茶多酚對骨組織細(xì)胞的影響及其在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展

曹振 潘光玉 王麗萍 郭勇

桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院541199

0 引 言

骨組織通過破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成的連續(xù)過程，不斷再生重建[1-2]。由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的精心協(xié)作以維持適當(dāng)?shù)墓琴|(zhì)量和數(shù)量，這種平衡受到各種激素、細(xì)胞因子和生長因子的嚴(yán)格調(diào)控[2]。因此，骨重建的失調(diào)可導(dǎo)致代謝性骨病，其主要疾病有骨質(zhì)疏松癥、軟骨病及骨關(guān)節(jié)炎[2]。隨著全世界人口年齡的增長，預(yù)期壽命的延長，老年人骨骼疾病的患病率也隨之上升，生活成本大大提高[3]。骨骼疾病對患者及其家人身心均有嚴(yán)重影響，使其生理和心理健康受到壓抑，增加大眾的負(fù)擔(dān)；同時也會對患者自尊心、外貌造成負(fù)面的影響[4]。

茶多酚（TeaPolyphenols，TP）是茶葉中類多羥基酚類化合物的總稱，其中以兒茶素含量最多，在兒茶素成分中，表兒茶素沒食子酸脂（Epigallocatechin，EGCG）是含量最豐富和藥用活性最強(qiáng)的成分[5]。一項(xiàng)短期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶多酚可減輕骨丟失和改善卵巢切除術(shù)致骨質(zhì)疏松大鼠的骨微結(jié)構(gòu)[6]，說明茶多酚可能與骨組織相關(guān)細(xì)胞有密切聯(lián)系。茶多酚具有明顯的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，而氧化應(yīng)急可促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡、破骨細(xì)胞分化[7-8]，同時炎性因子使成骨細(xì)胞上表達(dá)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL） 刺激破骨細(xì)胞成熟[9]。由此，國內(nèi)外學(xué)者預(yù)測茶多酚可以預(yù)防骨骼疾病，且能在骨組織材料中作為表面修飾物。本文旨在依據(jù)目前的多項(xiàng)研究，總結(jié)茶多酚在骨組織再生環(huán)境中對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生長分化的影響，以期更好地探究茶多酚在骨組織工程中的可能應(yīng)用。

1 茶多酚對骨組織及相關(guān)細(xì)胞的影響

1.1 茶多酚對骨組織的影響

最近的一項(xiàng)調(diào)查表明，茶葉可明顯降低女性骨質(zhì)疏松的狀況；而對于男性，由于飲酒、吸煙等不良習(xí)慣可能會降低茶葉對骨質(zhì)疏松的影響[10]。經(jīng)常喝茶可降低中老年男性骨質(zhì)疏松性髖/股骨骨折的風(fēng)險，提升中老年女性骨骼質(zhì)量，并對骨幾何結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[11-12]。

大量的動物模型和臨床試驗(yàn)表明，茶的攝入量與維持骨密度（bone mineral density，BMD）之間存在正相關(guān)關(guān)系。給予卵巢切除術(shù)（OVX）雌性大鼠連續(xù)13周口服 60、120、370 mg/kg的綠茶提取物（green tea extract，GTE）（茶多酚是綠茶提取物的主要成分），結(jié)果表明，中劑量GTE治療可改善OVX大鼠的股骨BMD和生物力學(xué)特性，治療組皮質(zhì)骨和骨小梁的厚度顯著增加[13]。此外，有研究者通過免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OVX組較假手術(shù)組和EGCG注射組的腦信號蛋白 4D（semaphorin 4D，Sema4D）表達(dá)陽性面積百分比更高，表明EGCG抑制Sema4D在骨組織中的表達(dá)[14]。Shen等[15]將OVX大鼠口服GTE的骨保護(hù)研究成果轉(zhuǎn)化為一項(xiàng)6個月的安慰劑對照隨機(jī)臨床試驗(yàn)，在GTE補(bǔ)充組中，1個月后觀察到較高的骨特異性堿性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase，BAP）值——即骨形成增加，同時顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的靜態(tài)腿部肌肉力量/耐力顯著提高。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)股骨頭缺損處的局部EGCG可通過增加骨量來增強(qiáng)新生骨的形成，從而改善力學(xué)性能，包括最大載荷、斷裂點(diǎn)、剛度和極限應(yīng)力，即局部EGCG可用于骨缺損的治療[16]。

