培肥措施對復(fù)墾土壤微生物碳氮代謝功能多樣性的影響

王宇峰，孟會生，李廷亮,2，謝鈞宇，栗 麗，李麗娜，黃曉磊

培肥措施對復(fù)墾土壤微生物碳氮代謝功能多樣性的影響

王宇峰1，孟會生1，李廷亮1,2※，謝鈞宇1，栗 麗1，李麗娜1，黃曉磊1

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境國家級實驗教學(xué)示范中心，太谷 030801）

土壤復(fù)墾是礦區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復(fù)和耕地總量平衡及質(zhì)量提升的根本要求。該研究依托山西襄垣采煤塌陷區(qū)定位復(fù)墾試驗基地，采用Biolog-ECO方法和熒光定量PCR技術(shù)，研究了不施肥（CK）、單施化肥（CF）、單施有機(jī)肥（M）和有機(jī)無機(jī)培肥（MCF）4種培肥措施下復(fù)墾4 a和8 a土壤微生物碳代謝功能多樣性及氮代謝功能基因豐度的變化特征。結(jié)果表明：隨復(fù)墾年限增加，單施有機(jī)肥較其他處理可顯著提高復(fù)墾土壤微生物的總碳源利用能力；不同處理復(fù)墾土壤微生物碳源相對利用率從高到低依次為氨基酸類、糖類、聚合物類、羧酸類、雙親化合物類、胺類，其中單施有機(jī)肥更大程度上提高了羧酸類、氨基酸類和胺類碳源的利用率；復(fù)墾年限和培肥措施沒有改變復(fù)墾土壤微生物優(yōu)勢度指數(shù)，但有機(jī)無機(jī)配施較其他處理可顯著提高香濃指數(shù)（）和Pielou均勻度指數(shù)；不同處理復(fù)墾土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度總體從大到小依次表現(xiàn)為（AOA）、（AOB）、、，5種功能基因豐度均為以有機(jī)無機(jī)培肥處理最高，且隨復(fù)墾時間增加而增加；復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)含量與基因豐度以及平均顏色變化率（Average Well Color Development, AWCD）值存在顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.707～0.807，同時5種氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度均與玉米產(chǎn)量存在顯著或極顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.824～0.949。綜上所述，單施有機(jī)肥可提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而增強了復(fù)墾土壤碳代謝強度，有機(jī)無機(jī)培肥則更有利于復(fù)墾土壤碳氮代謝功能多樣性的提升，并促進(jìn)作物產(chǎn)量形成。

復(fù)墾；土壤；微生物；功能多樣性；培肥措施

0 引 言

山西省煤炭資源開采為中國改革開放40多年的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)，但同時造成了大面積的生態(tài)環(huán)境破壞。經(jīng)初步統(tǒng)計，山西省因采煤造成的累積采空面積近5 000 km2，其中沉陷區(qū)面積約3 000 km2，沉陷區(qū)近40%為耕地[1-2]。礦區(qū)土地復(fù)墾是當(dāng)?shù)貙崿F(xiàn)耕地總量動態(tài)平衡、緩解人地矛盾的重要途徑。土壤培肥熟化是礦區(qū)土壤復(fù)墾重要內(nèi)容，復(fù)墾土壤質(zhì)量提升很大程度體現(xiàn)在土壤碳氮庫容變化。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的組分，在土壤碳氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，因此明確復(fù)墾土壤微生物碳氮代謝特性可有效評價復(fù)墾措施的肥力提升效應(yīng)。

