多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法優(yōu)選腎衰乙方的提取工藝

張冰冰，張春燕，潘蓉蓉，陳 杰，路建饒*，朱建勇*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院腎病科，上海 200137；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200137)

腎衰乙方處方由制大黃、徐長卿、土茯苓、炒王不留行、陳皮、半夏、黃芪、當(dāng)歸、靈芝、胡蘆巴、黃連共11味中藥組成，為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院上海市名老中醫(yī)葉景華教授的經(jīng)驗(yàn)方。該方通過對大量慢性腎衰竭病人中藥臨床治療的長期觀察總結(jié)而成，在改善早、中期慢性腎臟病病人的癥狀體征方面療效顯著[1-2]。本研究旨在按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局對醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑的要求，擬將本院腎病科長期應(yīng)用于臨床的腎衰乙方研制成院內(nèi)制劑——腎衰乙方顆粒，使該制劑規(guī)范化應(yīng)用于臨床，保證藥物的安全性、穩(wěn)定性、有效性和可控性。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以大黃酸、大黃素、丹皮酚、落新婦苷、橙皮苷的含量及出膏率為考察指標(biāo)，對料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選腎衰乙方的最佳提取工藝，確保該藥物的工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；CP225D電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DL720-A超聲清洗儀(上海之信儀器有限公司)；SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鄭州博科設(shè)備有限公司)；N-1300-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司)；DNG-9140A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 藥物和試劑 大黃酸對照品(批號110757-201607)、大黃素對照品(批號110756-200110)、丹皮酚對照品(批號110708-201407)、橙皮苷對照品(批號110721-201818)均由中國食品藥品檢定研究院提供；落新婦苷對照品(批號29838-67-3，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純。大黃等11味藥材均購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，經(jīng)本院藥劑科副主任中藥師公丕君鑒定，符合2015年版《中華人民共和國藥典》(簡稱藥典)相關(guān)規(guī)定。

2 方法和結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

2.1.1.1 測定大黃酸、大黃素、丹皮酚的色譜條件 色譜柱為安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以0.1%磷酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～40 min，70%A；40～55 min, 70%～42%A；55～56 min，42%～70%A；56～60 min，70%A；流速1.2 ml/min；柱溫30.5 ℃；檢測波長274 nm；進(jìn)樣量10 μl。

2.1.1.2 測定落新婦苷、橙皮苷的色譜條件 采用2.1.1.1項(xiàng)下的色譜柱和流動相條件，梯度洗脫：0～15 min, 84%A；15～16 min, 84%～80%A;16～30 min，80%A；30～31 min,80%～84%A;31～35 min，84%A；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：291 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 對照品溶液的制備

2.1.2.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚對照品溶液的制備 精密稱取大黃酸、大黃素、丹皮酚對照品適量，加甲醇溶解，配制成濃度分別為280、45、100 μg/ml的混合對照品溶液，備用。

2.1.2.2 落新婦苷、橙皮苷對照品溶液的制備 精密稱取落新婦苷、橙皮苷對照品適量，加甲醇溶解，分別配制成濃度為220、370 μg/ml的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚供試品溶液的制備 稱取日處方藥材175 g，加10倍量水，煎煮3次，每次0.5 h，過濾后合并濾液，減壓濃縮至350 ml，精密吸取5 ml，加鹽酸0.15 ml，混合均勻，加入3倍量的二氯甲烷溶液，萃取3次，合并萃取液，揮干，加甲醇定容至1 ml，即得。

2.1.3.2 落新婦苷、橙皮苷供試品溶液的制備 按2.1.3.1項(xiàng)下方法制備提取液，減壓濃縮至350 ml，精密吸取1 ml，置2 ml的容量瓶中，加甲醇定容至2 ml，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備

2.1.4.1 缺大黃、徐長卿的陰性對照溶液的制備 稱取除大黃、徐長卿之外的藥材，按照2.1.3.1項(xiàng)下方法，制備缺大黃、徐長卿的陰性對照溶液。

2.1.4.2 缺土茯苓、陳皮的陰性對照溶液的制備 稱取除土茯苓、陳皮之外的藥材，按照2.1.3.2項(xiàng)下方法，制備缺土茯苓、陳皮的陰性對照溶液。

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取2.1.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液、2.1.3.1項(xiàng)下供試品溶液、2.1.4.1項(xiàng)下陰性對照品溶液各10 μl，按2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果3種指標(biāo)性成分與其相鄰的色譜峰分離度均>1.5，并且各組分互不干擾，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.2.2 落新婦苷、橙皮苷專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取2.1.2.2項(xiàng)下混合對照品溶液、2.1.3.2項(xiàng)下供試品溶液、2.1.4.2項(xiàng)下陰性對照品溶液各10 μl，按2.1.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，兩種指標(biāo)性成分與其相鄰的色譜峰分離度均>1.5，并且各組分互不干擾，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

