轉(zhuǎn)基因金葉銀中楊葉色及生長變異分析

李藝迪 顧宸瑞 冮慧欣 劉桂豐 陳 肅 姜 靜

（林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

GLK 轉(zhuǎn)錄因子又稱為Golden2-Like 和G2-Like，是Myb 類轉(zhuǎn)錄因子中的GARP 家族成員［1］，其功能主要調(diào)控植物葉綠體發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)，同時(shí)也參與植物生物脅迫、植物衰老和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［2～6］。研究證明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的2 條GLK 功能冗余，雙突變體Atglk1、Atglk2葉色表現(xiàn)出淡綠色表型［7］。在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlGLK1 和SlGLK2 的過量表達(dá)使番茄未成熟果實(shí)更加深綠色，同時(shí)促進(jìn)果實(shí)均勻成熟、進(jìn)而改善成熟果實(shí)的品質(zhì)［3～4］。在C4 植物玉米（Zea mays L.）和高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）中，GLK1 和GLK2 分別在葉鞘（BS）和葉肉（M）細(xì)胞中表達(dá)［8］。然而，C4 植物白菜花（Cleome gynandra）中，CgGLK1 和CgGLK2 均在葉鞘和葉肉細(xì)胞中表達(dá)，并且在葉肉細(xì)胞中表達(dá)量更高［9］。水稻（Oryza sativa）的OsGLK1 參與調(diào)控葉綠體發(fā)育，并且Os-GLK1 在Chl 的生物合成中發(fā)揮重要作用［10］。對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，AtGLK也參與病原微生物的防御作用，例如，該基因的過量表達(dá)AtGLK1OX株系對(duì)禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、葡萄孢菌（Botrytis cinerea）抗性顯著高于野生型擬南芥［11～13］。在林木中有關(guān)GLK 基因的研究鮮有報(bào)道，對(duì)白樺（Betula platyphylla Suk.）研究發(fā)現(xiàn)，其基因組中僅有1 個(gè)BpGLK1 成員，該基因的缺失突變及干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺均表現(xiàn)葉片葉綠素含量降低，葉片呈現(xiàn)黃色［14～15］。

隨著城市的發(fā)展，人們對(duì)葉色艷麗的高大喬木需求越來越大，采用基因工程技術(shù)改變植物葉色是快速創(chuàng)制植物新品種的有效途徑，例如，過表達(dá)PdMYB118 的轉(zhuǎn)基因山新楊（P.davidiana×P.bolleana）在葉片中產(chǎn)生非常多的花色苷，并且在溫室和田間生長時(shí)將其顏色變成紅色［16］。過表達(dá)PtrMYB119 毛果楊（Populus trichocarpa）花青素水平顯著提高，葉色呈現(xiàn)紅色［17］。上述MYB 基因在彩色樹種選育中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。除此之外，MdMYB10 過表達(dá)蘋果（Malus domestica）中，花青素水平升高，色素沉著，形成紅色果實(shí)［18］。轉(zhuǎn)基因煙草中SoCHS1 的過表達(dá)將花色由淺粉紅色變?yōu)榉奂t色［19］。

銀中楊（Populus alba×P.berolinensis）樹皮灰綠色，樹冠呈圓錐形，樹姿優(yōu)美，葉片較大，葉面深綠色，葉背面銀白色，密生絨毛，在城市園林綠化中廣泛應(yīng)用［20］。筆者所在團(tuán)隊(duì)根據(jù)白樺BpGLK1 研究思路，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法獲得了PaGLK基因過表達(dá)及抑制表達(dá)銀中楊，其中獲得的3 個(gè)PaGLK 抑制表達(dá)銀中楊葉色也為金黃色，但是亮度及黃色程度不盡相同。為了解轉(zhuǎn)PaGLK 基因銀中楊葉色的變異規(guī)律，以及葉色黃化對(duì)轉(zhuǎn)基因銀中楊生長是否產(chǎn)生影響，試驗(yàn)以PaGLK 過表達(dá)、PaGLK 抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系為材料，分析葉綠素相對(duì)含量與葉色的時(shí)序變異規(guī)律，探討葉綠素含量的降低對(duì)株高生長的影響。研究結(jié)果為后續(xù)轉(zhuǎn)基因銀中楊在城市園林綠化中推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)PaGLK 基因銀中楊：PaGLK 過表達(dá)株系（G1、G2、G3）；PaGLK 抑制表達(dá)株系（Y1、Y2、Y3）均由研究團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因銀中楊分子檢測(cè)

