安徽省豬偽狂犬病毒的分離鑒定及其主要毒力基因分子特征

袁獻(xiàn)宇，楊龍斌，何贊贊，毛天驕，何長生，占松鶴，孫 裴，魏建忠，李 郁，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 合肥 230091)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性、熱性傳染病，主要以仔豬致命性腦炎、育肥豬呼吸道癥狀及母豬流產(chǎn)為特征[1]。豬偽狂犬病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，在歐美等西方國家，通過使用標(biāo)記疫苗和相應(yīng)的鑒別診斷方法，很好地控制或根除該病[2]。20世紀(jì)末，隨著PRV弱毒疫苗的使用，以及部分規(guī)?；N豬場實施豬偽狂犬病的根除凈化計劃，豬偽狂犬病在我國得到有效控制。但自2011年10月以來，我國超過20個省市規(guī)?；i場暴發(fā)豬偽狂犬病，許多免疫過PRV弱毒疫苗的豬場也有發(fā)病報道，表明傳統(tǒng)疫苗不能對流行的PRV變異株提供完全保護，PRV變異株與經(jīng)典株間存在一定差異[3]。

PRV屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，成熟的病毒粒子為球形，直徑180～300 nm，核衣殼呈二十面體對稱，有囊膜和纖突，基因組為線性雙鏈DNA，全長大約140 kb，平均G+C堿基含量約74%，編碼約100種蛋白質(zhì)。PRV的毒力由多種基因協(xié)同調(diào)控，主要包括gE、gI、TK、gB、gC、gD等基因[2，4，5]。gE基因是PRV的主要毒力基因之一，其編碼糖蛋白，能引發(fā)細(xì)胞融合，對病毒侵染神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用，同時也是PRV野毒株共有的非必需基因，缺失后可保持其免疫原性，降低病毒毒力[2，6]。gI基因編碼的糖蛋白能與gE糖蛋白以共價鍵形式結(jié)合形成gI/gE復(fù)合體，促進(jìn)病毒在細(xì)胞間傳播。TK基因編碼的胸苷激酶參與病毒的復(fù)制和潛伏感染，對病毒在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制起重要作用，TK基因缺失后，病毒毒力明顯減弱。gB糖蛋白參與病毒在細(xì)胞間的傳播，促進(jìn)病毒的細(xì)胞融合過程，并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[7]。gC糖蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，是病毒的主要中和抗原，并且在病毒吸附、釋放等過程中起著重要的作用，gC基因的變化影響病毒在機體內(nèi)的傳播及中和抗體的產(chǎn)生[8]。gD糖蛋白能識別細(xì)胞表面受體并與之結(jié)合，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，是病毒復(fù)制和細(xì)胞融合所必需的結(jié)構(gòu)蛋白，同時也是病毒主要的免疫原性蛋白之一。

本研究利用PCR技術(shù)、細(xì)胞接種試驗、透射電子顯微鏡觀察、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay，IFA)試驗及兔體接種試驗等方法對2016—2018年安徽省臨床診斷病例中出現(xiàn)高熱、呼吸道癥狀、神經(jīng)癥狀、繁殖障礙、致命性腦炎等疑似PRV感染癥狀的病豬進(jìn)行病原檢測及PRV分離鑒定，并對PRV分離株的gE、gI、TK、gB、gC及gD基因進(jìn)行克隆、測序及相關(guān)生物信息學(xué)分析，旨在了解目前安徽省PRV流行株主要毒力基因的分子特征及遺傳變異情況，為PRV分子流行病學(xué)研究及豬偽狂犬病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的采集

病料來源于2016年1月至2018年12月安徽省不同發(fā)病豬場疑似感染PRV的病豬，所采集病料組織包括肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腦組織等。

1.2 細(xì)胞及試驗動物

Vero細(xì)胞由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病研究室保存；10周齡(2 kg左右)健康新西蘭白兔由安徽醫(yī)科大學(xué)動物試驗中心提供。