2.3.1.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚線性關(guān)系考察 精密吸取1、2.5、5、10、15、25 μl的2.1.2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液，注入液相色譜儀，按照2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各組分的線性方程分別為：y大黃酸=924.735 0x-11.577 8(r=1.000 0)，線性范圍0.28～7 μg；y大黃素=1 257.458 3x- 1.442 8(r=1.000 0)，線性范圍0.045～1.125 μg；y丹皮酚=1 334.709 5x-4.317 8(r=1.000 0)，線性范圍0.1～2.5 μg，在相應(yīng)進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.1.2 落新婦苷、橙皮苷線性關(guān)系考察 精密吸取1、1.25、2.5、5、10、12.5 μl的2.1.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液，注入液相色譜儀，按照2.1.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各組分的線性方程分別為：y落新婦苷=532.520 5x+18.809 8(r=0.999 0)，線性范圍0.22～2.75 μg；y橙皮苷=406.863 8x+5.138 1(r=0.999 9)， 線性范圍0.37～3.7 μg，在相應(yīng)進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 腎衰乙方的HPLC譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Shenshuaiyi decoctionA：大黃酸、大黃素、丹皮酚混合對照品溶液；B：大黃酸、大黃素、丹皮酚供試品溶液；C：缺大黃、徐長卿的陰性對照溶液；D：落新婦苷、橙皮苷混合對照品溶液；E：落新婦苷、橙皮苷供試品溶液；F：缺土茯苓、陳皮的陰性對照溶液；1：丹皮酚；2；大黃酸；3：大黃素；4：落新婦苷；5：橙皮苷

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

2.3.2.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚的精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液10 μl，按2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果大黃酸、大黃素和丹皮酚峰面積的RSD值分別為0.16%、0.19%和0.08%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.3.2.2 落新婦苷、橙皮苷的精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.2.2項(xiàng)下混合對照品溶液3 μl，按2.1.1.2項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果落新婦苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為1.60%和1.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3.3.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.1.3.1項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10 μl，記錄大黃酸、大黃素、丹皮酚的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果大黃酸、大黃素、丹皮酚峰面積的RSD值分別為2.20%、2.35%和2.79%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3.2 落新婦苷、橙皮苷的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.1.3.2項(xiàng)下的方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，記錄落新婦苷、橙皮苷的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果落新婦苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為1.76%和0.64%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.4.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取按2.1.3.1項(xiàng)下方法配制的供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、16、24和36 h。按2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，測定峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果大黃酸、大黃素、丹皮酚峰面積的RSD值分別為2.17%、2.58%和2.34%(n=6)，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4.2 落新婦苷、橙皮苷的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取按2.1.3.2項(xiàng)下方法配制的供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、16和32 h。按2.1.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，測定峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果落新婦苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為1.09%和0.71%(n=6)，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.3.5.1 大黃酸、大黃素、丹皮酚的加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知指標(biāo)成分含量的供試品溶液1份，在線性范圍內(nèi)分別加入一定量的大黃酸、大黃素、丹皮酚對照品溶液，各6份，按2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件測定含量。結(jié)果大黃酸、大黃素、丹皮酚的平均回收率分別為(100.22±0.90)%、(101.60±2.83)%和(99.67±0.88)%(n=6)，表明本方法加樣回收率良好。

2.3.5.2 落新婦苷、橙皮苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按2.3.5.1項(xiàng)下方法在線性范圍內(nèi)分別加入一定量的落新婦苷、橙皮苷對照品溶液，各6份，按2.1.1.2項(xiàng)下色譜條件測定含量，結(jié)果落新婦苷和橙皮苷的平均回收率分別為(103.02±2.03)%和(103.70±2.49)%(n=6)，表明本方法加樣回收率良好。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 料液比對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約175 g，共6份，補(bǔ)足吸水量，料液比分別按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14煎煮1次，每次0.5 h，煎液濃縮至350 ml。按2.1.3項(xiàng)下方法分別配制2種供試品溶液。分別按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定含量，結(jié)果顯示，料液比為1∶4時(shí)提取效果最差，選取1∶8、1∶10和1∶12為正交試驗(yàn)料液比進(jìn)一步考察。