分別提取PaGLK 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因銀中楊（G1-G3）葉片DNA 為模板，以pCAMBIA1300-PaGLKGFP 質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因銀中楊（WT）的總DNA 為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)水為陰性對(duì)照，引物PaGLK-F，PaGLK-R（見表1），PCR 反應(yīng)體系按相關(guān)文獻(xiàn)［21］，反應(yīng)結(jié)束后，吸取2μL 進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察目的條帶的位置。

分別提取PaGLK 抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因銀中楊（Y1-Y3）葉片DNA 為模板，以pFGC5941-CIS-F 和pFGC5941-Cis-R，pFGC5941_Anti_F 和pFGC5941-Anti-R 作為引物（見表1）進(jìn)行PCR 檢測(cè)。以pFGC5941-PaGLK 質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因銀中楊（WT）的總DNA為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)水為陰性對(duì)照，PCR 反應(yīng)體系按相關(guān)文獻(xiàn)［21］，反應(yīng)結(jié)束后，吸取2 μL 進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察目的條帶的位置。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

qRT-PCR 檢測(cè)：分別提取參試株系總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其稀釋10 倍后用于定量qRTPCR 的模板，以18S rRNA 為內(nèi)參基因（見表2），進(jìn)行對(duì)PaGLK 基因的qRT-PCR 分析，qRT-PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序［15］。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 轉(zhuǎn)基因銀中楊苗木擴(kuò)繁及葉色調(diào)查

采用組培微繁技術(shù)分別擴(kuò)繁野生型銀中楊（WT）及各轉(zhuǎn)基因株系，4月中旬移栽至育苗盤中，置于溫室中常規(guī)管理，5月中旬初選取高度一致的苗木，移栽至18 cm×13 cm 花盆中，每個(gè)株系共30株，分3次重復(fù)，7個(gè)株系，共計(jì)210盆苗木，放置在塑料大棚中進(jìn)行常規(guī)水肥管理。

RHS 比色：將葉片近軸面與RHS 標(biāo)準(zhǔn)比色卡（英國皇家園藝學(xué)會(huì)，2015）進(jìn)行對(duì)比，記錄葉片的顏色。

色差儀比色：于2019 年5 月15 日開始至9 月15 日結(jié)束，每隔15 d 分別對(duì)參試株系測(cè)定1 次，共計(jì)9次。采用分光色差儀（CR-400，Japan）測(cè)定第4葉的葉色參數(shù)，測(cè)量結(jié)果用CIELab 表色系統(tǒng)進(jìn)行色度分析［22］。

1.2.3 葉片葉綠素相對(duì)含量測(cè)定

采用便攜式葉綠素測(cè)定儀（SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA）測(cè)定轉(zhuǎn)基因及WT 株系功能葉的葉綠素相對(duì)含量，讀取SPAD 值，測(cè)定于5 月15 日開始，9 月15 日結(jié)束，每15 天測(cè)定1 次，每次每個(gè)株系測(cè)定10株樹葉片，3次重復(fù)。

1.2.4 生長性狀調(diào)查

于2019 年5 月中旬開始調(diào)查其生長等性狀，每15天測(cè)量1次，直至該年9月份整個(gè)植物生長周期測(cè)量結(jié)束。

數(shù)據(jù)利用MATLAB Compiler Runtime 8.3對(duì)苗高的生長規(guī)律進(jìn)行Logistic方程擬合，Logistic曲線方程：

式中：y 為苗木苗高（cm）；t 為苗木生長的時(shí)間，1 月1 日為1（d）；a 為苗木開始生長時(shí)的苗高初始值（cm）；b 為苗木停止生長時(shí)苗高值（cm）；t0為苗木苗高日生長速度最快的日期（d）；c 為曲線在苗木苗高日生長速度最快處的斜率（cm·d-1）。

在符合“S”型曲線的林木個(gè)體生長過程中，速生期是林木生長的關(guān)鍵階段，通過擬合方程得出速生期參數(shù)：

速生期的起始點(diǎn)t1；

速生期的結(jié)束點(diǎn)t2；

速生點(diǎn)t0；

速生期的持續(xù)時(shí)間RR=t2-t1；

速生期苗高的平均生長量GR=t2點(diǎn)的苗高-t1點(diǎn)的苗高；

速生期內(nèi)苗高日生長量的平均值GD=GR/RR；

速生期內(nèi)生長量占總生長量的比值RRA=GR/b-a。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因株系的分子檢測(cè)

分別以銀中楊PaGLK 過表達(dá)株系的葉片總DNA 為模板，結(jié)果顯示：陽性質(zhì)粒及3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在1 200 bp 處擴(kuò)增出單一譜帶，與PaGLK 序列堿基長度吻合（1 269 bp），而WT 株系無擴(kuò)增譜帶（圖1）。