1.3 主要試驗材料

DL10000 DNA Marker、氨芐青霉素、TIAN Midi Purification Kit均購自TianGen公司；FlyCut?BamHⅠ、FlyCut?XhoⅠ、Trans5α Chemically Competent Cell、pEASY?-T1 Simple Cloning Kit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、FITC標(biāo)記山羊抗豬二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；MicroElute Genomic DNA Kit購自O(shè)MEGA公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(100×)、胰酶均購自Hyclone公司；PRV Bartha-K61疫苗株陽性豬血清由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室制備并保存；豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)和豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)RT-PCR檢測試劑盒均購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的PRV全基因序列(BK001744.1)，使用Primer Premier 5.0及Oligo 6.0軟件設(shè)計7對特異性引物(表1)，分別用于疑似PRV感染病豬組織核酸(gE-JC)檢測及PRVgE、gI、TK、gB、gC、gD全基因擴增。引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.5 病原篩查

根據(jù)病豬臨床癥狀及背景信息，參照北京世紀(jì)元亨病原檢測試劑盒操作說明，提取病料組織核酸并利用RT-PCR方法進(jìn)行CSFV、PRRSV、JEV病原檢測，利用PCR方法進(jìn)行PCV2、PPV病原檢測；利用引物gE-JC進(jìn)行PRV核酸鑒定，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix 12.5 μL、雙蒸水5.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板5 μL。擴增結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。

1.6 病毒分離鑒定

1.6.1 病毒分離

病料組織研磨離心后的上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，加入青霉素、鏈霉素溶液至最終濃度分別為300 U·mL-1、100 μg·mL-1，過夜孵育，取處理后的上清液800 μL接種致密單層Vero細(xì)胞，于37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中吸附1 h，結(jié)束后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)觀察Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)情況，當(dāng)CPE達(dá)到80%時收集病毒液，提取病變細(xì)胞DNA，PCR法進(jìn)行PRV核酸鑒定。

1.6.2 病毒形態(tài)觀察

收集出現(xiàn)CPE現(xiàn)象的Vero細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后4 ℃ 3 000 r·min-1離心30 min，取上清液4 ℃ 25 000 r·min-1超速離心3 h，用少量PBS緩沖液將沉淀溶解，溶解后的沉淀通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)行病毒純化，純化后的病毒液送至武漢谷歌生物科技有限公司進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。

1.6.3 間接免疫熒光(IFA)鑒定

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

將純化后的病毒液分別接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)約12 h后棄去培養(yǎng)液，用600 μL多聚甲醛4 ℃固定30 min，清洗后加入5% BSA封閉液37 ℃作用30 min，棄去封閉液，用PBST洗液清洗3遍。試驗組加入600 μL PRV陽性豬血清，對照組加入等量PBS溶液，37 ℃孵育1 h。洗滌后用FITC標(biāo)記山羊抗豬二抗(1∶1 500)37 ℃避光孵育1 h，吸棄二抗，清洗后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.6.4 動物實驗

選取10周齡gB、gE抗體均為陰性的健康新西蘭白兔，試驗組白兔分別經(jīng)頸部皮下接種1 mL純化后的病毒液(病毒滴度為106TCID50·mL-1)，對照組注射相同體積的PBS緩沖液，隔離飼養(yǎng)，持續(xù)觀察記錄健康狀況。出現(xiàn)明顯的臨床癥狀后，剖檢觀察病理變化，并進(jìn)行組織核酸PCR檢測。

1.7 PRV主要毒力基因的克隆及分析

以PRV核酸為模板進(jìn)行g(shù)E、gI、TK、gB、gC及gD基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收后，連接pEASY-T1克隆載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送于上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，每個樣本測序2次。利用MEGA 7.0、DNAMAN等軟件對測序所獲得的序列與GenBank已登錄的gE、gI、TK、gB、gC和gD基因序列進(jìn)行比對分析，并構(gòu)建各基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原篩查結(jié)果

提取組織中病毒核酸，通過RT-PCR、PCR擴增技術(shù)對CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2、PRV等病原進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，病料中僅檢出PRVgE特異性核酸陽性條帶(圖1)，其他所檢項目均為陰性。

M，2 000 bp DNA marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～4，PRV gE。M，2 000 bp DNA marker；1，Positive control；2，Negative control；3-4，PRV gE.圖1 PRV gE基因檢測結(jié)果Fig.1 Test results for gE of the PRV