土壤微生物多樣性反應(yīng)了土壤微生物自身代謝特性以及與土壤環(huán)境條件相互作用的多樣化程度，土壤微生物多樣性與土壤碳氮代謝關(guān)系密切，施肥措施通過改變土壤環(huán)境條件可進(jìn)一步影響微生物群落碳氮代謝方式[3-5]。Biolog-ECO法是一種典型解析土壤微生物碳源利用特征，反應(yīng)土壤微生物群落功能多樣性的方法。李猛等[4]對28年定位試驗的設(shè)施蔬菜地研究表明，長期不同施肥促使土壤微生物群落形成了不同的碳代謝方式，有機(jī)肥配施一定量氮肥可有效提高土壤微生物碳源利用能力，且以氨基酸類碳源的利用率最高；何翠翠等[6]對褐土區(qū)冬小麥-夏玉米輪作體系的研究表明，有機(jī)肥替代50%～100%無機(jī)氮肥可以提高土壤微生物碳源利用能力和多樣性指數(shù)，以糖類碳源的利用率最高；另外在東北黑土[7]、紅壤[8]、灰漠土[9]和水稻土[10]等研究均表明，增施有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)配施較單施化肥和不施肥可顯著提高土壤微生物對碳源的利用能力及微生物多樣性，但不同土壤類型以及不同施肥措施下碳源利用類型存在一定差異。土壤氮素循環(huán)對土壤氮庫固存與氮素供應(yīng)起著協(xié)調(diào)平衡作用，土壤氮代謝功能基因豐度與土壤氮素循環(huán)密切相關(guān)，目前有關(guān)氮轉(zhuǎn)化功能基因研究多關(guān)注于固氮作用的基因，硝化作用過程中氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的基因以及反硝化作用過程中、、基因[11-13]。施用有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)配施較單施化肥可提高土壤AOA和AOB的基因豐度[14-15]；長期施用無機(jī)氮肥可降低黑土、棕壤AOA的基因豐度，但隨施氮量增加提高了土壤中AOB的基因豐度[16-18]；另外Sun等[19]和Li等[20]研究表明施用有機(jī)肥可以增加酸性土壤中、AOA-、AOB-、、和等多個氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度，不同施肥措施下均以基因?qū)ΦD(zhuǎn)化微生物群落多樣性貢獻(xiàn)率最高，且基因較其他功能基因?qū)κ┓示哂懈叩拿舾行?。礦區(qū)復(fù)墾土壤由于土體重構(gòu)，土壤結(jié)構(gòu)性、養(yǎng)分資源庫以及微生物區(qū)系都處于初級演化階段，其理化生物學(xué)性狀必然不同于傳統(tǒng)農(nóng)田土壤。土壤微生物是表征土壤質(zhì)量變化最敏感性指標(biāo)，有關(guān)復(fù)墾土壤微生物多樣性研究對揭示土壤形成演化過程以及建立土壤快速培肥理論均具有重要意義。以往有關(guān)礦區(qū)復(fù)墾土壤的研究多集中在土壤結(jié)構(gòu)性及養(yǎng)分利用方面[21-22]，而有關(guān)不同培肥措施下土壤微生物多樣性隨復(fù)墾時間變化特征的研究則系統(tǒng)性不強，因此本研究基于長期定位試驗基地，具體研究不同培肥措施下復(fù)墾土壤微生物碳氮代謝功能多樣性變化特征，以期為礦區(qū)復(fù)墾土壤質(zhì)量提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

長期定位試驗基地位于山西省襄垣縣（36°28′11.95′′N，113°00′ 52.57′′E），海拔980 m，屬于暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫9.5 ℃，年均降水量530 mm，無霜期為160 d。土壤類型為石灰性褐土?；赜袕?fù)墾年限A和復(fù)墾年限B的試驗田，復(fù)墾年限A試驗田于2008年開始采用混推復(fù)墾方式平整恢復(fù)土地，2009年起通過不同施肥措施培肥土壤；復(fù)墾年限B試驗田于2013年同樣采用混推復(fù)墾方式平整恢復(fù)土地，并進(jìn)行土壤培肥。

1.2 試驗設(shè)計

試驗田A和B試驗處理設(shè)置相同，包括4個培肥處理：1）不施肥（CK）；2）單施化肥（CF）；3）單施有機(jī)肥（M）；4）50%有機(jī)肥+50%化肥（MCF）。其中氮肥為尿素（含N 46%），磷肥為過磷酸鈣（含P2O512%），鉀肥為硫酸鉀（含K2O 50%），有機(jī)肥為腐熟的雞糞，含N 1.68%、P2O51.54%，K2O 0.82%，各施肥處理養(yǎng)分投入量相同，具體見表1。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積為100 m2。試驗區(qū)一年一作種植春玉米，每年5月播種，10月收獲，玉米秸稈全部粉碎翻壓還田。

表1 不同施肥處理的肥料用量

注：CK，CF，M和MCF分別表示不施肥對照、單施化肥、單施有機(jī)肥、有機(jī)無機(jī)配施處理，下同。

Note: CK, CF, M and MCF mean no-fertilizer control, chemical fertilizers only, manure only and 50% chemical fertilizers co-applied with 50% manure, respectively. Same as below.