圖1 PaGLK過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系PCR擴(kuò)增電泳圖譜M.DNA Maker DL2000；1. 陽性質(zhì)粒；2. 陰性對(duì)照（水）；3.WT株系；4～6.G1-G3株系Fig. 1 PaGLK overexpression transgenic lines PCR electrophoresis patternM.Marker DL2000；1.Positive plasmid；2.Negative control（ddH2O）；3.WT line；4-6.G1-G3 line

分別以銀中楊PaGLK 抑制表達(dá)株系的葉片總DNA 為模板，結(jié)果顯示：3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系正向和反向均有擴(kuò)增譜帶，且與預(yù)期的200 bp 長度吻合（圖2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明目標(biāo)基因已經(jīng)整合到銀中楊基因組中。

圖2 PaGLK抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系PCR擴(kuò)增電泳圖譜A.PaGLK抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系正向PCR；B.PaGLK抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系反向PCR M.DNA Maker DL2000；1. 陽性質(zhì)粒；2. 陰性對(duì)照（水）；3.WT株系；4～10. 轉(zhuǎn)PaGLK基因抑制表達(dá)株系Y1～Y3Fig.2 PaGLK repression transgenic lines PCR electrophoresis patternA.PCR of forward fragment in PaGLK repression transgenic lines；B.PCR of reverse fragment in PaGLK repression transgenic lines M.DNA Maker DL2000；1.Positive plasmid；2.Negative contro（lddH2O）；3.WT line；4-6.Y1-Y3 line

進(jìn)而對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因銀中楊進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)（見圖3），結(jié)果顯示G1、G2、G3 過表達(dá)株系中PaGLK 基因表達(dá)量顯著高于WT 株系，分別是WT株系的6.7、3.7、3.8倍，而Y1、Y2、Y3抑制表達(dá)株系中PaGLK 基因則顯著下調(diào)表達(dá)，較WT 株系低65.3%、68.7%、73.70%。進(jìn)一步證明PaGLK 基因已經(jīng)整合到銀中楊基因組中。

將銀中楊PaGLK 與白樺BpGLK1 序列利用BioEdit軟件進(jìn)行多序列比較，比較結(jié)果（見圖4）。

2.2 轉(zhuǎn)基因銀中楊的葉色變異

CIELab 表色系統(tǒng)中L*值是衡量葉色明暗程度的指標(biāo)，該值越大則葉片亮度越高，b*值表示葉片的藍(lán)黃屬性，b*值由大變小，則表示藍(lán)色減退黃色增加［22］。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)定量分析注：不同小寫字母表示P＜0.05顯著水平Fig.3 RelativequantitativeanalysisofthetransgeniclinestNote：Different lowercase letter represents the significance difference P＜0.05

圖4 銀中楊PaGLK與白樺BpGLK1序列的多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of PaGLK and BpGLK1 in birch

對(duì)不同發(fā)育期各參試株系的葉色參數(shù)L*值分析，結(jié)果表明，PaGLK 過表達(dá)株系中的G1 株系在整個(gè)發(fā)育階段都顯著低于WT 株系，而G2、G3 株系的L*值僅在8 月1 日、8 月15 日顯著低于WT 株系，其他發(fā)育階段與WT 株系差異不顯著（見圖5）。參試株系的3 個(gè)抑制表達(dá)株系從6 月初開始到9 月中旬其L*值持續(xù)高于WT 株系，并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。說明，銀中楊PaGLK 基因的低量表達(dá)使葉片的亮度其他株系。各株系的葉色參數(shù)L*值時(shí)序變化均在7月15日該值最大，此時(shí)3個(gè)抑制表達(dá)株系的L*值均顯著高于WT及過表達(dá)株系，其均值較WT 株系均值高15.4%、較3 個(gè)過表達(dá)株系均值高19.9%。

不同發(fā)育期各參試株系b*值測(cè)定，結(jié)果表明，G1過表達(dá)株系的b*值在整個(gè)發(fā)育階段都顯著低于WT株系，而G2、G3株系在5月15日到7月15日之間其葉片b*值與WT 株系差異不顯著，從8 月開始直到調(diào)查結(jié)束，b*值一直低于WT 株系，并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（見圖5）。抑制表達(dá)株系從7 月中旬到9 月中旬這期間的b*值一直顯著高于WT株系，并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。在6 月15 日的b*值低于其他時(shí)期，并且抑制表達(dá)株系的b*值與對(duì)照株系差異不顯著。隨著參試株系的生長7 月15日到9月15日之間，3株抑制表達(dá)株系的b*值均顯著高于WT株系。

