葉片衰老抑制基因 PSAG12-IPT在小麥遺傳改良中的應用

戴 雙，郭 軍，程敦公，曹新有，巨 偉，訾 妍，吉萬全，宋健民

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/小麥玉米國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室, 山東濟南 250100；2.山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心, 山東濟南 250100；3.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院, 陜西楊凌 712100)

葉片衰老不僅是一個細胞程序化死亡的過程，也是營養(yǎng)成分再利用的過程，如N元素由衰老葉片轉(zhuǎn)移到新生葉片以及葉片中的養(yǎng)分向籽粒中的轉(zhuǎn)移[1-3]。葉片衰老受激素調(diào)控，如脫落酸、乙烯和茉莉酸可促進葉片的衰老，而細胞分裂素(CTK)則直接參與衰老相關的過程[4]，包括葉綠素的降解過程和光合作用相關酶的降解過程(如Rubisco酶的降解)。Simmonds等[5]研究表明，延緩小麥旗葉衰老可以提高作物產(chǎn)量。因此，延緩葉片衰老對于培育高產(chǎn)新品種具有重要意義。

PSAG12(promoter of senescence-associated genes)是從擬南芥中分離到的衰老特異性啟動子，IPT(isopentenyl transferase gene)是從根瘤農(nóng)桿菌中分離到的異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因，是CTK合成的限速酶[6]。1995年，研究人員首次將PSAG12和IPT構建到同一個表達載體上，并獲得攜帶PSAG12-IPT的轉(zhuǎn)基因煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)基因煙草相比，攜帶表達載體PSAG12-IPT的轉(zhuǎn)基因煙草葉片持綠時間更長，衰老速度變慢[6]。其作用原理為：當葉片開始衰老時，SAG12被特異激活，促進IPT基因表達，CTK含量增加，使葉片衰老延緩；而葉片衰老延緩反過來又使SAG12啟動子關閉，從而避免CTK的過量合成造成植物形態(tài)和發(fā)育的異常。之后，研究人員將同時攜帶PSAG12和IPT的表達載體轉(zhuǎn)化到其他植物中，如小麥、油菜、擬南芥、匍匐剪股穎、棉花、玉米、花生和多年生草，獲得了一系列轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)PSAG12和IPT的共表達載體與植物抗旱性、耐澇性、耐鹽性、衰老速度、光合作用和氮素分配等密切相關[6-14]。然而關于PSAG12-IPT基因是否延緩普通小麥衰老的研究較少。

本研究利用共表達PSAG12和IPT的轉(zhuǎn)基因小麥材料TIPT-XN1376與推廣小麥品種陜麥159、周麥18、遠豐175、西農(nóng)979和鄭麥9023進行雜交，獲得F1，自交獲得F2，并對其進行分子標記輔助選擇和葉綠素含量測定，研究PSAG12-IPT基因在小麥中的遺傳特點及其與衰老和葉片葉綠素含量的關系，以期為PSAG12-IPT基因在小麥育種中的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

攜帶PSAG12和IPT表達載體的轉(zhuǎn)基因小麥TIPT-XN1376(受體親本為西農(nóng)1376)由西北農(nóng)林科技大學提供,推廣小麥品種陜麥159、周麥18、遠豐175、西農(nóng)979和鄭麥9023由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥育種室提供。以轉(zhuǎn)基因小麥材料為母本，分別與5個推廣小麥品種進行雜交獲得F1，自交獲得F2群體。

1.2 葉片衰老抑制基因 PSAG12-IPT的PCR檢測

利用CTAB法提取供試小麥幼嫩葉片的基因組DNA[15]。PCR 引物序列為:PSAG12-F:5′-GCAAAGAGACGGGAAGAAA-3′，PSAG12-R:5′-TGGCTGAAGTGATAACCGTC-3′[7]。

PCR擴增體系為10 μL，包括5 μL 2×Taq master(2×Taq PCR Buffer, 3 mmol·L-1MgCl2，400 μmol·L-1dNTP mix)，DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，滅菌雙蒸水2 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。利用2%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE)檢測PCR產(chǎn)物[16]。

1.3 葉綠素含量的測定

從上述雜交組合F2群體中，每個組合隨機選擇30株，參考Arnon[17]、薛 香等[18]的方法測定旗葉葉綠素含量，并做少許改動。具體步驟為：于小麥抽穗期剪取小麥旗葉，立即放入液氮中保存；稱取0.2 g待測葉片，剪碎后放入 50 mL量杯中，加入20 mL酒精，封口，并在黑暗中放置 24 h，中間震蕩數(shù)次，至葉片完全變白；在665和649 nm下測定提取液吸光度，分別用OD665和OD649表示，并計算葉綠素含量。葉片中葉綠素含量的計算公式：CFL=6.63×OD665+18.08×OD649；葉片中葉綠素的相對含量計算公式：

C=CFL/FW×100%，F(xiàn)W為樣品鮮重。

1.4 統(tǒng)計分析和圖片處理

采用卡方(χ2)法檢驗F2群體中攜帶PSAG12-IPT基因植株與不攜帶PSAG12-IPT基因植株的分離情況。利用SPSS 10.0軟件對旗葉葉綠素含量進行差異顯著性分析，差異顯著性用LSD法來表示；利用Sigmaplot 12.0軟件繪制柱形圖，并利用PhotoShop CS 6.0軟件處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因株系 PSAG12-IPT的PCR檢測結(jié)果及其遺傳特點