2.2 病毒分離與傳代

15份病料組織上清液接種Vero細(xì)胞后，其中有4份上清液接種24 h后細(xì)胞開始脫落，5份上清液接種細(xì)胞傳至第二代48 h后細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、聚集、融合、脫落等現(xiàn)象，其他6份上清液接種后盲傳至第三代時開始出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、融合、拉絲狀，隨后大面積脫落現(xiàn)象。15株病毒傳至第五代后均使細(xì)胞可在12 h內(nèi)穩(wěn)定的出現(xiàn)細(xì)胞病變(圖2)。從細(xì)胞培養(yǎng)液中擴增到目的片段，表明從病料中分離出疑似PRV。

2.3 病毒形態(tài)觀察結(jié)果

對超速離心純化后的病毒負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察，可以觀察到皰疹病毒典型的病毒粒子形態(tài)(圖3)。病毒粒子呈球形，直徑為150～200 nm，體積較大，囊膜厚，核芯致密，囊膜表面有放射狀的纖突。結(jié)果顯示，所觀察的病毒粒子與PRV粒子形態(tài)大小基本一致。

A，接毒后48 h細(xì)胞；B，正常細(xì)胞。A，Vero cells 48 h post-inoculation with PRV；B，Normal Vero cells.圖2 接種疑似PRV病毒后48 h的Vero細(xì)胞CPE(400×)Fig.2 CPE of Vero cells at 48-hour post-inoculation(400×)

圖3 電鏡下病毒形態(tài)觀察結(jié)果Fig.3 Morphological identification of virus

2.4 IFA鑒定結(jié)果

將分離的15株病毒分別接種Vero細(xì)胞，進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示，接種病毒的細(xì)胞的胞漿和胞核呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，對照組細(xì)胞未見綠色熒光(圖4)。研究結(jié)果表明，病毒接種細(xì)胞均能與PRV陽性血清抗體特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實所分離的毒株為PRV。

2.5 兔接毒試驗結(jié)果

接毒24～72 h，試驗組15只新西蘭白兔出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、煩躁不安、體溫升高(約41 ℃)等現(xiàn)象，其中9只白兔出現(xiàn)奇癢、局部被毛脫落、角弓反張、啃咬接種部位等癥狀不久后死亡，少數(shù)發(fā)病兔僅出現(xiàn)軀體抽搐、四肢麻痹、呼吸急促等癥狀后死亡。對照組白兔精神狀態(tài)良好，體溫、采食等均正常。PCR檢測結(jié)果顯示，接種病毒的白兔組織PRV呈陽性，對照組呈陰性，表明從病料中分離的病毒為PRV。15株P(guān)RV背景信息及命名見表2。

A，接毒后12 h細(xì)胞；B，正常細(xì)胞。A，Vero cells 12 h post-inoculation with PRV；B，Normal Vero cells.圖4 IFA鑒定結(jié)果(200×)Fig.4 IFA identification of virus(200×)

2.6 目的基因的克隆

對TK、gI、gD、gC、gE及gB全基因引物進(jìn)行PCR擴增，15株P(guān)RV分別擴增出約980、1 184、1 248、1 480、1 780、2 877 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖5)。擴增基因經(jīng)比對顯示，與目的基因序列最高相似度在99%左右，表明基因克隆成功。

2.7 PRV分離株gE、gI、TK、gB、gC及gD基因分子特征分析

2.7.1gE基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株gE基因核苷酸序列同源性在99.71%以上，與國內(nèi)變異株位于同一分支，且部分分離株與湖北HNX株、河南HN1201株、江蘇JS2012株、山東Qihe547株等變異株核苷酸序列同源性均為100%；與國內(nèi)經(jīng)典株(Ea株、Fa株等)位于不同小分支；與歐美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株與國內(nèi)變異株存在高度一致的特征性變化，即在142～144位、1 488～1 490位均存在3個連續(xù)堿基的插入，分別是GAC和CGA(對應(yīng)氨基酸序列48位和496位各有一個天冬氨酸的插入)；在54、161、228、1 342位均出現(xiàn)了一致的堿基替換，即G54D、G161A、G1342A、C228A，且1 342位堿基的改變導(dǎo)致其氨基酸序列發(fā)生變化。