RHS 比色卡測(cè)定結(jié)果顯示（見表3），WT 株系始終呈現(xiàn)中等黃綠色，抑制表達(dá)株系的葉色始終呈現(xiàn)深黃綠色（RHS2015 144B），而過表達(dá)株系的葉色在7月中旬為中等橄欖綠色和深黃綠色，隨后漸漸的變?yōu)闇\橄欖綠。

圖5 參試株系葉片L*值、b*值時(shí)序變化注：a、b、c、d為同一時(shí)間點(diǎn)參試株系L*值、b*值的多重比較Fig.5 Temporary variation of test lines about value b and value LNote：a，b，c and d in figures indicate the multiple comparisons between test lines about value b*and value L*in the same time

圖6 參試株系的葉色觀察和葉綠素相對(duì)含量（SPAD）時(shí)序變異注：a、b、c、d為同一時(shí)間點(diǎn)參試株系SPAD值的多重比較Fig.6 Observation of leaf color and temporal variation of relative chlorophyll conten（tSPAD）in the test linesNote：a，b，c and d in figures indicate the multiple comparisons between test lines about SPAD value in the same time

2.3 轉(zhuǎn)基因銀中楊葉綠素含量分析

轉(zhuǎn)基因銀中楊葉的葉色不同于WT 株系（圖6），對(duì)不同發(fā)育期的各參試株系進(jìn)行SPAD 的測(cè)定，結(jié)果表明（見圖6），參試株系在整個(gè)生長過程中，過表達(dá)株系G1 的SPAD 始終顯著高于對(duì)照株系，G2、G3 在8 月1 日到9 月1 日始終高于WT 株系，并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）抑制表達(dá)株系的SPAD 在6 月1 日到9 月15 日 都顯著低于WT 株系和過表達(dá)株系，其中在9 月15 日的SPAD 是最低的，其均值低于WT 株系的42.7%，低于過表達(dá)株系SPAD均值的52%。

2.4 轉(zhuǎn)基因銀中楊的生長特性分析

2.4.1 轉(zhuǎn)基因銀中楊苗高生長模型的建立與擬合

分別對(duì)轉(zhuǎn)基因株系苗高生長過程進(jìn)行擬合（見圖7）轉(zhuǎn)基因及WT 株系苗高生長過程為“S”型曲線，用四參數(shù)Logistic 方程式分別對(duì)轉(zhuǎn)基因及對(duì)照銀中楊苗高的平均值進(jìn)行擬合，并繪制出“S”形生長曲線（見圖7）。各生長模型方程的擬合系數(shù)均高于0.99，達(dá)到顯著水平，說明用四參數(shù)Logistic曲線方程對(duì)轉(zhuǎn)基因及WT 株系生長節(jié)律進(jìn)行擬合是準(zhǔn)確可靠的，可用于轉(zhuǎn)基因及WT株系高生長分析與預(yù)測(cè)。

表3 參試株系的葉色時(shí)序變化Table3 Time series of leaf color of the tested plants

表4 轉(zhuǎn)基因銀中楊苗高的Logistic模型Table 4 Logistic model of poplar seedling height in transgenic silver

圖7 轉(zhuǎn)基因株系樹高邏輯斯蒂擬合曲線Fig.7 Logistic fit curve of tree height of transgenic lines

表5 轉(zhuǎn)基因株系速生期生長參數(shù)比較Table 5 Comparison of growth parameters of transgenic strains in the fast growing period

由表4 可知，過表達(dá)株系與WT 株系的苗高生長（即停止生長后的實(shí)測(cè)值）差異顯著（P＜0.05），過表達(dá)株系當(dāng)年高生長顯著低于WT株系，其苗高均值低于WT 株系的18.22%，其中G3 苗高速生點(diǎn)最高，為1.793 cm·d-1，低于WT 株系。抑制表達(dá)株系停止生長后的苗高與WT株系差異不顯著，其中Y2的苗高速生點(diǎn)最高，為2.235 cm·d-1。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因銀中楊速生期生長參數(shù)變異

