柴胡加龍骨牡蠣湯對急性心肌梗死合并焦慮小鼠血清ACTH及CORT的影響

杜泓森　史金玉　王帥　安瑩　靳會會　賈靜蕓　趙海濱

摘要 目的：觀察柴胡加龍骨牡蠣湯對AMI合并焦慮小鼠血清ACTH及CORT的影響。方法：將30只小鼠隨機分為假手術(shù)組、AMI組、焦慮組、AMI+焦慮組、中藥組，每組6只，以冠脈結(jié)扎法合并空瓶刺激法制作復(fù)合模型，予柴胡加龍骨牡蠣湯干預(yù)14 d。造模結(jié)束后，予行為學(xué)及心臟彩超檢測，后處死取各組血清檢測ACTH及CORT含量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，AMI組小鼠LVEF和LVFS明顯降低，LVEDd及LVESd值明顯增加;AMI組及焦慮組小鼠水平和垂直運動得分均降低，開放臂進入次數(shù)和停留時間均減少;焦慮組ACTH和CORT含量增加;AMI組僅ACTH含量增多。與AMI+焦慮組比較，AMI組、焦慮組及中藥組的LVEF、LVFS升高，LVEDd值明顯較低;水平和垂直運動得分均升高;血清ACTH和CORT含量均降低。LVESd值僅AMI組及焦慮組降低;AMI組及中藥組的OE%增加、OT%延長，焦慮組僅OT%延長。結(jié)論：柴胡加龍骨牡蠣湯抗焦慮、改善AMI預(yù)后的療效機制可能與抑制ACTH和CORT含量的升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞 柴胡加龍骨牡蠣湯;AMI合并焦慮;小鼠;血清;療效;機制;ACTH;CORT

Abstract Objective：To observe effects of Chaihu Plus Longgu Muli Decoction on serum ACTH and CORT in mice with acute myocardial infarction（AMI）complicated with anxiety.Methods：Thirty mice were randomly divided into sham operation group， AMI group， anxiety group， AMI+anxiety group and traditional Chinese medicine group（n=6）.The compound model was made through coronary artery ligature combined with empty bottle stimulation and intervened by Chaihu Plus Longgu Muli Decoction for 14 d.After the establishment of the model， behavioral and Echocardiography detection was conducted.After execution， contents of ACTH and CORT in the serum in each group were detected.Results：Compared with the sham operation group， LVEF and LVFS in the AMI group were significantly decreased， while LVEDd and LVESd were significantly increased.Scores of horizontal and vertical movements in the AMI group and the anxiety group were decreased， while open arm entry times and residence time were decreased.The ACTH and CORT contents were increased in the anxiety group， and only the ACTH content was increased in the AMI group.Compared with the AMI+anxiety group， the LVEF and LVFS in the AMI， anxiety and traditional Chinese medicine groups were significantly increased， while the LVEDd values were significantly decreased; the horizontal and vertical movement scores were increased; and the serum ACTH and CORT contents were decreased.The LVESd values were decreased only in the AMI and anxiety groups.OE% was increased and OT% was prolonged in the AMI and traditional Chinese medicine groups， and only OT% was prolonged in the anxiety group.Conclusion：The therapeutic mechanism of Chaihu Plus Longgu Muli Decoction in anti-anxiety and improving the prognosis of AMI may be related to the inhibition of the increase of ACTH and CORT contents.

Keywords Chaihu Plus Longgu Muli Decoction; AMI with anxiety; Mice; Serum; Efficacy; Mechanism; ACTH; CORT