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

于2017年4月春玉米播種前，利用五點法采集每個試驗小區(qū)耕層（0～20cm）土壤混合樣品，分別得到復(fù)墾4 a（試驗田B）和復(fù)墾8 a（試驗田A）土壤樣品。同時采集周邊未復(fù)墾的撂荒生土（RS）和未破壞農(nóng)民多年種植的熟土（US）作為土壤培肥效果參照。一部分樣品過2 mm篩，放入滅菌塑料袋中，用冰盒運回實驗室，4 ℃保存，盡快完成土壤微生物碳氮代謝功能多樣性測定；一部分新鮮土壤樣品過2 mm篩，測定土壤硝態(tài)氮；剩余土壤樣品自然風(fēng)干后，分別1 mm篩和0.149 mm篩，測定土壤速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)；2016年10月試驗田玉米產(chǎn)量采用全區(qū)收獲計產(chǎn)。

1.3.1 土壤微生物碳代謝功能多樣性測定

采用Biolog-ECO分析微生物群落功能多樣性[10,23]，Biolog-ECO含有6類31種碳源。稱取10 g（當(dāng)量質(zhì)量）鮮土于250 mL三角瓶中，加入90 mL滅菌的0.85 mol/LNaCl溶液，以200 r/min振蕩30 min，取一定量上清液用0.85 mol/LNaCl溶液多級稀釋至1 000倍，靜置10 min后，向ECO板培養(yǎng)基孔中加入150L稀釋液，每個樣品做3次重復(fù)。將接種好的微孔板放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h使用ELxS08-Biolog微孔板讀數(shù)儀（Bio-Tek Instruments Inc，美國）讀取在590 nm（顏色+濁度）和750 nm（濁度）波長下的吸光度。微生物代謝活性用590 nm下的吸光度值減去750 nm 下的吸光度值表示，其中數(shù)值小于0.06時按0處理。

式中C為第個非對照孔的吸光值；為對照孔的吸光值；為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)（31）。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)

McIntosh 指數(shù)

式中n是第孔的相對吸光值（C-）。

Pielou 均勻度指數(shù)

式中為被利用的碳源總數(shù)。

微生物對碳源的相對利用率（%）=（6）

式中AWCD為第種碳源的平均顏色變化率；AWCD為所有樣品處理6類碳源中平均顏色變化率最大值。

豐富度指數(shù)，指被利用的碳源總數(shù)目，本研究中為每孔中（C-）的值大于0.25的孔數(shù)。

1.3.2 土壤微生物氮代謝功能多樣性測定

首選使用Fast DNA? Spin Kit for Soil（MP Bio，Santa Ana，CA，美國）提取各土壤樣品DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量后，使用NanoDrop2000（Thermo Fisher，Waltham，MA，美國）測定DNA濃度和純度。然后使用熒光定量PCR儀（ABI 7500 Thermocycler，Applied Biosystems, California, 美國）測定各樣品的氮代謝功能基因豐度，包括與硝化作用相關(guān)的基因（包括AOA和AOB），與反硝化作用相關(guān)的、基因以及固氮細(xì)菌的基因，進(jìn)而評價土壤微生物氮代謝功能多樣性。

5種功能基因的qPCR擴(kuò)增體系均為：土壤微生物總DNA 1L，正反向引物各1L，TaKaRa TB Green? Premix Ex Taq? II 12.5L，加ddH2O補足至25L。不同氮代謝功能基因的特異性引物及其qPCR反應(yīng)條件見表2。擴(kuò)增過程中，分別以含有目標(biāo)功能基因的重組pMD19-T載體為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并按 10倍濃度稀釋梯度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述5種氮代謝功能基因擴(kuò)增曲線的2值均大于0.99。

表2 基因擴(kuò)增引物及其反應(yīng)條件

1.3.3 土壤養(yǎng)分含量測定

土壤硝態(tài)氮采用 1mol/LKCI浸提，流動分析儀測定[28]；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定[29]；土壤速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定[29]；速效鉀采用1 mol/LNH4OAC浸提，火焰光度法測定[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016整理，利用SPSS20.0軟件進(jìn)行作圖和檢驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理復(fù)墾土壤微生物的碳源利用特征

復(fù)墾土壤微生物對碳源利用的AWCD值隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加（圖1），自24 h起迅速增加，168h后呈緩慢增加狀態(tài)。復(fù)墾4 a土壤，不同處理間AWCD值從高到低依次為MCF、 M、CF、CK，除CK處理外，其余3個培肥處理AWCD值較周邊撂荒（AS）土壤均有不同程度增加。復(fù)墾8 a土壤，不同處理間AWCD值從高到低則依次為M、MCF、CF、CK，進(jìn)一步方差分析表明，M處理AWCD值自96 h起顯著高于其他處理，但其最大值較周邊農(nóng)田熟土（US）仍低19.5%（<0.05），MCF、CF和CK處理相對于復(fù)墾4 a土壤AWCD值無顯著提升，且CF處理的增加幅度低于CK處理。