2.4.2 提取時(shí)間對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約175 g，共5份，補(bǔ)足吸水量，加10倍水，煎煮1次，分別煎煮0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液濃縮至350 ml。按2.1.3項(xiàng)下方法分別配制2種供試品溶液。分別按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定含量。結(jié)果顯示，煎煮2 h和2.5 h的提取效果與1.5 h相當(dāng)，所以選擇0.5、1和1.5 h為正交試驗(yàn)提取時(shí)間進(jìn)一步考察。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以腎衰乙方處方藥材濃縮提取液中5種主成分的含量及干膏得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)考察料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素，優(yōu)選出最佳的提取工藝。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見表1。

2.5.2 正交試驗(yàn)方案 按照2.1.3項(xiàng)下方法制備正交設(shè)計(jì)中各組的供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定含量，記錄峰面積，計(jì)算各供試品溶液中5種主成分的含量，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test design

2.5.3 干膏得率的測定 精密量取各組濃縮提取液150 ml，水浴蒸干，置105 ℃的烘箱中干燥至恒重，取出，置干燥器中冷卻后，迅速稱定重量，計(jì)算干膏得率，結(jié)果見表2。

2.5.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)腎衰乙方中君、臣、佐、使的各指標(biāo)因素對提取工藝影響大小的差異分配權(quán)重系數(shù)，即君藥大黃中大黃酸含量(W1)的權(quán)重系數(shù)為0.2，大黃素含量(W2)的權(quán)重系數(shù)為0.2，君藥徐長卿中丹皮酚含量(W3)的權(quán)重系數(shù)為0.2，臣藥土茯苓中落新婦苷含量(W4)的權(quán)重系數(shù)為0.1，佐藥陳皮中橙皮苷含量(W5)的權(quán)重系數(shù)為0.1，干膏得率(W6)的權(quán)重系數(shù)為0.2，進(jìn)行加權(quán)求和[3-4]，綜合評分W(%)=0.2 W1/Wmax1+ 0.2 W2/Wmax2+0.2 W3/Wmax3+0.1 W4/Wmax4+0.1 W5/Wmax5+0.2 W6/Wmax6。綜合加權(quán)評價(jià)結(jié)果見表2和表3。

表2 腎衰乙方提取工藝的L9(34)正交試驗(yàn)分析表Table 2 Analysis table of L9(34) orthogonal test of the extraction technology of Shenshuaiyi decoction

由表3中結(jié)果分析可知，各因素對綜合評分的影響依次為C>B>A，最優(yōu)提取工藝為C3B3A2，即料液比1∶10， 提取1.5 h， 提取3次。 考慮到工業(yè)化大生產(chǎn)，盡可能節(jié)約能源，而A因素下K1和K2沒有顯著性差異，故選擇1∶8的料液比進(jìn)行大生產(chǎn)，同時(shí)B因素下K2和K3沒有顯著性差異，基于減少中藥煎煮過程中成分的變化，故選擇煎煮時(shí)間為1 h。最后確定最佳提取工藝為加8倍量水，煎煮3次，每次煎煮1 h。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取1日處方量藥材，共3份，按照確定的最佳提取工藝C3B2A1進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即加入8倍量的水，提取3次，每次1 h，提取液合并濃縮至350 ml，按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定5種主成分的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，該工藝準(zhǔn)確可靠，可行性好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of verification test

3 討 論

腎衰乙方中的君藥為制大黃、徐長卿，臣藥為土茯苓、炒王不留行，佐藥為陳皮，故本文選用君藥大黃中的大黃酸、大黃素，徐長卿中的丹皮酚，臣藥土茯苓中的落新婦苷，佐藥陳皮中的橙皮苷作為含量檢測指標(biāo)，其含量測定主要參考2015年版藥典(一部)中相關(guān)藥材項(xiàng)下的含量測定方法[5]。藥典中5種指標(biāo)性成分的檢測波長分別為254、274、291和283 nm，但通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用波長274 nm和291 nm，能很好地檢測到4味藥材中主成分的含量，故本研究采用混合對照法雙波長來檢測腎衰乙方樣品，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]設(shè)計(jì)測定方法。

腎衰乙方為名老中醫(yī)葉景華教授首創(chuàng)的經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床研究結(jié)果表明，腎衰乙方能夠有效降低慢性腎臟病早中期病人的肌酐、尿素氮水平，減輕炎癥反應(yīng)，改善脂質(zhì)代謝障礙，療效顯著。本研究采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法優(yōu)選腎衰乙方提取工藝，確定最佳提取方法，為腎衰乙方顆粒制劑的開發(fā)提供完備的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，使其作為院內(nèi)制劑更規(guī)范化地應(yīng)用于臨床。