楊樹(shù)SHMT基因家族分析及PtrSHMT9突變體創(chuàng)制

李 冰 程玉祥

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT）是一種磷酸毗哆醛（PLP）依賴酶，可催化L-絲氨酸和甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化，參與轉(zhuǎn)氨基和脫羧反應(yīng)，在細(xì)胞一碳代謝途徑中發(fā)揮重要作用［1～3］。作為參與基礎(chǔ)代謝重要酶類(lèi)，SHMT在原核生物中常常以二聚體形式存在，而在真核生物中則以四聚體形式存在［4］。擬南芥SHMT 家族有7個(gè)成員，AtSHM1和AtSHM2定位在線粒體基質(zhì)，其他成員存在于細(xì)胞質(zhì)［5～6］。AtSHM1是葉的主要SHMT 酶，缺失導(dǎo)致突變體光呼吸途徑被破壞，植株呈現(xiàn)變小、葉片失綠等典型光呼吸突變體缺陷表型［7～9］。光強(qiáng)度、鹽、干旱等非生物脅迫加重?cái)M南芥、水稻atshm1和osshm1突變體缺陷表型，深入探究顯示SHMT 降低非生物脅迫導(dǎo)致的植物細(xì)胞內(nèi)有毒活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，減輕了細(xì)胞內(nèi)氧化損傷［10～12］。擬南芥異源過(guò)表達(dá)OsSHMT3 增強(qiáng)其對(duì)鹽逆境耐受性，體現(xiàn)了植物SHMT 應(yīng)對(duì)非生物脅迫的功效［13］。另外，鹽脅迫下AtSHMT1 被泛素化修飾，UBP16 泛素特異蛋白酶對(duì)其去泛素化、穩(wěn)定SHMT 蛋白質(zhì)總量與酶活性，參與應(yīng)對(duì)鹽逆境［14］。

此外，SHMT 是甘氨酸脫羧酶復(fù)合物（GDC）亞基，協(xié)同調(diào)節(jié)光呼吸L-絲氨酸和甘氨酸轉(zhuǎn)化，滿足多年生木本植物木質(zhì)化的一碳代謝需求［15］。然而，SHMT家族參與木材形成的功能鮮少報(bào)道。本研究識(shí)別楊樹(shù)PtrSHMT 基因家族，分析其表達(dá)模式，基于CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)制了ptrshmt9 敲除突變體，為進(jìn)一步鑒定樹(shù)木SHMT功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集溫室栽培3個(gè)月齡的毛果楊幼樹(shù)木質(zhì)部、韌皮部、根、頂芽、葉柄、幼葉和老葉組織，于-80℃超低溫冰箱保存，用于SHMT 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。一個(gè)月齡的毛果楊無(wú)菌組培幼苗用于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛果楊SHMT家族成員識(shí)別

1.2.2 植物總RNA 分離、總cDNA 合成和基因組DNA提取

各組織總RNA 提取參照pBIOZOL（Bioflux 公司）試劑盒說(shuō)明書(shū)，cDNA 合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser（Takara 公司）試劑盒，植物基因組DNA提取采用一步法植物基因組DNA快速提取試劑盒（Bioteke公司），操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 PtrSHMT基因eFP表達(dá)熱圖、在Aspwood轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)和定量PCR

從楊樹(shù)eFP 數(shù)據(jù)庫(kù)［18］下載到7 個(gè)PtrSHMT 基因表達(dá)數(shù)據(jù)，使用MeV 軟件繪制多個(gè)組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平熱圖。通過(guò)楊樹(shù)Aspwood 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//aspwood.popgenie.org）［19］檢測(cè)PtrSHMT9 基因在木材形成中的表達(dá)水平。

以毛果楊各組織及莖節(jié)cDNA 為模板，定量PCR 反應(yīng)體系20 μL：SYBR Primix Ex TaqTM（2×）10μL，引 物 各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95℃30 s，95℃5 s→60℃34 s（40個(gè)循環(huán)）。每個(gè)樣品均3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法對(duì)基因相對(duì)定量分析。