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.02.021

近年來，大量證據(jù)表明急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）與焦慮共病的概率及死亡率正逐步升高。研究發(fā)現(xiàn)，在AMI后3個月內(nèi)，焦慮的發(fā)病率約30%，遠遠高于在普通人中的發(fā)病率（5%～10%）[1]。反過來，焦慮已被確定為冠心病發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素，其發(fā)生心絞痛的概率是非焦慮患者的2倍，發(fā)生不良心血管事件的概率也升高至2～5倍，嚴(yán)重影響AMI的遠期預(yù)后[2-4]。由此可見AMI與焦慮密切相關(guān)，二者相互影響，共同促進疾病的發(fā)生發(fā)展。然而目前冠心病合并焦慮的發(fā)病機制仍不明確，研究表明其可能與下丘腦-垂體-腎上腺素（Hypothalamic Pituitary-adrenal Axis，HPA）軸活性異?？哼M有關(guān)[5]。本團隊前期研究表明，柴胡加龍骨牡蠣湯能有效提高冠心病合并焦慮患者生命質(zhì)量，改善其心絞痛發(fā)作頻率和時間、不良心血管事件發(fā)生率及焦慮情緒[6]。因此，本研究擬通過觀察柴胡加龍骨牡蠣湯對AMI合并焦慮小鼠心功能、焦慮程度，及血清腎上腺皮質(zhì)激素（Adreno Cortico Trophic Hormone，ACTH）和皮質(zhì)醇（Corticosterone，CORT）含量的影響，揭示其改善AMI合并焦慮預(yù)后的部分作用機制，為其在臨床廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，平均體質(zhì)量（23±2）g，由北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2014-0004。喂養(yǎng)環(huán)境清潔，溫度21～24 ℃，相對溫度40%～65%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，12 h/12 h明暗交替。

1.1.2 藥物 柴胡加龍骨牡蠣顆粒，配方：柴胡12 g、龍骨15 g、牡蠣15 g、桂枝9 g、茯苓15 g、黃芩9 g、大黃9 g、半夏9 g、生姜9 g、大棗10 g、黨參9 g、珍珠母（代鉛丹）15 g，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 血清皮質(zhì)酮（CORT）試劑盒（貨號：MU30431），促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）試劑盒（貨號：MU30269）均購于武漢博奧特公司;氣麻機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號：R580S）;高架十字迷宮、曠場裝置：自制。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 AMI模型：采用異氟烷吸入法麻醉小鼠，仰臥位固定，左胸備皮，消毒。在左胸骨旁剪開約1.5 cm長度切口，用鑷子小心鈍性分離肌肉，用止血鉗在3、4肋間隙穿透胸膜，暴露心臟，同時關(guān)閉麻醉機，立即擠出心臟，用6～0絲線在左心耳下緣約2 mm處進針，深度約為1～1.5 mm，從肺動脈左緣出針，見結(jié)扎區(qū)心肌組織變白可視為手術(shù)成功，迅速心臟復(fù)位，同時擠壓胸廓以減輕氣胸，隨后用5～0線縫皮，將其置于電熱毯上，待蘇醒后轉(zhuǎn)移回籠內(nèi)。術(shù)后肌注青霉素40萬U預(yù)防感染。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。焦慮模型：采用不確定空瓶刺激法，造模周期共21 d。第1～7天，每天9：00-9：10、21：00-21：10 2個時間段予飲水;第8～21天，每天上述2個時間段內(nèi)分別隨機給予空瓶或喂水。造模期間小鼠自由飲食。AMI+焦慮模型：在焦慮造模第15天對小鼠進行AMI手術(shù)，之后繼續(xù)空瓶刺激。采用隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組、AMI組、焦慮組、AMI+焦慮組、中藥組，每組6只。

1.2.2 給藥方法 課題組前期實驗證明按臨床劑量6倍折算為動物藥效最佳濃度。據(jù)此將每劑中藥顆粒用蒸餾水配置為100 mL，混勻，予中藥組灌胃（0.1 mL/10 g，折合生藥量13.6 g/kg），其余各組灌胃蒸餾水（0.1 mL/10 g），1次/d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 曠場實驗（Open Field Test，OFT） 實驗裝置為木制箱100 cm×100 cm×40 cm，底板共計25個方格，大小為20 cm×20 cm。開始實驗時，將小鼠置于場箱最中間，觀察其水平運動所跨格子數(shù)及垂直站立次數(shù)，共計5 min：每越過一個格子記1分，每直立1次記1分，計算小鼠的水平和垂直運動得分。每只小鼠測試完后用乙醇擦拭以清除殘留異味，晾干后進行下一只測試。