對不同處理復(fù)墾土壤培養(yǎng)168 h的6類碳源相對利用率分析表明（表3），土壤微生物碳源相對利用效率從高到低依次為氨基酸類、糖類、聚合物類、羧酸類、雙親化合物類、胺類，其中胺類和雙親化合物類的相對利用率低于50%。經(jīng)過4 a培肥復(fù)墾，不同施肥處理土壤微生物對糖類、雙親化合物類碳源利用差異不顯著，但M和MCF處理較CF和CK處理相對提高了聚合物類、羧酸類、氨基酸類和胺類碳源的利用率，且高于撂荒土壤相應(yīng)碳源利用率。經(jīng)過8 a培肥復(fù)墾，CF較CK處理顯著降低了雙親化合物類碳源利用率，其余5類碳源差異不顯著。M和MCF相對于CF處理顯著提高了聚合物類、羧酸類、氨基酸類、胺類和雙親化合物類碳源利用率，其中M處理更大程度地提高了羧酸類、氨基酸類和胺類碳源的利用率，但其中氨基酸類和胺類碳源利用率較周邊農(nóng)田熟土仍低20%左右。

注：US和AS分別表示周邊未破壞農(nóng)田熟土和撂荒生土，下同。

表3 復(fù)墾土壤微生物對6類碳源的相對利用率

注：同一列后不同小寫字母表示各施肥處理在0.05水平差異顯著，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences in fertilizer treatments (< 0.05). Same as below.

2.2 不同處理復(fù)墾土壤微生物的多樣性指數(shù)分析

不同培肥處理復(fù)墾土壤微生物的香濃指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh指數(shù)、豐富度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)見表4。其中香濃指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)變化趨勢一致，復(fù)墾8 a土壤總體高于復(fù)墾4 a土壤，不同處理間均以MCF處理最高，且復(fù)墾8 a土壤下MCF處理的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)接近于周邊未破壞農(nóng)田熟土水平，較撂荒生土分別高28.6%和27.8%，同時顯著高于其他培肥處理。不同復(fù)墾年度和培肥處理下土壤微生物優(yōu)勢度指數(shù)無顯著變化，以及與撂荒地和農(nóng)田熟土之間亦無明顯差異，均值為0.95。McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)均以M和MCF處理最高，顯著高于CF和CK處理，但M和MCF處理之間差異不顯著。各培肥處理的McIntosh指數(shù)隨復(fù)墾年限增加總體提升，而豐富度指數(shù)則對復(fù)墾年限無明顯響應(yīng)。同時由表4可知，CF和CK處理之間的5個多樣性指數(shù)無顯著差異。

表4 不同培肥措施復(fù)墾土壤中微生物多樣性指數(shù)

2.3 不同處理復(fù)墾土壤微生物功能多樣性的主成分和聚類分析

對不同處理復(fù)墾土壤培養(yǎng)168 h各碳源的AWCD值進(jìn)行主成分分析，得到特征值大于1的主成分6個，第1主成分（PC1）至第6主成分（PC6）方差貢獻(xiàn)率分別為41.1%、25.4%、14.1%、5.6%、4.8%和3.4%，累積貢獻(xiàn)率為94.4%，本研究選取前3個主成分進(jìn)行分析。31種碳源在前3個主成分中的因子載荷值（表5）可以反映主成分與碳源利用的相關(guān)程度，絕對值越大表示該碳源對主成分的影響越大，意味著處理之間該碳源利用率差異性越大。本研究中PC1載荷值絕對值>0.7的有14種，其中包括糖類5種（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙酰基-D-葡萄胺，D-纖維二糖，a-D-乳糖），氨基酸4種（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸），聚合物類（a-環(huán)狀糊精）1種，胺類（苯乙基胺）1種，D-半乳糖醛酸在內(nèi)的羧酸類3種。其余PC2和PC3載荷值絕對值 >0.7的共有7種，其中包括糖類1種，氨基酸類1種，聚合物類1種，羧酸類4種。進(jìn)一步Q型聚類分析表明（圖 2），若分為4類，US為1類，AS為1類，8-M為1類，其余為1類，這與上述6類碳源利用和多樣性指數(shù)變化趨勢相近。