1.2.4 植物基因編輯載體構(gòu)建

以稀釋100 倍的PCBC-DT1T2 質(zhì)粒為模板，DT1-BsF、DT2-BsR、DT1-F0 和DT2-R0 為引物，用高保真DNA 聚合酶KOD-plus 擴(kuò)增PtrSHMT9 靶位點(diǎn)序列的gRNA 片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，膠內(nèi)的目標(biāo)DNA 片段被回收，經(jīng)BsaⅠ酶切和T4 DNA 連接酶連接到pHSE401 植物基因編輯載體［20］。轉(zhuǎn)入DH5α 大腸桿菌，經(jīng)Kana 抗性篩選陽(yáng)性pHSE401-gRNA 質(zhì)粒的菌液，DNA 測(cè)序確認(rèn)重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌，用于毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用引物及序列參見(jiàn)表1。

1.2.5 毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

由暖暖高級(jí)中學(xué)圖書(shū)館成功舉辦“我讀·故我在—我是元?dú)馔酢敝黝}巡回書(shū)展系列活動(dòng)的例子可知，倘若學(xué)校沒(méi)有充足的經(jīng)費(fèi)購(gòu)置情緒療愈素材時(shí)，可參考此系列活動(dòng)內(nèi)容的籌劃與實(shí)踐過(guò)程，由某校發(fā)起，借由巡回書(shū)展的方式，推廣情緒療愈素材，呼應(yīng)當(dāng)代共享經(jīng)濟(jì)（sharing economy）的潮流，讓鄰近學(xué)校的學(xué)生皆能擁有資源共享的機(jī)會(huì)，進(jìn)而接觸書(shū)展中展示的情緒療愈繪本、小說(shuō)及傳記等圖書(shū)信息資源，以讓因遭逢挫折而處于情緒低潮的學(xué)生，可通過(guò)療愈閱讀的方式，舒緩個(gè)人的負(fù)面情緒，進(jìn)而找到重新出發(fā)的力量。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化［21］，選取30 d 左右毛果楊無(wú)菌組培幼苗用于轉(zhuǎn)化。取抗性植株的少量葉片，提取基因組DNA，作為模板分別用DT1-F0/DT2-R0 及zCas-U/D 引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定其是否轉(zhuǎn)入gRNA和Cas9基因。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)PtrSHMT9 基因靶位點(diǎn)編輯鑒定

取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA 為模板，以PtrSHMT9-U/D 為引物（見(jiàn)表1），進(jìn)行覆蓋靶位點(diǎn)片段的PCR 擴(kuò)增鑒定。片段膠回收后連接到pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)入DH5α 大腸桿菌，Amp 抗性篩選獲得陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與野生型PtrSHMT9進(jìn)行比對(duì)，對(duì)位點(diǎn)編輯情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)SHMT基因家族識(shí)別

從毛果楊基因組上我們識(shí)別出9 個(gè)PtrSHMT基因（見(jiàn)表2），命名為PtrSHMT1～PtrSHMT9。9 個(gè)成員均具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域，且磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)位于該功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)。對(duì)毛果楊、擬南芥和水稻SHMT 家族所有成員構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示21 個(gè)SHMT 聚成2 個(gè)亞類(lèi)（見(jiàn)圖1A），PtrSHMT1/2/3/5/9、AtSHM4/5/6/7 和OsSHMT2/3/4/5 聚為一類(lèi)，則PtrSHMT4/6/7/8、AtSHM1/2/3 和OsSHMT1 聚成另一類(lèi)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示（圖1B），進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)一族的PtrSHMT1/2/3/5/9 具有3個(gè)內(nèi)含子和4 個(gè)外顯子，另一族PtrSHMT4/6/7/8 分別有12～15個(gè)外顯子。

表1 所用引物及序列Table1 Primer sequences used in this study

表2 毛果楊SHMT基因家族Table 2 SHMT gene family in Populus trichocarpa

2.2 PtrSHMT基因家族表達(dá)分析

楊樹(shù)eFP 數(shù)據(jù)顯示，7 個(gè)PtrSHMT 基因在多個(gè)組織內(nèi)有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，PtrSHMT2/5沒(méi)有表達(dá)數(shù)據(jù)（見(jiàn)圖2A）。PtrSHMT7在幼葉、老葉中表達(dá)量很高，而PtrSHMT9 表達(dá)量在木質(zhì)部?jī)?nèi)呈現(xiàn)高豐度，表明PtrSHMT9 可能參與莖組織生長(zhǎng)發(fā)育。進(jìn)一步定量PCR 結(jié)果顯示，PtrSHMT9 在木質(zhì)部、韌皮部高豐度表達(dá)，在其他組織內(nèi)幾乎檢測(cè)不到（見(jiàn)圖2B）。接著，我們分析了PtrSHMT9 在木材形成中的表達(dá)情況，Aspwood檢測(cè)顯示在莖木質(zhì)組織次生壁加厚和木質(zhì)部成熟前期階段PtrSHMT9 呈現(xiàn)高豐度表達(dá)水平（見(jiàn)圖2C）。