1.2.3.2 高架十字迷宮實驗（Elevatedplus Maze，EPM） 將小鼠置于中央?yún)^(qū)，面向開放臂放入，記錄5 min內(nèi)的活動情況。觀察指標(biāo)：進入開放臂次數(shù)（Open arm Entry，OE）、進入閉合臂次數(shù)（Close arm Entry，CE）、進入開放臂時間（Open arm Time，OT）和進入閉合臂時間（Close arm Time，CT）。分別計算進入開放臂次數(shù)比OE%=OE/（OE+CE）×100%、OT%=OT/（OT+CT）×100%。同上清潔裝置。

1.2.3.3 心臟超聲檢查 異氟烷吸入性麻醉小鼠，仰臥固定，左胸前備皮，運用Visual Sonices Vevo 2100高分辨小動物超聲系統(tǒng)探測左室短軸切面M型曲線，記錄左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），并計算左室射血分數(shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）。取3個連續(xù)心動周期，計算其平均值。對超聲醫(yī)師施盲，以最大可能獲得客觀真實的數(shù)據(jù)。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa） 麻醉小鼠，固定，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃凍存保存至測定，參照試劑盒說明檢測ACTH、CORT含量。

1.2.3.5 HE及Masson染色 暴露胸腔，在心尖處插入灌流器，剪開右心耳，注入10%中性福爾馬林溶液，灌注成功后摘取心臟，于10%中性福爾馬林溶液中浸泡48 h，脫水、透明、包埋、切片，行HE和Masson染色，觀察梗死邊緣區(qū)組織變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，先進行正態(tài)檢驗。符合正態(tài)且方差齊采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步用LSD檢驗進行兩兩比較，方差不齊，則采用Welch檢驗，并用Games-Howell進行兩兩比較。不符合正態(tài)，采用K個獨立樣本的非參數(shù)檢驗。所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟超聲檢測 與假手術(shù)組比較，AMI組小鼠LVEF和LVFS明顯降低，LVEDd及LVESd值明顯增加;而焦慮組均無明顯變化。與AMI+焦慮組比較，AMI組、焦慮組及中藥組的LVEF、LVFS明顯升高，LVEDd值明顯較低;另AMI組及焦慮組的LVESd值也降低，中藥組則無明顯統(tǒng)計學(xué)變化。見表1、圖1所示。

2.2 行為學(xué)檢測

2.2.1 曠場實驗 與假手術(shù)組比較，AMI組及焦慮組的小鼠水平和垂直運動得分均降低。與AMI+焦慮組比較，AMI組、焦慮組及中藥組的水平和垂直運動得分均升高。見表2，圖2。

2.2.2 高架十字迷宮實驗 與假手術(shù)組比較，AMI組及焦慮組小鼠的開放臂進入次數(shù)和停留時間均減少。與AMI+焦慮組比較，AMI組及中藥組的OE%增加、OT%延長，焦慮組僅OT%延長。如表2、圖3所示。

2.3 心肌梗死邊緣區(qū)HE和Masson染色

2.3.1 HE染色 假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)著色均勻。焦慮組心肌細胞排列與假手術(shù)組比較有所紊亂，細胞間隙輕度增寬;AMI組心肌細胞排列明顯紊亂，核固縮或碎裂，心肌纖維溶解斷裂;AMI+焦慮組心肌細胞損傷程度更大，心肌纖維斷裂進一步加重。與AMI+焦慮組比較，中藥組心肌細胞損傷程度有所減輕，心肌纖維排列較為整齊。見圖4。

2.3.2 Masson染色 心肌細胞與膠原纖維分別呈紅染、藍染。假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，無明顯膠原纖維增生。焦慮組心肌細胞較假手術(shù)組排列輕度紊亂，藍染膠原纖維也不明顯;AMI組心肌細胞排列松散紊亂，可見大量膠原纖維;AMI+焦慮組心肌細胞排列紊亂程度更大，藍染膠原纖維量更多。中藥組心肌細胞排列紊亂程度比AMI+焦慮組較輕，膠原纖維含量有所減少。見圖5。

2.4 各組血清ACTH及CORT含量 與假手術(shù)組比較，焦慮組小鼠血清ACTH和CORT含量升高;AMI組僅ACTH含量增多。與AMI+焦慮組比較，AMI組、焦慮組及中藥組小鼠的血清ACTH和CORT含量均降低。見表3，圖6～7。