注：4、8表示復(fù)墾時間，a。

表5 31種碳源的因子載荷

2.4 不同處理復(fù)墾土壤微生物氮代謝功能基因豐度分析

復(fù)墾土壤5種功能基因豐度總體表現(xiàn)從大到小依依為為（AOA）、（AOB）、、（表6），初步推測復(fù)墾土壤氮循環(huán)過程中硝化作用強于反硝化作用，并優(yōu)于固氮作用。隨復(fù)墾年限增加，土壤中5種功能基因豐度均呈增加趨勢，復(fù)墾8 a土壤AOA和AOB 的基因拷貝數(shù)分別較復(fù)墾4 a土壤增加0.70～3.92倍和0.76～3.06倍，和基因拷貝數(shù)分別增加0.57～1.01倍和1.10～2.15倍，基因拷貝數(shù)增加了0.29～0.93倍，以AOA和AOB 的基因增加幅度最大。不同培肥處理間5種功能基因豐度均表現(xiàn)為MCF > M > CF> CK，且差異達(dá)顯著水平。復(fù)墾8 a的MCF處理各基因拷貝數(shù)接近或高于周邊未破壞農(nóng)田熟土水平。

表6 不同培肥措施對復(fù)墾土壤氮代謝功能基因豐度的影響

2.5 不同處理復(fù)墾土壤養(yǎng)分含量、玉米產(chǎn)量及其與微生物碳氮代謝多樣性相關(guān)性分析

表7是不同培肥處理下復(fù)墾土壤養(yǎng)分含量及玉米產(chǎn)量情況?？芍?jīng)過4～8 a培肥，采煤塌陷復(fù)墾土壤各養(yǎng)分含量較周邊撂荒（AS）土壤均有明顯提升，其中復(fù)墾8 a土壤的有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、速效磷和速效鉀較復(fù)墾4 a土壤分別平均提高了16.9%、33.2%、63.8%和3.0%。同一復(fù)墾年限，不同培肥處理間土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀均以M處理最高，而硝態(tài)氮則以CF處理最高。復(fù)墾8 a土壤的玉米產(chǎn)量較復(fù)墾4 a土壤增加了17%～46%，不同處理間玉米產(chǎn)量從大到小依次為MCF、M、CF、CK，且差異達(dá)顯著水平。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明（表8），土壤有機(jī)質(zhì)含量與反應(yīng)微生物碳代謝多樣性的AWCD值存在顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.807，且土壤有機(jī)質(zhì)含量與反硝化基因和固氮基因豐度亦存在顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.707～0.766，另外土壤5種氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度均與玉米產(chǎn)量存在顯著或極顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.824～0.949。

表7 不同培肥措施對復(fù)墾土壤養(yǎng)分含量及玉米產(chǎn)量的影響

表8 復(fù)墾土壤微生碳氮代謝多樣性與土壤養(yǎng)分及玉米產(chǎn)量的相關(guān)性

注（Note）：*< 0.05; **< 0.01.

3 討 論

平均顏色變化率（AWCD）表征土壤微生物群落對不同碳源利用的差異性，反映了土壤微生物活性和微生物群落生理功能多樣性。本研究中，各培肥處理的AWCD值在培養(yǎng)168 h后呈緩慢上升狀態(tài)，其中有機(jī)無機(jī)配施和單施有機(jī)肥處理的AWCD值總體高于單施化肥和對照處理，隨復(fù)墾年限增加，單施有機(jī)肥處理較其他處理顯著提高了AWCD值。表明施用有機(jī)肥可以提高土壤微生物活性和群落多樣性，且隨時間進(jìn)程增加，這種促進(jìn)效應(yīng)更強，這與前人研究結(jié)果一致[6-8]。分析原因認(rèn)為有機(jī)肥的投入一方面為微生物代謝活動提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方也會改變土壤理化性質(zhì)，優(yōu)化了土壤微生物生存代謝條件，進(jìn)而提高土壤微生物群落代謝功能[6,23,30]。本研究進(jìn)一步分析也表明單施有機(jī)肥較其他處理更大程度提高了土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀含量，且土壤有機(jī)質(zhì)含量與168 h的AWCD值存在顯著相關(guān)性。

前人大量研究表明增施有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)配施較單施化肥可顯著提高土壤微生物的碳源利用能力[7-10]。本研究在相同氮磷鉀供應(yīng)量條件下，也發(fā)現(xiàn)單施有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)配施較單施化肥或不施肥整體上提高了采煤塌陷區(qū)復(fù)墾土壤微生物的碳源相對利用率，其中單施有機(jī)肥對部分碳源的利用率相對更高。分析原因認(rèn)為外源有機(jī)肥施用為土壤提供了大量生物有效性碳源以及部分外源菌群，同時新鮮有機(jī)碳會產(chǎn)生激發(fā)效應(yīng)，維持比較高的微生物活性[4,6,31]；而長期單施化肥產(chǎn)生的脅迫作用會一定程度上降低土壤細(xì)菌和真菌的多樣性，進(jìn)而降低微生物生物量及其生物活性[8,23,32]。