2.3 pHSE401-PtrSHMT9基因編輯載體構(gòu)建

基于PtrSHMT9 特異性、高豐度地在莖木質(zhì)組織內(nèi)表達(dá)，我們制備其Cas9/gRNA 編輯突變體。為此，設(shè)計(jì)PtrSHMT9 基因編輯靶位點(diǎn)（見(jiàn)圖3A），構(gòu)建pHSE401-PtrSHMT9 基因編輯載體（見(jiàn)圖3B）。PCR擴(kuò)增含PtrSHMT9靶位點(diǎn)gRNA片段（見(jiàn)圖3C），PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，目標(biāo)DNA 片段從膠內(nèi)回收后酶切、連接到pHSE401 植物基因編輯載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后PCR 鑒定選出陽(yáng)性菌落（見(jiàn)圖3D），提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101 農(nóng)桿菌，備用于毛果楊轉(zhuǎn)基因。

2.4 pHSE401-PtrSHMT9 遺傳轉(zhuǎn)化毛果楊及其分子鑒定

把約30 d 組培幼苗第2～4 莖節(jié)的莖段切成1 cm，農(nóng)桿菌侵染、暗培養(yǎng)48 h，脫菌后產(chǎn)生抗性愈傷、分化芽，在抗性芽生根后盆栽到溫室。累計(jì)得到6 棵抗性轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)顯示：均擴(kuò)增出Cas9 和gRNA 這2 個(gè)目標(biāo)基因片段，且野生型未擴(kuò)增出（見(jiàn)圖5），表明這兩個(gè)基因已轉(zhuǎn)入到毛果楊基因組上。

2.5 PtrSHMT9基因位點(diǎn)編輯突變分析

用PtrSHMT9 基因靶位點(diǎn)兩側(cè)引物PCR 擴(kuò)增、片段DNA 測(cè)序顯示位點(diǎn)編輯如圖6A 所示，4 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系PtrSHMT9 基因靶位點(diǎn)被編輯，L5、L6 株系無(wú)編輯。L3株系為純合編輯，L1/2、L4是兩種編輯情況的雙等位編輯。PtrSHMT9 基因編輯突變后推測(cè)其氨基酸結(jié)果如圖6B 所示，因編輯產(chǎn)生的移碼突變使得PtrSHMT9 基因終止子密碼子提前產(chǎn)生，形成了ptrshmt9敲除突變體。

圖1 PtrSHMT家族基因結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化樹(shù)A.PtrSHMT基因家族進(jìn)化樹(shù)；B.PtrSHMT基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure and phylogenetic tree of PtrSHMT gene familyA.Phylogenetic tree of PtrSHMT gene family；B.PtrSHMT gene extron and intron structures

圖2 PtrSHMT基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析A.PtrSHMTs電子表達(dá)數(shù)據(jù)；B. 定量PCR分析PtrSHMT9在不同組織內(nèi)的相對(duì)表達(dá)水平；C.Aspwood轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)PtrSHMT9表達(dá)水平Fig.2 Analysis of transcript expression level of PtrSHMT geneA.Electronic expression data of PtrSHMTs；B.Quantitative PCR analysis of relative expression level of PtrSHMT9 in different tissues；C.Aspwood detected the expression level of PtrSHMT9

圖3 pHSE401-PtrSHMT9基因編輯載體構(gòu)建A.PtrSHMT9 基因編輯靶位點(diǎn)；B.pHSE401 基因編輯載體圖；C.PCR 擴(kuò)增含PtrSHMT9靶位點(diǎn)gRNA；D.pHSE401-PtrSHMT9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定Fig.3 Construction of pHSE401-PtrSHMT9 editing vectorA. The target site of PtrSHMT9；B. Gene editing of pHSE401；C. PCR amplification of gRNA containing PtrSHMT9 target site；D. PCR identification of pHSE401-PtrSHMT9