表2 PRV分離株信息Table 2 Background information of the PRV isolates

M，10 000 bp DNA marker；1，TK基因；2，gI基因；3，gD基因；4，gC基因；5，gE基因；6，gB基因。M，2 000 bp DNA marker；1，TK gene；2，gI gene；3，gD gene；4，gC gene；5，gE gene；6，gB gene.圖5 PRV TK、gI、gD、gC、gE、gB基因擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of PRV TK， gI， gD， gC， gE， gB genes

2.7.2gI基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株gI基因核苷酸序列同源性在99.73%以上，與國內(nèi)流行變異株位于同一分支，且部分分離株與湖北HNX株、河南HN1201株、江蘇JS2012株、黑龍江HLJ8株等變異株核苷酸序列同源性為100%；與國內(nèi)經(jīng)典株(Ea株、Fa株、SC株等)位于不同小分支；與歐美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖7)。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株與國內(nèi)變異株僅在321、987位均出現(xiàn)了一致的堿基替換，即G321A、C987T(推導(dǎo)氨基酸序列未發(fā)生變化)，且部分分離株(AH1601、AH1602、AH1701等)與國內(nèi)經(jīng)典株Fa株、SC株氨基酸序列同源性為100%。

圖6 gE基因遺傳進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic trees for gE gene

2.7.3TK基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株TK基因核苷酸序列同源性在99.79%以上，與國內(nèi)經(jīng)典株(Fa株、LA株等)及國內(nèi)變異株(江蘇JS-2012株、湖北HNB株等)均位于同一分支，親緣關(guān)系較近，且與經(jīng)典株Fa株、湖北HNX株、河南HN1201株、江蘇JS2012株、黑龍江HLJ8株等核苷酸序列同源性均為100%；與歐美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖8)。與國內(nèi)參考毒株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列比對未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

圖7 gI基因遺傳進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic trees for gI gene

圖8 TK基因遺傳進(jìn)化分析Fig.8 Phylogenetic trees for TK gene

2.7.4gB基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株gB基因核苷酸序列同源性在99.89%以上，與國內(nèi)變異株位于同一分支，且與湖北HNX株、河南HN1201株、天津TJ株、北京BJ-YT株、江蘇JS2012株等變異株核苷酸序列同源性為100%；與國內(nèi)經(jīng)典株(Ea株、Fa株、SC株等)位于不同小分支；與歐美毒株(Becker株、Kaplan株、Bartha株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖9)。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株與國內(nèi)變異株僅在G1373A位存在一致的堿基序列替換(對應(yīng)氨基酸序列發(fā)生R458K替換)。

2.7.5gC基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株gC基因核苷酸序列同源性在99.79%以上，與國內(nèi)變異株位于同一分支，且與湖北HNX株、河南HN1201株、天津TJ株、北京BJ-YT株等變異株核苷酸同源性為100%；與國內(nèi)經(jīng)典株(Ea株、Fa株等)位于不同分支；與歐美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖10)。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株與國內(nèi)變異株存在多處堿基突變、插入，154～210位為堿基序列高變區(qū)；30位、581位存在高度一致的堿基替換，即T30G、G581A；175～181位堿基序列由CCCGAGG突變?yōu)镚GGACGA(氨基酸序列59～61位PEA突變?yōu)镚TT)；186～206位插入21個連續(xù)堿基GGCCGCGGCCTCCACGCCCGC(氨基酸序列63～69位7個連續(xù)序列AAASTPA的插入)。

圖9 gB基因遺傳進(jìn)化分析Fig.9 Phylogenetic trees for gB gene

2.7.6gD基因分子特征分析

15株P(guān)RV分離株gD基因核苷酸序列同源性在99.83%以上，與國內(nèi)變異株位于同一分支，且與湖北HNX株、河南HN1201株、江蘇JS2012株、山東Qihe547株等變異株核苷酸序列同源性為100%；與國內(nèi)經(jīng)典株(Ea株、Fa株等)位于不同小分支；與歐美毒株(Bartha株、Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖11)。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株與國內(nèi)變異異株均在814～819位存在連續(xù)堿基序列AGGCCC的缺失(對應(yīng)氨基酸序列272～273位2個氨基酸RP的缺失)；在G924C存在高度一致的堿基替換。