本研究中復(fù)墾土壤微生物碳源相對利用效率從高到低依次為氨基酸類、糖類、聚合物類、羧酸類、雙親化合物類、胺類。張婷等[33]和張瑞等[34]在華北潮土區(qū)小麥-玉米輪作體系，侯曉杰等[35]在東北棕壤連作玉米體系，以及羅希茜等[36]在稻田土壤上的研究也均顯示當(dāng)?shù)赝寥牢⑸锶郝淅玫闹饕荚词前被犷惡吞穷?，說明糖類和氨基酸類有機(jī)物質(zhì)是土壤中大多微生物種群的基礎(chǔ)代謝物質(zhì)。然而，不同外源有機(jī)肥投入條件下土壤微生物對6種碳源利用嗜好有很大差異，本研究中單施有機(jī)肥（腐熟雞糞）處理土壤微生物對氨基酸類碳源利用率最高，隨復(fù)墾年限增加，單施有機(jī)肥更大程度上提高了氨基酸類、羧酸類和胺類碳源的利用率。劉晶鑫等[7]研究則表明單施馬糞處理下土壤微生物對聚合物類碳源利用率最高。郭瑩等[10]研究表明低量有機(jī)肥投入條件下，發(fā)酵豬糞較新鮮豬糞處理土壤微生物對聚合物類和糖類碳源具有較高的利用率；高投入量條件下，發(fā)酵豬糞較新鮮豬糞處理土壤微生物對氨基酸類和胺類碳源具有較高的利用率?？梢?，不同有機(jī)肥因組成成分和特性差異，對土壤微生物類群具有一定的定向選擇性。另外本研究中，隨復(fù)墾年限增加，單施化肥處理降低了雙親化合物類碳源利用率，具體原因有待進(jìn)一步分析。

從微生物多樣指數(shù)來看，本研究中不同培肥措施改變了土壤微生物群落功能多樣性，有機(jī)無機(jī)配施和單施有機(jī)肥較不施肥和單施化肥處理顯著提高了McIntosh指數(shù)（）和豐富度指數(shù)（），另外有機(jī)無機(jī)配施處理更大程度提高了Shannon-wiener指數(shù)（）和Pielou均勻度指數(shù)（），表明施用有機(jī)肥可以增加土壤微生物生理類群數(shù)量和均勻度，其中有機(jī)無機(jī)配施更有利于土壤微生物多樣性的提升，原因可能是化肥配施有機(jī)肥為土壤微生物代謝提供了更全面的營養(yǎng)物質(zhì)，可使得土壤中更多的微生物類群活躍起來。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，不同復(fù)墾年度和培肥處理下土壤微生物Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（）無顯著變化，豐富度指數(shù)（）對復(fù)墾年限無明顯響應(yīng)，表明不同培肥措施及復(fù)墾進(jìn)程并沒有促成土壤微生物群落個別類群的優(yōu)勢分布，且類群豐富度受復(fù)墾進(jìn)程的影響也較小。徐萬里等[9]的研究也表明不同施肥措施對土壤Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（）影響不明顯，但也有研究表明單施有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)配施有利于提高土壤微生物群落優(yōu)勢種的優(yōu)勢度[6,35,37]，這可能與投入有機(jī)肥的種類及可能帶入的微生物類群有關(guān)。

本研究中，通過對復(fù)墾土壤培養(yǎng)168h各碳源的AWCD值進(jìn)行主成分因子載荷值的分析，發(fā)現(xiàn)不同培肥處理之間碳代謝差異主要集中在5種糖類（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙?；?D-葡萄胺，D-纖維二糖和a-D-乳糖）和4種氨基酸（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸）。在張婷等[33]的研究中，也表明不同施肥措施下土壤微生物群落代謝特征差異較大，主要體現(xiàn)在D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄胺、a-D-乳糖、D-纖維二糖、L-天冬酰胺酸和L-蘇氨酸，與本研究結(jié)果相近。進(jìn)一步通過聚類分析表明，未復(fù)墾撂荒土壤分為1類，周邊未破壞農(nóng)田熟土分為1類，單施有機(jī)肥復(fù)墾8 a的土壤分為1類，其他培肥措施的復(fù)墾土壤分為1類，表明復(fù)墾土壤通過多年的有機(jī)肥投入已很大程度上改變了土壤碳代謝功能多樣性。