轉(zhuǎn)基因銀中楊苗高從5 月中旬開始生長，9 月中旬封頂，生長期約為120 d。轉(zhuǎn)基因株系與WT株系從開始生長、到進(jìn)入速生期以及速生期結(jié)束的時(shí)間基本一致。由表5可知，過表達(dá)株系在速生期內(nèi)苗高的平均生長量（GR）低于對(duì)照株系，其速生期內(nèi)苗高日生長量均值（GD）也低于WT 株系，其均值為WT 株系的22.19%。然而抑制表達(dá)株系中的Y2 速生期內(nèi)苗高日生長量均值（GD）高于WT 株系，另外兩個(gè)株系速生期內(nèi)苗高日生長量（GD）沒有高于WT 株系，但是速生期的持續(xù)時(shí)間長于WT株系，因此導(dǎo)致最終停止生長時(shí)的高生長與WT差異不顯著。

3 討論

銀中楊是銀白楊與中東楊雜交選育出的三倍體雄性無性系，該無性系不僅具有樹干通直，樹皮灰綠、樹姿優(yōu)美的特點(diǎn)，還具有雄性敗育、無散粉的特點(diǎn)，在城市園林綠化中深受人們青睞［20］。以其為受體獲得的轉(zhuǎn)基因金葉銀中楊，可以免去外源基因通過花粉向非轉(zhuǎn)基因品種或野生近緣物種漂移給人們帶來的后顧之憂，可以說通過基因工程技術(shù)創(chuàng)制的金葉銀中楊在城市園林綠化中發(fā)展前景廣闊。

Golden2-like（GLK）基因家族的成員可以協(xié)調(diào)光合作用的表達(dá)并控制不同植物物種中葉綠體的發(fā)育［7，23～26］。根據(jù)報(bào)道，擬南芥和苔蘚中，GLK1 和GLK2 同時(shí)缺失的突變體的葉片表現(xiàn)為葉綠素含量降低，葉片變黃。番茄中SlGLK1 的缺失也能引起葉片顏色變淺［3，7］。研究證明，白樺BpGLK1 抑制表達(dá)株系的葉綠素含量明顯降低，葉片呈現(xiàn)深黃綠色，過表達(dá)株系的葉綠素含量比對(duì)照高［15］，植物葉色變異也往往與葉綠體中的色素含量的變化有關(guān)［27～28］，本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)PaGLK 銀中楊苗期試驗(yàn)顯示，過表達(dá)株系葉色為綠色，9 月時(shí)葉色為中等橄欖綠色，株高生長較WT 緩慢；而3 個(gè)抑制表達(dá)株系的葉色參數(shù)代表葉片亮度的L*值均顯著高于WT 株系，尤其是Y1 和Y3 株系葉片亮度更高，代表葉片黃色的b*值也顯著高于WT 株系，在整個(gè)生長季，Y1和Y3株系一直保持鮮艷的黃色。從葉片亮度及色彩方面分析，3 個(gè)抑制表達(dá)株系中Y1 和Y3 株系更鮮艷，應(yīng)用推廣潛力更大，后續(xù)還需繼續(xù)追蹤調(diào)查。

光合作用可以為植物提供能量，從而促進(jìn)植物生長。葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)最重要、最普遍的質(zhì)體，它是進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所。所以，葉綠體的發(fā)育與植物生長發(fā)育有密切的關(guān)系。在水稻低葉綠素突變體中發(fā)現(xiàn)，雖然葉綠素含量降低，但是葉綠體的發(fā)育沒有受到影響，在高光照條件下具有較高的光合速率［29］。適當(dāng)降低葉綠素含量，不僅有利于減少光抑制，而且還有利于氮素在光合系統(tǒng)內(nèi)的分配，從而提高光合氮素利用效率［30～31］。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)PaGLK 銀中楊苗期試驗(yàn)顯示，PaGLK 抑制表達(dá)并未影響銀中楊苗期株高生長，移栽當(dāng)年停止生長時(shí)抑制表達(dá)株高均值為132.58 cm，與WT 株系差異不顯著，但是，PaGLK過表達(dá)株系的株高卻顯著低于WT株系，可能葉綠素含量顯著增高，葉片吸收了過量的光能，導(dǎo)致光抑制現(xiàn)象所致?？傊?，光合作用是一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)總和，僅維持葉片高葉綠素含量并不是提高有效光合速率的必要條件［32］。研究表明，在擬南芥和白樺的研究中，GLK 主要通過調(diào)控捕光天線蛋白、光系統(tǒng)復(fù)合體蛋白以及葉綠素合成等相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物的光合色素的合成及葉綠體的發(fā)育［14～15，23］，GLK 基因的缺失及抑制表達(dá)均可使植物葉片褪綠黃化，并且該性狀在大田中穩(wěn)定表現(xiàn)［14～15，22］。因此，在其他植物中GLK 基因可以作為黃色彩葉樹育種的候選基因。