圖10 gC基因遺傳進(jìn)化分析Fig.10 Phylogenetic trees for gC gene

圖11 gD基因遺傳進(jìn)化分析Fig.11 Phylogenetic trees for gD gene

3 討論

豬偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要傳染病，20世紀(jì)90年代以前在我國長時間流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。自2011年底以來，豬偽狂犬病再度在我國流行，超過20個省市區(qū)規(guī)?；i場暴發(fā)該病，許多免疫過疫苗的豬場也出現(xiàn)了疫情。黃曉慧等[9]對2012—2015年安徽省224個不同規(guī)模豬場的11 855份血清樣品進(jìn)行PRV-gE抗體檢測，結(jié)果顯示該地區(qū)豬群PRV感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢，2014年和2015年豬群感染率分別為11.61%和26.61%；李春芬等[10]對2013—2017年該地區(qū)22 130份血清樣品進(jìn)行g(shù)E抗體檢測，其中2016年和2017年的PRV-gE抗體陽性率分別為14.35%與33.63%；劉華等[11]對安徽地區(qū)12個固定監(jiān)測點豬群進(jìn)行豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查，2017年固定監(jiān)測點種豬群PRV感染率為19.6%。以上結(jié)果表明，豬偽狂犬病在安徽地區(qū)廣泛流行。目前，我國黑龍江、河南、山東、湖北、福建、廣東等多個地區(qū)均有PRV分離株遺傳變異情況的研究，但尚未見到針對安徽地區(qū)PRV臨床分離株主要毒力基因分子特征及遺傳進(jìn)化分析的相關(guān)報道。

本研究對2016—2018年安徽省臨診病例中疑似PRV感染的病豬進(jìn)行病原檢測，并成功分離鑒定出15株P(guān)RV。通過對不同地區(qū)豬場分離的15株P(guān)RV主要毒力基因比對發(fā)現(xiàn)，PRV分離株主要毒力基因核苷酸序列同源性在99.70%以上，但gE、gI、TK、gB、gC和gD基因推導(dǎo)氨基酸序列間存在明顯不同，最大差異分別為0.87%、0.55%、0.31%、0.22%、0.62%和0.25%，部分氨基酸位點的突變，可能會導(dǎo)致PRV的毒力及抗原性發(fā)生改變，從而使各PRV分離株在致病性和免疫原性上產(chǎn)生明顯差異。本研究中，PRV分離株與國內(nèi)參考毒株的主要毒力基因在核苷酸和氨基酸水平上均具有很高的保守性，其中TK、gI基因推導(dǎo)氨基酸序列未見明顯變化，gB、gD基因核苷酸序列同源性均在99.5%以上，且推導(dǎo)氨基酸序列僅少數(shù)位點發(fā)生變異，與孫佳楠等[12]報道一致。但在高度保守的基礎(chǔ)上，gE、gC基因序列仍存在一些差異，且部分差異具有特征性。

gE基因是PRV的主要毒力基因，也是區(qū)別疫苗接種和野毒感染的標(biāo)志基因。gE基因序列的改變可能會對病毒毒力及抗體的有效中和產(chǎn)生一定影響[12-13]。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株gE基因核苷酸序列在142～144位、1 488～1 490位處均存在3個連續(xù)堿基的插入，并導(dǎo)致其氨基酸序列48位、496位各有一個天冬氨酸的插入，而這一特點可作為鑒定PRV變異株的分子特征[13]，從而表明本研究的15株P(guān)RV分離株均為變異株?？乖砦皇强乖肿又袥Q定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，抗原通過抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答，其中可被B細(xì)胞表面受體特異性識別并結(jié)合的片段稱為B細(xì)胞表位，gE蛋白表面存在多個B細(xì)胞表位[14-15]。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株在22～84位、480～568位B細(xì)胞表位區(qū)域的氨基酸(48位、54位、496位)發(fā)生了替換及插入，這些氨基酸位點的突變可能導(dǎo)致PRV的抗原性發(fā)生改變，進(jìn)而影響機體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。