功能基因豐度可以間接反應(yīng)微生物代謝功能強度，本研究表明不同培肥措施下復(fù)墾土壤功能基因豐度總體表現(xiàn)為（AOA）>（AOB）>>，初步推測復(fù)墾土壤氮循環(huán)過程中硝化作用強于反硝化作用，并優(yōu)于固氮作用。蓋霞普[38]在華北平原農(nóng)田的研究也表明長期增施糞肥會顯著增加氨氧化細(xì)菌豐度，進(jìn)而增加了土壤硝化速率。土壤理化特性對土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因的分布具有重要影響作用，比如土壤pH是影響硝化過程和反硝化過程的主要因子[18,20,39]。Bossolani等[40]研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤施用石灰或石膏可以提高固氮基因豐度，降低硝化基因和反硝化基因豐度。另外本研究中堿性復(fù)墾土壤（AOA）基因豐度高于（AOB）基因豐度，而大多數(shù)研究表明AOA和AOB生態(tài)位分異特征表現(xiàn)為AOA在酸性土壤中占主導(dǎo)優(yōu)勢，而AOB在中性或堿性的環(huán)境中起主導(dǎo)作用[41-44]，另外賀紀(jì)正等[45]指出氨氧化古菌主要由Group1.1a associated 和Group1.1b 兩大類組成，其中Group1.1a associated 主要分布于酸性土壤，Group1.1b 則主要分布于中性及堿性土壤，原因可能是本研究的復(fù)墾土壤中氨氧化古菌主要是Group1.1b類群。

本研究中，有機(jī)無機(jī)培肥處理的5種功能基因豐度均顯著高于其他培肥措施。Sun等[19]通過30年的長期定位試驗也表明，有機(jī)肥配施肥化肥可以提高土壤中（AOA）、（AOB）、和基因豐度。同時本研究表明，隨復(fù)墾年限增加，5種功能基因豐度均表現(xiàn)為增加趨勢，其中以有機(jī)無機(jī)配施處理的AOA和AOB 的基因增加幅度最大，表明AOA和AOB 的基因?qū)κ┓实拳h(huán)境因子較其他功能基因更具敏感性，進(jìn)一步說明氨氧化作用較固氮作用和反硝化作用對肥料的投入更加敏感，這在Sun等的研究中也有相關(guān)報道[19]。另外本研究中，復(fù)墾土壤反硝化基因和固氮基因豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量存在顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.707～0.766，表明化肥配施有機(jī)肥通過提升土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善了土壤微生物生境條件，進(jìn)而提高了相關(guān)氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度。同時本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)墾區(qū)玉米籽粒產(chǎn)量與5種功能基因豐度均存在顯著或極顯著的相關(guān)性，表明土壤氮代謝功能強度對作物養(yǎng)分利用和產(chǎn)量形成具有重要的促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

1）采煤塌陷區(qū)復(fù)墾土壤微生物對碳源的相對利用率從高到低依次為氨基酸類、糖類、聚合物類、羧酸類、雙親化合物類、胺類，連續(xù)多年單施有機(jī)肥可顯著提高復(fù)墾土壤微生物的碳源利用能力，且更大程度上提高了羧酸類、氨基酸類和胺類碳源的利用率。不同培肥處理之間微生物碳代謝差異主要集中在5種糖類（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙?；?D-葡萄胺，D-纖維二糖和a-D-乳糖）和4種氨基酸（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸）。

2）培肥措施和復(fù)墾年限均沒有改變復(fù)墾土壤微生物優(yōu)勢度指數(shù)，且豐度度指數(shù)對復(fù)墾年限亦無明顯響應(yīng)，表明不同培肥措施及復(fù)墾進(jìn)程并沒有促成土壤微生物群落個別類群的優(yōu)勢分布，且類群豐富度受復(fù)墾進(jìn)程的影響也較小。有機(jī)無機(jī)配施較單施有機(jī)肥顯著提高了土壤微生物Shannon-wiener指數(shù)（）和Pielou均勻度指數(shù)（）。

3）復(fù)墾土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度總體從大到小表現(xiàn)為（AOA）、（AOB）、、、，初步推測復(fù)墾土壤氮循環(huán)過程中硝化作用強于反硝化作用，并優(yōu)于固氮作用。有機(jī)無機(jī)配施較其他培肥措施可顯著提高5種功能基因豐度，且以AOA和AOB 的基因增加幅度最大，表明AOA和AOB 的基因?qū)κ┓实拳h(huán)境因子較其他功能基因更具敏感性。

