在高溫處理3 d時(shí)，耐熱型品種CX10的SOD、POD、CAT活性分別是對(duì)照的4.22、2.56和1.84倍，中等耐熱型品種CX17的SOD、POD、CAT活性分別是對(duì)照的3.17、2.21和1.62倍，不耐熱型品種CX13的SOD、CAT和POD活性分別是對(duì)照的2.35、1.30和1.27倍。在整個(gè)高溫處理期間，無論指標(biāo)的變化趨勢如何，不耐熱型品種CX13的抗氧化酶活性始終低于耐熱型品種CX10，且前者的增加幅度均小于后者。在脅迫恢復(fù)3 d時(shí)，以上各指標(biāo)均下降，但仍高于對(duì)照，其中各抗氧化酶活性均在耐熱型品種中最高，其次為中等耐熱型品種，在不耐熱型品種中最低。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Different lower-case letters in the different treatments showed significant differences (P<0.05). The same as below.圖3 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心電導(dǎo)率和丙二醛含量相對(duì)值的影響Fig.3 Effects of heat stress and recovery on the relative values of conductivity and MDA content in Brassica parachinensis L.

表4 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心SOD、POD、CAT活性相對(duì)值的影響Table 4 Effects of heat stress and recovery on the relative values of SOD， POD and CAT activities in Brassica parachinensis L.

同一指標(biāo)同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Data of the same index in the same line followed by different lower-case letters showed significant differences (P<0.05).

圖4 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心抗氧化酶基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of heat stress and recovery on the expression of the antioxidant enzyme genes in Brassica parachinensis L.

2.6 高溫脅迫及恢復(fù)對(duì)菜心抗氧化酶基因表達(dá)的影響

高溫脅迫時(shí)，抗氧化酶基因Mn-SOD、POD和CAT的表達(dá)均高于對(duì)照，隨著脅迫時(shí)間的延長，三者表達(dá)量開始出現(xiàn)下降，其中3個(gè)抗氧化酶基因均在高溫脅迫3 d時(shí)達(dá)到最大。高溫處理3 d和5 d時(shí)，耐熱型品種CX10的Mn-SOD、POD和CAT基因表達(dá)量均顯著高于不耐熱型品種CX13和中等耐熱型品種CX17。與高溫脅迫時(shí)相比，恢復(fù)3 d時(shí)，三個(gè)品種的抗氧化酶基因表達(dá)量均顯著下降，但仍高于對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

植物在生長過程中易受到非生物因素脅迫的影響，持續(xù)高溫可通過影響植物體內(nèi)的生理過程而抑制其正常的生長發(fā)育[13]，植株葉片的形態(tài)變化是這種抑制作用最直觀的體現(xiàn)。本研究根據(jù)菜心熱害癥狀分級(jí)，計(jì)算熱害指數(shù)，采用聚類分析法對(duì)19個(gè)菜心品種進(jìn)行了耐熱性鑒定，獲得耐熱型品種5個(gè)，中等耐熱型品種11個(gè)，不耐熱型品種3個(gè)。菜心為喜冷涼蔬菜，當(dāng)遇到高溫時(shí)，其生長發(fā)育就會(huì)受到影響。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除體系處于動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)活性氧水平很低，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害[14]。但當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞中的活性氧會(huì)大量累積，這個(gè)平衡就會(huì)被打破。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)酶清除系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶[15-16]，它們的存在可有效清除活性氧自由基，以減輕植物體的受傷害程度。因此，抗氧化酶活性的強(qiáng)弱也常常被認(rèn)為是衡量植物耐熱性的重要指標(biāo)[17-18]。本研究表明，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長，菜心葉片中電導(dǎo)率、MDA含量均呈上升的趨勢，其中耐熱性強(qiáng)的菜心較對(duì)照增幅較小，耐熱性差的菜心增幅較大。這主要是由于高溫脅迫過程中，耐熱性強(qiáng)的菜心葉片保護(hù)酶活性迅速升高，并迅速積累活性氧清除劑，如SOD、CAT和POD活性顯著高于不耐熱品種，前人在甜瓜[19]、甜椒[20]和芥藍(lán)[21]上也有相似的報(bào)道。這說明菜心植株可通過協(xié)調(diào)體內(nèi)保護(hù)酶活性的動(dòng)態(tài)平衡，來增強(qiáng)抗熱性，從而減輕高溫帶來的傷害，這是其對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)和耐熱生存的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。脅迫恢復(fù)3 d時(shí)，植株葉片中電導(dǎo)率、MDA含量、抗氧化酶活性、抗氧化酶基因表達(dá)量較高溫脅迫時(shí)來說均有所降低，但仍高于對(duì)照，說明了高溫脅迫導(dǎo)致菜心植物細(xì)胞受到破壞，并不能完全恢復(fù)，菜心幼苗可通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制提高抗氧化酶活性，以適應(yīng)逆境，這有利于植株在經(jīng)受更高溫度或更長時(shí)間的高溫脅迫時(shí)維持較高的耐熱性。

Mn-SOD、POD和CAT基因表達(dá)量研究表明，高溫脅迫時(shí)，各處理菜心中Mn-SOD、POD和CAT基因的表達(dá)量均升高，隨著脅迫時(shí)間的延長，各基因的表達(dá)略有降低但始終高于對(duì)照。脅迫恢復(fù)3 d時(shí)，與高溫脅迫時(shí)相比，三者的表達(dá)量均有所降低但仍高于對(duì)照。從下降幅度來看，各處理下降幅度與參試品種耐熱性強(qiáng)弱關(guān)系密切，即耐熱性強(qiáng)的品種下降幅度較小，耐熱性弱的品種下降幅度較大。這與抗氧化酶SOD、POD和CAT活性變化趨勢一致。已有研究證明，植物的抗氧化酶基因表達(dá)量上升，可提高其對(duì)鹽[22]、低溫[22]和干旱[23]等逆境的耐受能力。說明耐熱型品種抗氧化酶活性的提高主要是通過增加Mn-SOD、POD和CAT基因表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，高溫脅迫造成了菜心電導(dǎo)率和MDA含量的增加。耐熱性強(qiáng)的菜心可通過提高M(jìn)n-SOD、POD和CAT基因表達(dá)量來增強(qiáng)保護(hù)酶活性來降低電解質(zhì)滲漏率和膜脂過氧化水平，而不耐熱的菜心保護(hù)酶活性升高較慢，恢復(fù)水平和能力較差。本研究結(jié)果為菜心耐高溫機(jī)制研究和菜心耐高溫育種提供了一定的理論基礎(chǔ)。