每個組合分別提取F1代植株的幼嫩葉片(10株)，從其PCR檢測結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，這50個株系均能擴增出526 bp的目標片段，說明F1單株均攜帶PSAG12-IPT基因。從每個組合的F2代群體中，隨機選取30株，對PSAG12-IPT基因進行PCR檢測，結(jié)果5個組合中攜帶PSAG12-IPT的植株與不攜帶PSAG12-IPT植株的比例分別為 22∶8、24∶6、21∶9、20∶10和23∶7(表1)。卡方測驗表明，PSAG12-IPT以單基因的形式在子代中穩(wěn)定遺傳。

M：DL2000；ZH1：組合1-F1；ZH2：組合2-F1；ZH3：組合3-F1；ZH4：組合4-F1；ZH5：組合5-F1；T1376：TIPT-XN1376；1：西農(nóng)1376；2：陜麥159；3：周麥18；4：遠豐175；5：西農(nóng)979；6：鄭麥9023。

表1 PSAG12-IPT在F2群體中的遺傳分析

2.2 轉(zhuǎn)基因材料后代的葉片葉綠素含量

由圖2可知，攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比其父本以及不攜帶PSAG12-IPT的株系均有顯著提高。與親本西農(nóng)1376相比，轉(zhuǎn)基因株系TIPT-XN1376的葉綠素含量增加了9.1%；組合1-F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比不攜帶PSAG12-IPT的株系增加了 6.0%；組合2-F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比不攜帶PSAG12-IPT的株系增加了10.5%；組合3-F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比不攜帶PSAG12-IPT的株系增加了4.2%；組合4-F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比不攜帶PSAG12-IPT的株系增加了9.9%；組合5-F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系旗葉葉綠素含量比不攜帶PSAG12-IPT的株系增加了5.4%。

1：TIPT-XN1376；2：西農(nóng)1376；3：組合1-F2群體中攜帶 PSAG12-IPT的株系；4：組合1-F2群體中不攜帶 PSAG12-IPT的株系；5：陜麥159；6：組合2-F2群體中攜帶 PSAG12-IPT的株系；7：組合2-F2群體中不攜帶 PSAG12-IPT的株系；8：周麥18；9：組合3-F2群體中攜帶 PSAG12-IPT的株系；10：組合3-F2群體中不攜帶 PSAG12-IPT的株系；11：遠豐175；12：組合4-F2群體中攜帶 PSAG12-IPT的株系；13：組合4-F2群體中不攜帶 PSAG12-IPT的株系；14：西農(nóng)979；15：組合5-F2群體中攜帶 PSAG12-IPT的株系；16：組合5-F2群體中不攜帶 PSAG12-IPT的株系；17：鄭麥9023。誤差線表示重復間的誤差,圖柱上不同字母表示品系間差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

植物的生、長、衰、病、老、死等一切生命現(xiàn)象都與基因有關[1-3]。不論是控制質(zhì)量性狀的基因還是控制數(shù)量性狀的基因，基因在子代的傳遞過程都遵循孟德爾遺傳規(guī)律[19-21]。然而，關于轉(zhuǎn)基因株系中被轉(zhuǎn)入基因遺傳特點的研究還未見報道。本研究以轉(zhuǎn)基因株系TIPT-XN1376與普通小麥品種陜麥159、周麥18、遠豐175、西農(nóng)979和鄭麥9023雜交獲得的F2群體為試驗材料，利用PSAG12-IPT基因的特異分子標記[7]進行PCR檢測，結(jié)果表明，150個后代中，轉(zhuǎn)基因株系中攜帶PSAG12-IPT植株與不攜帶PSAG12-IPT植株的數(shù)目比例為110∶40，χ2檢驗結(jié)果表明，符合3∶1的遺傳特點，即轉(zhuǎn)基因株系TIPT-XN1376中PSAG12-IPT基因是以單拷貝的形式存在的，并且其遺傳符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律。

目前，已將PSAG12和IPT共表達載體轉(zhuǎn)入多種植物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株抗逆性明顯增強、衰老速度延緩，光合作用、氮素分配也發(fā)生明顯改變[6-14]。然而關于PSAG12-IPT基因延緩普通小麥衰老的研究較少。本研究測定了轉(zhuǎn)基因株系、受體親本及其轉(zhuǎn)育后代旗葉的葉綠素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個組合F2群體中攜帶PSAG12-IPT的株系中旗葉葉綠素含量(平均55.4 mg·g-1)均比不攜帶PSAG12-IPT的株系(平均51.7 mg·g-1)顯著提高，平均提高7.2%，說明PSAG12-IPT基因能夠降低植株葉片葉綠素降解速率，使葉片維持較長的持綠時間。然而，盡管PSAG12-IPT嵌合基因在葉片衰老時表達，從本研究初步測定結(jié)果看，轉(zhuǎn)基因后代葉片葉綠素含量也表現(xiàn)明顯升高的趨勢，這對于植株整體形態(tài)保持和提高生物學產(chǎn)量是非常有利的，但是這種生理上的變化與轉(zhuǎn)入基因的關系有待進一步確認和研究。