1.2 茶多酚對成骨細(xì)胞的影響

目前的研究結(jié)果顯示，EGCG作用于成骨細(xì)胞主要有兩個方面。其一是影響成骨細(xì)胞的骨保護(hù)素含量，EGCG能增強(qiáng)成骨細(xì)胞中前列腺素F2α（PGF2α）和前列腺素E2（PGE2）刺激的骨保護(hù)素（osteoprotegerin,OPG），通過激活成骨細(xì)胞中p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和應(yīng)激激活蛋白激酶/c-Jun N末端激酶（SAPK/JNK）來刺激骨保護(hù)素合成[17-18]，F(xiàn)ujita等[19]發(fā)現(xiàn)EGCG可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞樣MC3T3-E1細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（bone morphogenetic protein，BMP-4） 刺激的 OPG釋放，且其刺激作用是在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)；其二是影響成骨細(xì)胞的遷移速率，Kawabata等[20]研究發(fā)現(xiàn)EGCG可顯著降低人胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor，IGF-1） 誘導(dǎo)的 p44/p42 MAPK 的磷酸化，抑制成骨細(xì)胞遷移。同期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG通過抑制由表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）觸發(fā)的p38MAPK時活化而抑制成骨細(xì)胞遷移，EGCG的抑制作用是劑量依賴性，其在濃度為3 μmol/L時達(dá)到最大抑制作用[21]。

另外，EGCG還可通過抑制成骨細(xì)胞樣MC3T3-E1細(xì)胞中的P70 S6激酶來增強(qiáng)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）刺激的白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的合成和釋放[22]。

1.3 茶多酚對破骨細(xì)胞的影響

茶多酚可以抑制破骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，也能降低破骨細(xì)胞的活性。近年來茶多酚對破骨細(xì)胞的研究熱點(diǎn)主要還集中在EGCG對破骨細(xì)胞分化、生長和功能的標(biāo)志物上。

RANKL能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化成成熟的破骨細(xì)胞，將綠茶提取物和RANKL同時添加到RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中，與只添加RANKL組相比，其破骨細(xì)胞的數(shù)量減少、骨吸收減少和更少的肌動蛋白環(huán)；進(jìn)一步檢測破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)情況，表明綠茶提取物組的組織蛋白酶K、酒石酸抗性酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRACP）和MMP-9的表達(dá)均下調(diào)[23]。將ECGC添加到成熟大鼠破骨前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞的培養(yǎng)物中，也得到了類似的結(jié)論[24]。

Chen等[25]使用RAW 264.7細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞ST2的共培養(yǎng)來評估EGCG如何調(diào)節(jié)RANK/RANKL/OPG 途徑，在 1、10 μmol/L 濃度下，OPG 的 mRNA表達(dá)增加，RANKL的mRNA和蛋白水平均降低，且TRAP活性降低。表明EGCG可通過基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)RANKL/OPG比率來影響破骨細(xì)胞的生成。Tominari等[26]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證EGCG明顯抑制脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的骨吸收，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過將LPS注射到小鼠下頜骨的牙齦中，LPS顯著降低了下頜牙槽骨的BMD，而同時注射EGCG可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠BMD損失。體外實(shí)驗(yàn)表明EGCG可通過抑制成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)和成骨細(xì)胞中PGE的生物合成來抑制破骨細(xì)胞骨的吸收。

2 茶多酚在組織工程中的應(yīng)用

2.1 茶多酚對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞的影響

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和分化成骨細(xì)胞的能力，茶多酚作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，影響其成骨分化的研究已引起越來越多的關(guān)注。

有研究顯示，EGCG是以劑量依賴形式增強(qiáng)人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow derived MSCs，hBMSCs）的成骨分化，特別是在濃度為5 μmol/L的情況下對其成骨譜系發(fā)展具有很強(qiáng)的刺激作用，表現(xiàn)為堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，成骨基因表達(dá)上調(diào)以及骨樣結(jié)節(jié)形成[27-28]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可抵消H2O2誘導(dǎo)的對hBMSCs成骨分化的不利影響，經(jīng)EGCG處理后，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和細(xì)胞周期蛋白 D1（cyclin D1）的表達(dá)上調(diào)，提示W(wǎng)nt通路可能參與了EGCG對hBMSCs成骨分化的影響[29]。最近的一項(xiàng)研究報道EGCG可上調(diào)mir-210，并通過作用mir-210靶向的efna3基因顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，且EGCG治療組還在常氧或缺氧條件下促進(jìn)MSCs中的“成骨標(biāo)志物”的表達(dá)[30]。Lin等[31]報道，EGCG不僅促進(jìn)hBMSC的成骨分化還可促進(jìn)其礦化，空氣結(jié)合的EGCG與新鮮的EGCG相比，其hBMSC培養(yǎng)物礦化水平并沒有改變，表明EGCG抗氧化活性的喪失仍可增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)物礦化。Liu等[32]研究顯示只有低劑量的EGCG通過抑制由α腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNFα）刺激的 NF-κB信號傳導(dǎo)，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活力和成骨細(xì)胞分化，并且能夠逆轉(zhuǎn)TNFα誘導(dǎo)的抑制。