4）復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)含量與基因豐度以及平均顏色變化率存在顯著相關(guān)性，同時5種氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度均與玉米產(chǎn)量存在顯著或極顯著的相關(guān)性?？傮w表明，單施有機(jī)肥可提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而增強了復(fù)墾土壤碳代謝強度，有機(jī)無機(jī)培肥則更有利于復(fù)墾土壤碳氮代謝功能多樣性的提升，并促進(jìn)作物產(chǎn)量形成。

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Effects of fertilization regime on the functional diversity of microbial carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil

Wang Yufeng1, Meng Huisheng1, Li Tingliang1,2※, Xie Junyu1, Li Li1, Li Lina1, Huang Xiaolei1

(1,,030801,; 2.,,030801,)

Soil reclamation has become a fundamental requirement for ecological environment restoration, total dynamic balance of cultivated land resources, and soil quality improvement in mining areas. This study was carried out at the long-term reclaimed base of a coal mining subsidence area in Xiangyuan county, Shanxi province, China. Surface soil samples of 0-20 cm were collected under various fertilization regimes in the 4- and 8-year experiment. Biolog-ECO and qPCR technologies were used to investigate the effect of various fertilization regimes on the soil microbial functional diversity of carbon metabolism, and functional gene abundance of nitrogen metabolism. Four fertilization treatments were applied within each reclamation stage, including no fertilizer (CK), chemical fertilizer only (CF), manure only (M), and 50% chemical fertilizers co-applied with 50% manure (MCF). The results showed that the M treatment can significantly improve the ability of soil microorganisms to utilize total carbon sources, compared with other treatments with the increase of reclamation years. The relative utilization rate of microorganism to carbon sources in reclaimed soil under various treatments were successively amino acids, carbohydrate, polymers, carboxylic acids, amine and miscellaneous from high to low. The M treatment improved the utilization rate of carboxylic acids, amino acids, and amines to a greater extent than those of other carbon sources. The differences of microbial carbon metabolism between various fertilizer treatments were mainly concentrated in five kinds of sugars, (including I-Erythritol, D-Mannitol, N-Acetyl-D-glucosamine, D-Cellobiose and α-D-Lactose), and four amino acids (including L-Arginine, L-Asparagine, L-Serine and L-Threonine). No significant change was observed in the Simpson index () under various reclamation years and fertilization regimes, indicating that the fertilization measures and reclamation years did not contribute to the dominant distribution of soil microbial physiological groups. The MCF treatment significantly improved the Shannon-wiener index () and Pielou evenness index (), compared with other treatments. The functional gene abundance of nitrogen conversion was ranked in a descend order:AOAAOB, in the reclaimed soil under various treatments. It infers that the nitrification was stronger than the denitrification and nitrogen fixation in the nitrogen cycle process of reclaimed soil. The abundance of five functional genes in the MCF treatment was the highest than that in other treatments, where increasing with the increase of reclamation time. The increase amplitude ofgene of AOA and AOB was the highest, indicating that the amoA gene was more sensitive than other functional genes to environmental factors, such as fertilization. The content of organic matter was significantly correlated with the abundance of,,genes, and AWCD values in reclaimed soil, where the correlation coefficient was 0.707-0.807. Meanwhile, the abundance of five nitrogen conversion function genes was significantly or extremely significantly correlated with maize yield, where the correlation coefficient was between 0.824-0.949. Single application of manure can significantly increase the content of soil organic matter, and then enhance the intensity of microbial carbon metabolism, while, the combination of manure and chemical fertilizer was more conducive to improve the function diversity of carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil, and thereby to promote the crop yield.

reclamation; soils; microorganism; functional diversity; fertilization regime

王宇峰，孟會生，李廷亮，等. 培肥措施對復(fù)墾土壤微生物碳氮代謝功能多樣性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(24)：81-90.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010 http://www.tcsae.org

Wang Yufeng, Meng Huisheng, Li Tingliang, et al. Effects of fertilization regime on the functional diversity of microbial carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(24): 81-90. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010 http://www.tcsae.org

2020-07-26

2020-11-18

國家自然科學(xué)基金項目（41401342，41807102，U1710255-3）

王宇峰，主要從事土壤肥力與環(huán)境方面的研究。Email：luckytll@yeah.net

李廷亮，博士，教授，主要從事土壤肥力與環(huán)境方面的研究。Email：litinglaing021@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010

S158.5

A

1002-6819(2020)-24-0081-10