gC糖蛋白是PRV成熟病毒粒子的囊膜蛋白之一，在不同地域的毒株中，gC基因存在2%～3%的差異，這些差異被認(rèn)為是由病毒應(yīng)對抗體作用后基因改造的結(jié)果[16]。與國內(nèi)經(jīng)典株相比，PRV分離株gC基因的特征性變化主要在175～181位堿基的突變及186～206位21個連續(xù)堿基的插入。連續(xù)堿基的插入與國內(nèi)變異株具有高度的一致性，亦可作為區(qū)分國內(nèi)經(jīng)典株與變異株的分子特征[17-18]，進(jìn)而證實了本研究的15株P(guān)RV分離株均為變異株。gC糖蛋白在病毒吸附細(xì)胞及傳播的過程中起重要作用，也是PRV主要免疫原性蛋白之一，gC基因的改變影響著病毒吸附細(xì)胞，刺激機體中和抗體的產(chǎn)生[17]。PRV在傳播過程中主要通過gC蛋白表面的硫酸乙酰肝素結(jié)合域(HBDs)與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素相結(jié)合，參與病毒對宿主細(xì)胞的吸附，gC蛋白所誘導(dǎo)的中和抗體可與HBDs結(jié)合以阻止病毒對細(xì)胞的吸附，從而降低病毒對細(xì)胞感染[15，18，19]。gC蛋白共有3個已知的HBDs，HBD1位于76～81位氨基酸處(RRKPPR)，HBD2位于96～100位氨基酸處(HGRKR)，HBD3位于133～141位氨基酸處(RFYRRGRFR)[17，20，21]。與國內(nèi)外經(jīng)典株(Bartha株、國內(nèi)SC株、Ea株、Fa株等)相比，PRV分離株gC蛋白HBD1第5位氨基酸由P→Q，HBD3第3位氨基酸由Y→C。研究顯示，HBDs的突變可能會降低疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體對gC蛋白表面硫酸乙酰肝素結(jié)合域的結(jié)合，進(jìn)而影響PRV對宿主細(xì)胞的黏附作用。gC蛋白作為PRV最主要的保護性抗原之一，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生中和抗體，參與補體系統(tǒng)的激活[20-21]。已有報道指出，gC蛋白表面的B細(xì)胞表位區(qū)域分別位于氨基酸序列65～79位(65-STPPVPPPSVSRRKP-79)、80～94位(80-PRNNNRTRVHGDKAT-94)及85～99位(85-RTRVHGDKATAHGRK-99)[19-20]。與國內(nèi)外經(jīng)典株相比，PRV分離株gC蛋白B細(xì)胞表位區(qū)域的氨基酸序列在69位(V→A)、80位(P→Q)、83位(N→G)、95位(A→S)存在替換。研究表明，一旦PRV gC蛋白的抗原表位發(fā)生變化，Bartha-K61疫苗免疫機體所誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體無法對PRV變異株進(jìn)行有效的中和[20-21]。

4 小結(jié)

本研究中，安徽省15株P(guān)RV分離株均為變異株，gE、gC蛋白抗原表位區(qū)域氨基酸的突變可能導(dǎo)致PRV分離株抗原性的改變進(jìn)而影響傳統(tǒng)疫苗的保護效果。國內(nèi)流行變異株整體上并未表現(xiàn)出明顯的區(qū)域特征，但PRV分離株gE、gI、TK、gB、gC及gD基因序列與湖北、河南、山東等鄰近省份PRV變異株(如湖北HNX株、河南HN1201株、山東Qihe547株等)同源性均為100%，這可能與頻繁跨省調(diào)運生豬、跨區(qū)引種等原因有關(guān)，尤其是生豬流動性的增加加劇了運輸途中PRV的傳播擴散。因此，針對豬偽狂犬病的防控策略，應(yīng)在重視和加強疫苗免疫的基礎(chǔ)上，利用鑒別診斷技術(shù)，及時淘汰免疫耐受豬或野毒帶毒感染豬，凈化豬群，從而有效控制豬偽狂犬病的傳播和擴散。