圖4 pHSE401-PtrSHMT9轉(zhuǎn)化毛果楊A(yù). 待轉(zhuǎn)化幼苗；B. 侵染；C. 暗培養(yǎng)；D. 抗性篩選；E. 誘導(dǎo)抗性芽；F. 生根和盆栽Fig.4 Transformation of P.trichocarpa with pHSE401-PtrSHMT9A.Seedlings to be transformed；B.Infestation；C.Dark culture；D.Resistance selection；E.Resistant shoots；F.rooting and potting

圖5 PpHSE401-PtrSHMT9轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)分子鑒定L1～6.6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系；WT. 野生型Fig.5 Molecular identification of transgenic P.trichocarpa with pHSE401-PtrSHMT9L1-6.Six independent transgenic lines；WT.Wild type

圖6 PtrSHMT9基因編輯及突變分析A. 轉(zhuǎn)基因株系PtrSHMT9基因編輯情況；B.PtrSHMT9編輯突變后推測(cè)氨基酸Fig.6 PtrSHMT9 gene editing and mutation analysisA.PtrSHMT9 gene editing in transgenic plants；B.Amino acids are deduced from the edited PtrSHMT9

3 討論

植物的SHMT 是一個(gè)小基因家族，擬南芥、水稻SHMT 分別有7 個(gè)和5 個(gè)成員［5，13］。我們從毛果楊中識(shí)別出9 個(gè)SHMT 基因，與單子葉水稻相比其成員數(shù)量明顯增多。擬南芥、水稻和毛果楊SHMT所有成員進(jìn)化樹(shù)聚成2 個(gè)簇，PtrSHMT1/2/3/5/9 聚成一簇，PtrSHMT4/6/7/8聚成另一簇。從基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)看，PtrSHMT1/2/3/5/9 這5 個(gè)基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相同，PtrSHMT4/6/7/8 這4 個(gè)基因結(jié)構(gòu)也類(lèi)似。PtrSHMT 基因家族的進(jìn)化分析結(jié)果和基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表現(xiàn)一致。

基因表達(dá)的模式常暗示其功能。基于楊樹(shù)eFP轉(zhuǎn)錄表達(dá)電子數(shù)據(jù)庫(kù)［18］和定量PCR檢測(cè)，鑒定出PtrSHMT9在木質(zhì)部組織高豐度表達(dá)，PtrSHMT9可能作用于莖的生長(zhǎng)發(fā)育。Aspwood 是一個(gè)木材形成的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)［19］，檢索結(jié)果顯示PtrSHMT9 表達(dá)在莖木質(zhì)組織次生壁加厚階段呈現(xiàn)高豐度水平。樹(shù)木有著巨大的、累積的次生木質(zhì)化組織，木質(zhì)素、細(xì)胞壁多糖是其主要次生代謝物。一碳代謝物除了參與初級(jí)代謝，還供給次級(jí)代謝途徑，植物木質(zhì)化是一碳密集的代謝途徑之一［22～23］。樹(shù)木SHMTs 與甘氨酸脫羧酶形成復(fù)合體進(jìn)行甘氨酸—絲氨酸轉(zhuǎn)換，形成的一碳供給非光合組織合成多種次級(jí)代謝物［15］。木質(zhì)部高豐度、特異表達(dá)的PtrSHMT9 很可能作用楊樹(shù)次生壁合成，參與木材的形成。

然而，遺傳證據(jù)能準(zhǔn)確地顯示PtrSHMT9 基因功能。Cas9/gRNA 基因編輯技術(shù)在擬南芥、玉米、水稻等物種上廣泛應(yīng)用，獲得遺傳突變體用于功能鑒定［24～25］。在這次研究中我們構(gòu)建了PtrSHMT9基因Cas9/gRNA 編輯載體，結(jié)合毛果楊轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PtrSHMT9 基因編輯突變，獲得4 個(gè)不同株系的毛果楊ptrshmt9敲除突變體。接下來(lái)，我們將分析ptrshmt9 突變體表型，聚焦PtrSHMT9 敲除對(duì)次生壁結(jié)構(gòu)和木材組分的影響，鑒定PtrSHMT9基因在木材形成上的功能，理解樹(shù)木SHMTs 參與的次級(jí)代謝途徑及作用方式。