另外，一項(xiàng)研究已確定EGCG和機(jī)械刺激在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的成骨分化中具有協(xié)同作用，當(dāng)同時施加EGCG和3%拉伸時，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）表達(dá)顯著增加、心肌素表達(dá)顯著降低、成骨標(biāo)志物表達(dá)增加，同時線粒體的生物發(fā)生和抗氧化能力增加。此研究不僅通過測量相關(guān)的標(biāo)志物更詳細(xì)地確認(rèn)EGCG在成骨分化中的作用，還驗(yàn)證了EGCG在由機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的成骨分化中具有協(xié)同作用[33]。

在類似的研究中，Kaida等[34]將去分化脂肪（DFAT）細(xì)胞在含有和不含100 nmol/L濃度地塞米松（Dex）的成骨培養(yǎng)基（OM）中培養(yǎng)，分別給予10 μmol/L EGCG處理。結(jié)果顯示，補(bǔ)充EGCG可誘導(dǎo)去分化脂肪細(xì)胞的增殖、早期成骨分化和礦化。與OM（Dex）+EGCG相比，OM+EGCG可誘導(dǎo)早期成骨分化和更高的礦化水平。

2.2 茶多酚在骨組織工程中的應(yīng)用

茶多酚作為骨生物材料表面修飾分子，能誘導(dǎo)和刺激成骨細(xì)胞成骨、礦化，而不需要其他骨誘導(dǎo)因子的高成本，因此在骨組織工程應(yīng)用中十分重要。

EGCG和豬皮明膠通過脫水縮合劑制備海綿狀的交聯(lián)物，將明膠和EGCG/明膠植入臨界尺寸的小鼠顱蓋缺損中，發(fā)現(xiàn)EGCG/明膠復(fù)合物具有骨傳導(dǎo)的潛能；EGCG/明膠和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系（D1細(xì)胞）共培養(yǎng)表明EGCG/明膠可誘導(dǎo)D1細(xì)胞的成骨細(xì)胞生成，這種EGCG/明膠實(shí)際上是一種功能化的茶多酚控釋系統(tǒng)，能更有效地促進(jìn)骨形成[35]；隨后該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)真空加熱的EGCG改良明膠具有更好的骨形成能力、更高的機(jī)械強(qiáng)度和更低的可降解性[36]。類似的研究發(fā)現(xiàn)EGCG修飾可改變明膠物理化學(xué)性質(zhì)，這種改變可能為多能祖細(xì)胞提供優(yōu)選的微環(huán)境，在體內(nèi)更易于骨形成[37]。此外，EGCG修飾的膠原膜可以募集巨噬細(xì)胞，下調(diào)促炎因子的分泌，促進(jìn)再生免疫反應(yīng)控制軟組織和骨再生[38]。

茶多酚修飾其他骨生物材料也被廣泛研究，多孔磷酸鈣陶瓷（PCPC）表面的Ca2+對TP分子進(jìn)行吸附和固定，這些TP分子調(diào)節(jié)了PCPC表面上磷酸鈣納米棒組件的成核和結(jié)晶，改變其表面微環(huán)境，使PCPC/TP可有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的增殖和成骨分化[39]。在鈦合金表面“鍍”一層茶多酚，從而具備一定生化功能；并在表面培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，這種茶多酚功能化表面的鈦合金可明顯促進(jìn)其礦化并表達(dá)較高的骨鈣蛋白[40]。將茶多酚還原氧化石墨烯（TPG）通過電化學(xué)沉積在鈦（Ti）基底上，發(fā)現(xiàn)Ti-TPG比Ti具有更好的生物相容性，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和黏附，且無毒性；此外，Ti-TPG還可促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白如BMP-2、BMP-4、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）和 ALP 的表達(dá)[41]。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，筆者總結(jié)了茶多酚對骨組織及相關(guān)細(xì)胞的作用，它們不僅在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松中起重要作用，而且還在骨生物材料中起到促進(jìn)骨形成作用。經(jīng)EGCG修飾的肽合金、明膠海綿、多孔磷酸鈣等骨組織再生材料，可明顯提高骨形成能力和抗降解能力，這些作用是由多酚對成骨細(xì)胞的刺激作用及其對氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子的保護(hù)作用引起的，從而為骨折患者骨組織工程的新應(yīng)用鋪平了道路。

未來的研究有必要精確地確定最佳劑量的茶攝入量或三磷酸鳥苷（GTP）補(bǔ)充劑，并檢查茶多酚與骨骼健康必需的其他營養(yǎng)素（包括鈣和維生素D）之間的潛在相互作用，并且應(yīng)該有足夠的持續(xù)時間來評估BMD的變化以及骨轉(zhuǎn)換的生物標(biāo)志物，從而可進(jìn)行具有生理學(xué)結(jié)果的藥效學(xué)研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突