3 討論

焦慮與AMI可相互影響，共同促進AMI合并焦慮的不良預(yù)后。本研究心臟彩超、行為學(xué)及心肌病理染色結(jié)果證實，焦慮可以加重AMI小鼠的心肌損傷程度，反過來AMI術(shù)產(chǎn)生的心肌損傷也會加重小鼠的焦慮程度。進一步地，比較于單純焦慮組、AMI組，AMI合并焦慮組小鼠的心功能最差、焦慮程度最高。因此，明確AMI合并焦慮的共病機制并予以有效干預(yù)十分重要。

《傷寒論》第106條曰：“傷寒八九日，下之，胸滿煩驚，小便不利，譫語，一身盡重，不可轉(zhuǎn)側(cè)者，柴胡加龍骨牡蠣湯主之”。其中“煩驚”“譫語”類似于焦慮癥狀，“胸滿”“小便不利”“一身盡重，不可轉(zhuǎn)側(cè)”則與冠心病癥狀相似。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)前柴胡加龍骨牡蠣湯被廣泛應(yīng)用于精神情志類疾病治療，高達39.08%，其次為神經(jīng)系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)類疾病，分別占16.09%、10.34%[7]，能明顯緩解焦慮抑郁程度，減輕心肌損傷[8-9]。團隊前期研究也表明柴胡加龍骨牡蠣湯可明顯改善冠心病合并焦慮狀態(tài)患者的焦慮狀態(tài)和心功能，發(fā)揮解郁理氣、活血安神的功效，其作用機制可能與促進體內(nèi)外骨髓間充質(zhì)干細胞循環(huán)、調(diào)節(jié)腸道菌群、減輕炎性反應(yīng)、抑制血小板活化、增加心率變異性等有關(guān)[10-13]。

HPA軸功能與人體應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系十分密切。下丘腦可在人體受到應(yīng)激時釋放腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子CRF，后者可進一步刺激垂體前葉、腎上腺皮質(zhì)分泌ACTH、CORT;而CORT和ACTH又能負反饋作用于CRF，以調(diào)節(jié)HPA軸功能[14]。當(dāng)人體受到持續(xù)性刺激時，HPA軸過度活化，ACTH和CORT分泌顯著增多，促使交感神經(jīng)興奮性增強，心率加快，心率變異性降低，而炎性反應(yīng)及血小板活性、血管收縮力均增強，引發(fā)血管內(nèi)皮受損，繼而導(dǎo)致冠心病發(fā)生風(fēng)險增強;同時，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，海馬神經(jīng)元受損，也促進了情緒障礙的發(fā)生發(fā)展[15-19]。因此，減輕應(yīng)激反應(yīng)，降低HPA的亢奮程度，能有效緩解焦慮狀態(tài)和AMI后心肌損傷情況，改善AMI合并焦慮的預(yù)后。有報道更進一步指出，皮質(zhì)醇檢測可能會被納入常規(guī)檢測，來評估人們的焦慮及冠心病風(fēng)險，并成為緩解焦慮及降低冠心病發(fā)病率的靶標(biāo)之一[20]。

血清中ACTH和CORT的水平可直接反應(yīng)HPA軸的功能狀態(tài)。已有研究表明，AMI后抑郁大鼠血清中ACTH、CORT水平均明顯升高[21]。本研究中各組小鼠血清ACTH和CORT的含量變化表明，AMI可加重焦慮小鼠HPA軸亢進的程度，反過來焦慮也可加重AMI小鼠HPA軸亢進的程度;同時柴胡龍骨牡蠣湯可減輕AMI合并焦慮小鼠的HPA軸亢進程度。由此表明，HPA軸亢進是AMI與焦慮共病的機制之一，而柴胡龍骨牡蠣湯可能是通過抑制HPA軸中ACTH和CORT含量的升高，進而發(fā)揮抗焦慮、改善AMI預(yù)后的療效。本研究僅觀察柴胡龍骨牡蠣湯對AMI合并焦慮小鼠行為及部分激素含量的影響，而中藥具有多靶點效應(yīng)，加之冠心病與焦慮的共病機制十分復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚不明確，因此柴胡加龍骨牡蠣湯的更多作用機制還有待進一步的研究探索。

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（2019-08-16收稿 責(zé)任編輯：王明）